Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

O objetivo geral deste procedimento é obter culturas puras de astrócitos isolando e cultivando células corticais mistas de filhotes de camundongos P um a P quatro. Isso é feito primeiro colhendo córtices cerebrais de filhotes de camundongos e removendo as meninges. O segundo passo é cortar o córtex em pequenos pedaços, dissociar os pedaços do córtex por tripsina e tação para obter células únicas e colocar as células individuais em frascos de cultura de tecidos revestidos com poli de licina.

Em seguida, após sete a oito dias, astrócitos, micróglias e oligodendrócitos terão formado diferentes camadas e a separação dos astrócitos da micróglia e dos oligodendrócitos é obtida agitando o frasco de cultura de tecidos em um agitador orbital. A etapa final é a ionização e a colheita dos astrócitos restantes, que são então replaqueados em um frasco de cultura de tecidos. Em última análise, 12 a 14 dias após a primeira divisão celular, os astrócitos são plaqueados na concentração apropriada para experimentos e a pureza celular pode ser examinada por imunocitoquímica usando marcadores específicos de astrócitos.

O método descrito aqui é baseado na preparação da cultura de astrócitos a partir de cérebros neonatais de roedores originalmente descritos por McCarthy e desenvolvidos em 1980. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como questões relacionadas à interação entre osteócitos e neurônios, bem como o papel dos osteócitos em certas doenças S, onde os osteócitos são ativados e contribuem para a formação de cicatrizes inibitórias. A demonstração visual deste método é útil para jovens cientistas apontarem as etapas críticas do método de isolamento e visualizarem a morfologia astrocítica durante as diferentes etapas do procedimento de isolamento para garantir culturas de astrócitos puras e saudáveis.

A demonstração deste procedimento será feita por dois alunos de pós-graduação do meu laboratório, Sebastian Hilker e Khristian Bora Antes de iniciar este procedimento, certifique-se de que todos os reagentes de cultura de tecidos e reagentes e materiais de dissecção sejam preparados com antecedência de acordo com as instruções do protocolo escrito. Depois de sacrificar um filhote de camundongo P um para P quatro, faça uma incisão na linha média posterior a anterior ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio, corte cuidadosamente o crânio do pescoço ao nariz e, em seguida, faça um corte anterior ao bulbo olfatório e outro inferior ao cerebelo. Para desconectar o crânio da base do crânio, use uma pinça de ponta plana para virar suavemente as abas cranianas para um lado.

Em seguida, corte os bulbos olfativos e o cerebelo e, em seguida, retire o cérebro. Deposite o cérebro em um prato de HBSS gelado e coloque no gelo. Agora repita o procedimento para colher os cérebros de mais três animais.

Quatro cérebros fornecerão astrócitos suficientes para semear um frasco de cultura de tecidos T 75 na densidade adequada. Depois que todos os cérebros forem colhidos, transfira o prato que contém os cérebros para um microscópio estéreo. Em seguida, para isolar os córtices, pegue a extremidade posterior de cada cérebro com uma pinça fina e faça uma incisão na linha média entre os hemisférios.

Em seguida, insira um segundo conjunto de pinças no sulco criado e retire a estrutura semelhante a uma placa do córtex do resto do cérebro. Depois que todos os córtices forem isolados, retire cuidadosamente as meninges do córtex puxando com a pinça fina. Esta etapa evita a contaminação da cultura final de astrócitos por células meníngeas e fibroblastos.

Transfira os hemisférios corticais preparados para um segundo prato cheio de HBSS resfriado e coloque no gelo. Continue de acordo com todos os quatro córtices. Finalmente, corte cada hemisfério em quatro a oito pedaços pequenos usando lâminas afiadas em condições estéreis.

Transfira os pedaços de córtex para um tubo de falcão de 50 mililitros e adicione HBSS a um volume final de 22,5 mililitros. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de 2,5% de viagens. Substitua a mistura da tampa e incube o tecido no banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Misture agitando a cada 10 minutos. Em seguida, após a centrifusão por cinco minutos a 300 vezes G para pellet. Os pedaços de tecido do córtex decantam cuidadosamente o sobrenadante S.

Adicione 10 mililitros de meio de plaqueamento de astrócitos ao pellet e use uma pipeta de 10 mililitros para pipetar vigorosamente o meio contendo o tecido para cima e para baixo 20 a 30 vezes até que uma única suspensão celular seja obtida. Em seguida, adicione o meio de plaqueamento de astrócitos a um volume final de 20 mililitros e conte as células usando um hemo ou contador de células automatizado. De acordo com os procedimentos padrão, uma preparação de quatro córtices de filhotes de camundongo deve render de 10 a 15 vezes 10 para as seis células individuais dissociadas.

Por fim, aspirar a poli de licina de um balão previamente preparado e transferir a suspensão de células dissociadas para o balão. Incube a cultura a 37 graus Celsius na incubadora de cultura de tecidos por dois dias e, em seguida, troque o meio. A mídia deve ser trocada a cada três dias.

Depois disso, os astrócitos devem aparecer complementados com uma camada sobreposta de micróglia após sete a oito dias em cultura. Neste ponto, coloque o frasco T 75 em um agitador orbital ajustado em 180 rotações por minuto por 30 minutos para remover a micróglia, descarte o supinato contendo microglia ou gire-o para baixo e placa para cultura. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio de cultura de astrócitos frescos e continue agitando o frasco a 240 RPM por seis horas para remover as células precursoras de oligodendrócitos.

Como alguns OPCs não se desprendem completamente da camada de astrócitos, continue a agitar vigorosamente com a mão por um minuto. Para evitar a contaminação por OPC, novamente, descarte o supinato ou gire-o na placa para cultivar seus OPCs. Enxágue a camada de astrócitos confluente restante duas vezes com PBS, aspire o PBS e adicione cinco mililitros de viagens em EDTA na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius.

Verifique o desprendimento de astrócitos a cada cinco minutos e reforce o desprendimento de astrócitos batendo o frasco contra a palma da sua mão duas a três vezes. Assim que os astrócitos se separarem do frasco, adicione cinco mililitros de meio de cultura de astrócitos. Gire as células a 180 vezes G por cinco minutos, aspire o supinato e adicione 40 mililitros de placas de astrócitos frescos. Média.

Um frasco T 75 de células corticais mistas deve produzir cerca de um centavo de tempo das seis células enriquecidas para astrócitos após a primeira placa de passagem das células em dois frascos de cultura T 75 e incubar 37 graus Celsius na incubadora de cultura de tecidos. Troque o meio a cada dois ou três dias, 12 a 14 dias após a primeira placa de massagem, os astrócitos na concentração celular apropriada 24 a 48 horas antes de realizar o experimento. Um frasco de cultura de tecidos T 75 deve render cerca de 1,5 a duas vezes 10 para as seis células após a segunda divisão.

Esta imagem mostra células corticais mistas um dia após o plaqueamento. As setas pretas indicam astrócitos presos ao fundo do frasco. Neurônios moribundos podem ser vistos flutuando no supinado três dias após o plaqueamento de células corticais mistas.

A camada de astrócitos está se formando conforme indicado pelas setas pretas e os neurônios estão quase ausentes. A mesma cultura cortical mista é vista aqui cinco dias após o revestimento. A primeira micróglia e OPCs no topo de uma camada de astrócitos são aparentes, conforme indicado pelas setas pretas, como visto aqui.

A camada de astrócitos é completamente confluente sete dias após o plaqueamento de células corticais mistas. Esta imagem mostra a cultura de astrócitos enriquecida. Dois dias após a divisão.

As células anexadas mostram morfologia de astrócitos com baixa densidade. Aqui, as áreas indicam células únicas. Duas semanas depois, a camada de astrócitos atingiu alta densidade.

A barra de escala representa 10 mícrons. Esta imagem demonstra a pureza das culturas de astrócitos. Cada painel mostra células que foram imunomarcadas para os marcadores de astrócitos, G-F-A-P-G-L-A-S-T-S 100 B Aquaporina quatro A LDH, um L um e BLBP mostrado em verde.

Os núcleos são revelados por uma contracoloração DAPI. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar astrócitos corticais. O isolamento e a cultura de astrócitos corticais descritos neste protocolo fornecem uma ferramenta poderosa para investigar a biologia dos astrócitos.

Uma vez que sua capacidade de gerenciamento em diversas aplicações pode completar muito sua investigação in vivo.