Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar técnicas para encapsular células em seus hidrogéis fotopolimerizados, bem como a recuperação subsequente do pH das células beta formadas naturalmente a partir dos hidrogéis sensíveis a enzimas da caracterização biológica. Isso é feito misturando primeiro as seis células beta com um pino de antebraço, macer norbertina e um reticulador de peptídeo sensível a enzimas. As células são então encapsuladas usando radicais livres mediados e fotopolimerizações para formar um hidrogel.

O segundo passo é cultivar células encapsuladas em seus hidrogéis em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Depois que as células proliferaram para formar agregados, os hidrogéis carregados de células são enxaguados com solução tampão e, em seguida, incubados em solução de tripsina de chia. Sob agitação suave para erosão em gel, os agregados recuperados são cuidadosamente lavados para remover a solução enzimática e o polímero erodido.

Em última análise, esses agregados celulares podem ser usados para análise estrutural e funcional. Portanto, a principal vantagem do crescimento em etapas e da fotoquímica é que suas condições de reação são mais suaves do que o crescimento tradicional em cadeia PEG dde. Portanto, os hidrogéis fornecem um excelente microambiente para muitos tipos de células, incluindo células beta pancreáticas.

A implicação dessa técnica se estende a várias terapias baseadas em células, pois esse sistema DIN fornece um excelente microambiente para experimentos in vitro e uma ótima plataforma para entrega celular. Enquanto sintetizamos os peptídeos usados nesses experimentos em nosso laboratório, existem muitas empresas das quais os reticuladores de peptídeos que descrevemos podem ser obtidos. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de 20% PEG quatro NB em vórtice PBS a mistura até que o rimer se dissolva completamente.

Em seguida, passe a solução de Kermer por um filtro de seringa para esterilizá-la e armazene Eloqua a menos 20 graus Celsius até que seja necessário. Em seguida, prepare uma solução a 2% do fosfonato de arol de lítio fotoiniciador em PBS. Passe a solução fotoiniciadora por um filtro de seringa e guarde a solução esterilizada em temperatura ambiente protegida da luz.

Outra etapa preparatória é dissolver o reticulador de peptídeo sensível à crisina em PBS e filtrar a solução para esterilização. Alíquotas extras são armazenadas a menos 20 graus Celsius. Determine a concentração do grupo Sulf hydro na solução peptídica preparada usando o reagente de Elman de acordo com o protocolo do fabricante.

Em seguida, prepare os moldes cortando a parte superior de um centímetro das seringas descartáveis estéreis de um mililitro. Usando uma lâmina de barbear, esterilizou novamente os moldes da seringa. Usando uma autoclave, prepare uma planilha contendo cálculos da formulação de gel desejada, incluindo volume e concentração de materiais de estoque, incluindo peptídeo polimérico, reticulador, fotoiniciador e soluções tampão.

Primeira cultura de células pré-quentes, solução salina balanceada de Hank médio e duas viagens x em EDTA a 37 graus Celsius. Em seguida, remova frascos de no mínimo seis células beta da incubadora e coloque-os na capela de fluxo laminar. Depois de aspirar os meios de cultura de células dos frascos, enxágue as células com tanques pré-aquecidos e equilibre a solução salina.

Em seguida, tente congelar as células usando três mililitros de pré-aquecimento, duas viagens em EDTA e incubar os frascos por quatro minutos. Após a incubação, bata suavemente os frascos na superfície do capô para separar completamente as células. Confirme o descolamento e a dissociação das células ao microscópio.

Em seguida, adicione um volume igual de meio de cultura de células. Para neutralizar a tripsina, misture bem a solução pipetando suavemente para cima e para baixo. Em seguida, transfira a mistura para um tubo cônico estéril, centrifugue a suspensão celular por cinco minutos a 200 RCF após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em quatro a cinco mililitros de cultura pré-quente. Mídia.

Finalmente, determine a densidade celular misturando parte da suspensão celular com azul triano de 50% e contando as células com um hemocitômetro. Quando as células estiverem prontas, misture os volumes necessários de iniciador fotográfico reticulador de peptídeos PEG quatro e B em uma concentração final de células milimolares e HBSS em um tubo de microcentrífuga com base em uma proporção de TH para EEN de um para um e misture suavemente por pipetagem. Um 4% PEG quatro e B é usado nesta demonstração.

Em seguida, pipete 25 microlitros da solução resultante em cada molde de seringa. Exponha os moldes da seringa à luz UV de 365 nanômetros a uma potência de cinco miliwatts por centímetro quadrado por dois minutos. Para polimerizar o gel após a fotopolimerização, mergulhe os géis em uma placa estéril de 24 poços contendo um mililitro de meio de cultura de células e incube os hidrogéis a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos para enxaguar quaisquer células frouxamente aderidas ou macros não reticuladas.

Após 30 minutos, retire a placa da incubadora e transfira os géis para um mililitro de meio fresco. Atualize a mídia a cada dois ou três dias. Prepare um miligrama por mililitro de solução enzimática adicionando Hanks solução salina balanceada à tripsina alfa quimi livre de tripsina.

Em seguida, esterilize a mistura com um filtro de seringa. Em seguida, remova a placa de cultura da incubadora e enxágue os géis com a solução de sal de equilíbrio de Hank. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de tripsina de carrilhão a cada poço em seguida, incube a temperatura ambiente com agitação suave em um agitador por aproximadamente cinco a 10 minutos para que a erosão completa do gel seja alcançada.

Quando o gel estiver completamente dissociado, coloque a placa no gelo por alguns minutos para reduzir a atividade da tripsina CH. O próximo passo é transferir a suspensão celular para um tubo de um mililitro e centrifugar lentamente a 45 RCF e quatro graus Celsius por dois minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta PEI e suspenda suavemente o esteróide na solução salina de equilíbrio de Hank.

Em seguida, transfira a solução de esteróide recuperada para uma nova placa de 24 poços e coloque a placa no gelo por cinco a 10 minutos para permitir que o esteróide assente e se prenda à superfície para análise de tamanho. Adquira imagens de contraste de fase dos esferóides estabelecidos usando um microscópio de luz meça os diâmetros dos esferóides recuperados usando software como o software de elemento Nikon ou a imagem J. Este método de encapsulamento garante alta viabilidade celular inicial, conforme quantificado pela coloração de mortos vivos. Com o tempo em cultura de células, o metabolismo celular medido por alamar, os reagentes azuis aumentaram ao longo de um período de 10 dias em todas as concentrações estudadas.

Após 10 dias em cultura celular, os esteróides aumentaram de tamanho e ainda mantiveram alta viabilidade celular. Nos hidrogéis, o hidrogel peptídico PEG suportou a sobrevivência e proliferação de células beta encapsuladas, mostradas aqui após 10 dias em cultura, em recuperação somática com alfa quimim tripsina libera os esteróides da matriz do hidrogel, produzindo uma distribuição estreita de tamanhos de esteróides que são independentes da concentração da matriz. Esses esteróides podem então ser usados para caracterizações e aplicações adicionais ao tentar este procedimento.

É importante manter a homogeneidade na solução pré-polimérica durante o encapsulamento para garantir que as células estejam bem distribuídas. Após este procedimento, as células recuperadas podem ser caracterizadas usando outras técnicas, como coloração imunológica de montagem inteira e western blot, a fim de estudar o efeito da condição da matriz de hidrogel na expressão e fenótipo da proteína celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como encapsular células em hidrogéis, bem como recuperar as células dos géis para caracterizações biológicas adicionais.