Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

O objetivo geral do experimento a seguir é rastrear modificadores de melanoma usando um modelo de tumor autógeno de peixe-zebra. Isso é conseguido criando animais transgênicos nos quais os melanócitos expressam um gene de interesse e os peixes são predispostos ao melanoma. O próximo início do melanoma é pontuado para avaliar se o gene de interesse altera a iniciação do tumor.

Em seguida, a invasão do tumor e os ensaios específicos de células são realizados para determinar qualquer impacto adicional do gene de interesse em melanomas e melanócitos pré-malignos. Finalmente, as células de melanoma são transplantadas para medir como o gene de interesse afeta a frequência de células iniciadoras de melanoma em tumores estabelecidos. Os resultados mostram como um gene candidato afeta várias propriedades de melanócitos e melanomas, incluindo invasão de início e capacidade de transplante.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a transgênese da linha germinativa, para pesquisar genes candidatos ao câncer é que tempo, esforço e despesas são economizados, e o rendimento é aumentado pelo ensaio. Vários aspectos da tumorgênese em animais transgênicos de carrilhão Demonstrando este procedimento será sherania agar, um estudante de pós-graduação em meu laboratório Para gerar construções para injetar. Comece criando clones de entrada intermediária por PCR, amplificando o quadro de leitura aberto de comprimento total dos genes de interesse e recombinando em P don R 2 21.

Em seguida, use a tecnologia de gateway multi-site para recombinar o gene promotor mifa específico do melanócito de interesse e o sinal de poliadenilação no vetor mini Cooper para colocar genes de interesse sob o controle do promotor mifa injetar 25 picogramas de cada clone, juntamente com 25 picogramas de TOL dois mRNA transpostos em uma célula embriões de peixe-zebra homozigotos triplos transgênicos. Mifa BRAF FP 53. Animais mutantes são deficientes em melanócitos e propensos à transformação e formação de melanoma.

Junto com o gene de interesse. O mini vetor de Cooper contém um minigene MVA de resgate. Assim, os animais injetados com sucesso desenvolverão melanócitos resgatados, que expressam o gene de interesse.

Incube os embriões injetados a 28,5 graus Celsius 24 horas após a fertilização ou HPF. Remova todos os embriões mortos 72 horas após a fertilização usando um microscópio de dissecação sob luz incidente contra um fundo branco. Selecione animais transgênicos com melanócitos resgatados.

Quando os animais atingirem quatro dias após a fertilização, transfira-os para tanques de três litros no viveiro da instalação do peixe-zebra. Aos dois meses de idade, selecionar os animais com pelo menos uma área de resgate de melanócitos maior que quatro milímetros quadrados. Rastreie os animais selecionados semanalmente quanto à presença de tumores.

Isole animais portadores de tumor para estudo. Desenhe curvas de sobrevida livre de melanoma com a idade em semanas no absa e a porcentagem de sobrevida livre de melanoma na ordenada. Compare animais com melanócitos que expressam um gene de interesse para controlar animais que expressam EGFP e melanócitos.

Use um teste de log rank para determinar se as duas curvas são estatisticamente diferentes. Para realizar um ensaio de invasão tumoral. Comece selecionando peixes-zebra isolados que desenvolvem tumores dorsalmente em uma região entre o limite posterior do cérebro posterior e a borda anterior da barbatana dorsal.

Duas semanas após o início do melanoma, use trica para sacrificar o peixe após fixar e incorporar o peixe em parafina. Faça cortes transversais de cinco micrômetros através das lesões. Um. A cada 50 micrômetros, corta toda a lesão para que o ponto de invasão mais profunda possa ser identificado.

Use hematin e eoin para manchar as seções. Avalie a invasão tumoral medindo se as células tumorais permanecem fora do estrato colágeno, invadem a musculatura dorsal ou invadem ainda mais a coluna vertebral. Determine a diferença estatística entre os dois conjuntos de amostras para realizar a imunocoloração.

Anestesiar os peixes em 0,17 miligramas por mililitro de trica com luz incidente sob um microscópio de dissecação. Use pinças afiadas de ponta fina para arrancar escamas dorsais. Tomando cuidado para não danificar o melanócito que contém metade da escama.

Coloque as escamas diretamente da pinça em um mililitro de fixador e incube em temperatura ambiente, girando por mais ou igual a duas horas. Transfira o peixe para a água do peixe e monitore o peixe para confirmar a recuperação bem-sucedida dos melanócitos pigmentados branqueados. Primeiro lave as balanças fixas em PBST duas vezes por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um mililitro de solução de alvejante recém-feita e cubra com parfum ou cap locks para evitar que o gás estoure os tubos. Continue descolorindo até que o pigmento desapareça. Em seguida, lave em PBST quatro vezes a cada cinco minutos em temperatura ambiente.

Incubar por pelo menos 30 minutos em solução em bloco, depois incubar com cerca de 400 microlitros de anticorpo primário e solução em bloco durante a noite Em temperatura ambiente no dia seguinte, lave as escamas três vezes por 30 minutos em PBS em temperatura ambiente, incube com anticorpo secundário por duas horas durante a noite em temperatura ambiente. Depois de ficar com dpi, aplique uma gota de escudo vetorial em uma lâmina de vidro e monte as escamas de forma que o lado côncavo das escamas fique voltado para baixo contra a lâmina. Coloque uma lamínula de vidro sobre as amostras.

Use esmalte transparente para selar as bordas e observe as lâminas sob um microscópio fluorescente. Após um receptor radiante, peixes Casper de dois a três meses de idade com 25 cinzas de irradiação gama um dia antes do transplante. Deixe o peixe se recuperar na água dos peixes.

Use trica para sacrificar um peixe portador de tumor, corte o tumor e coloque-o em uma placa de Petri com aproximadamente cinco mililitros de filtro esterilizado 0,9 XPBS com 5% FBS com uma navalha para cortar o tumor enquanto em solução trabalhando em temperatura ambiente e com uma pipeta P 1000 iterar para produzir células únicas. Aumente o volume para 25 mililitros. Filtrar a solução através de um filtro de malha de 40 micrómetros e centrifugar numa centrifugadora de mesa a 453 RCF durante 10 minutos.

Suspenda novamente o pellet em 0,9% PBS 5% FBS até a concentração desejada. Usando um hemocitômetro, calcule o número exato de células e dilua a suspensão celular de modo que o volume final da injeção seja de aproximadamente cinco microlitros. Por exemplo, se forem injectadas 50 000 células, a suspensão celular deve ser diluída até uma concentração final de 10 000 células por microlitro.

Agite o tubo que contém a suspensão celular a cada poucos minutos para evitar a aglomeração das células com 100% de etanol e 0,9 XPBS. Lave uma seringa Hamilton de calibre 26 s 7, 0, 1 e 10 microlitros duas a três vezes antes de carregar a seringa com cinco microlitros da suspensão celular. Depois de anestesiar o peixe receptor irradiado in trica, coloque-o de lado em um lenço umedecido Kim.

Estabilize o peixe com uma mão e insira a agulha com o chanfro voltado para cima em um ângulo de 45 graus no flanco do peixe acima da cavidade peritoneal. A meio caminho entre o limite posterior do rombencéfalo e a borda anterior da barbatana dorsal. Pressione suavemente o êmbolo.

Permita que os peixes se recuperem em água doce e observe os peixes diariamente quanto ao enxerto de tumor. Se o enxerto ocorreu, o crescimento contínuo e o desenvolvimento da doença também podem ser observados. Embriões de peixe-zebra BRAF FP 53 MIFA de uma célula foram injetados com o vetor mini Cooper contendo o conjunto de oncogenes de melanoma DB one ou EGFP cada um sob o controle do promotor MFA, conforme mostrado aqui.

As curvas de incidência de tumor para os adultos revelaram que o SET DB um acelerou significativamente o início do melanoma em comparação com o controle EGFP como visto aqui, a coloração de hematina e EOSINA mostra que os melanomas que expressam SET DB um eram mais localmente invasivos do que os melanomas de controle EGFP. Esta figura mostra escamas dorsais de peixe-zebra branqueadas ou não branqueadas que foram coradas com um anticorpo que reconhece o fator de transcrição mifa localizado no núcleo para avaliar a capacidade de transplante do tumor. Células de melanoma foram isoladas de um peixe BRAF FP 53 mifa injetado com mini xícara R-E-G-F-P 50.000 células foram injetadas por via subcutânea em um receptor Casper mutante que havia sido irradiado no dia anterior com 25 cinzas, como pode ser visto aqui com duas semanas de idade.

As células pigmentadas derivadas de doadores foram facilmente reconhecidas. Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer estudarem as consequências funcionais das alterações genéticas associadas ao melanoma usando o peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear modificadores de melanoma por ensaio, diferenças na invasão do início do tumor, expressão gênica e capacidade de transplante usando um modelo de tumor automático de peixe-zebra.