Métodos experimentais para testar os efeitos de Peptide Neurotrophic, ADNF-9, contra a apoptose induzida pelo álcool durante a gravidez em camundongos C57BL / 6

O objetivo deste procedimento é avaliar os efeitos neuroprotetores dos peptídeos tróficos em um modelo fetal de exposição ao álcool. Isso é conseguido primeiro acasalando os animais experimentais e, em seguida, tratando as fêmeas grávidas com peptídeos tróficos como uma segunda etapa, os fetos são dissecados para isolar os cérebros fetais para usos experimentais. Em seguida, os cérebros fetais são incluídos em gelatina para secção, seguida de coloração em túnel para determinar os resultados da morte celular.

Isso mostra que a exposição pré-natal ao álcool aumenta o número de células positivas para túnel na eminência ganglionar. Em comparação com a administração do peptídeo trófico no grupo controle, a nove D e F reduziram significativamente o aumento induzido pelo álcool nas células positivas do túnel em comparação com os animais tratados com álcool controle. Portanto, a demonstração visual desse metal é crítica, pois a dissecação do cérebro fetal e as etapas incorporadas são difíceis de aprender porque os cérebros fetais são muito pequenos para dissecar e processar o seccionamento de camundongos pretos de primeira raça C 57, colocando camundongos fêmeas de seis semanas de cerca de 20 gramas em gaiolas domésticas masculinas por duas horas imediatamente após a remoção.

Verifique cada fêmea quanto à presença de um tampão de esperma para confirmar se o acasalamento ocorreu. Se um tampão de esperma estiver presente, designe este dia embrionário zero em E sete pesos correspondem a fêmeas grávidas em quatro grupos. Um grupo de dieta líquida alcoólica forneceu acesso gratuito como única fonte de nutrientes.

Dois grupos de controle Perfed grupo de tratamento com três peptídeos, que deve receber injeção intraperitoneal de um peptídeo DNF nove juntamente com a exposição ao álcool. Dieta líquida. Registre o volume de dieta líquida consumida pelos animais em 24 horas a partir de tubos de tampa de rosca graduada de 30 mililitros para determinar a quantidade diária de álcool, dieta líquida ou dieta líquida emparelhada que pode ser fornecida por meio de um excesso livre como única fonte de nutrientes.

Certifique-se de que a dieta líquida recém-preparada seja fornecida diariamente de E sete a E 13 após sacrificar a grávida Myer E 13 por eutanásia de dióxido de carbono, seguida de luxação cervical. Colocar a carcaça sobre a placa de dissecação em decúbito dorsal e limpar o abdómen com etanol a 70%. Use tesouras e fórceps estéreis para fazer uma incisão abdominal.

Uma vez que o abdômen esteja aberto, segure o útero com uma pinça e use uma segunda pinça para arrancar lenta e suavemente o endométrio do útero sem perfurar os embriões. Remova cuidadosamente os embriões do útero e transfira-os para a solução de classificação de equilíbrio de Hank Em uma placa de cultura de células de 60 milímetros por 15 mililitros em gelo úmido, coloque a placa e o recipiente de gelo no palco de um microscópio estéreo usando uma pinça ultrafina para microdissecção. Retire a pele dos embriões na parte superior da cabeça para expor o crânio.

Uma vez que o crânio esteja exposto e claramente visualizado sob o microscópio estéreo, segure a base do crânio no nível da medula espinhal e do tronco cerebral com uma pinça e comece a descascar o crânio. Continue descascando o crânio pedaço por pedaço das partes posterior para anterior da cabeça. Quando o cérebro estiver totalmente exposto, use uma pinça para extraí-lo.

Em seguida, disseque o cérebro fetal da base do bulbo primordial ou de fábrica até a base do Met Postfix todos os cérebros fetais dissecados em 4% de paraldeído por dois a três dias. Os cérebros fetais também podem ser congelados se forem testados para western blot ou ensaios enzimáticos. Depois de preparar uma solução a 10% de gelatina de grau A preparada em água destilada, encha um molde de incorporação até a metade e espere até que a gelatina solidifique.

Coloque os cérebros fetais de controle e tratados no pré-natal lado a lado em cima da gelatina solidificada. Isso é para manter condições consistentes entre os grupos controle e experimental. Certifique-se de que a gelatina não esteja muito quente e adicione gelatina líquida em cima do cérebro fetal para fazer um molde completo.

O molde final deve se assemelhar a esta imagem, refrigerar o molde de gelatina preparado que contém o cérebro fetal por 15 minutos. Em seguida, retire o plástico do molde de incorporação. O molde final deve ficar assim e, em seguida, transferir a gelatina contendo cérebros fetais para 4% de paraldeído por dois dias.

No terceiro dia, anexe o bloco de gelatina contendo cérebros fetais fixos ao estágio do viome. Em seguida, corte os cérebros usando um vioma com espessura de 25 a 50 mícrons para corte coronal. Colete as seções do cérebro fetal em PBS e, em seguida, monte as seções do cérebro fetal em super geadas e lâminas na água e deixe-as secar por 15 minutos.

Após 15 minutos. Coloque as lâminas no PBS para teste de reação do túnel no dia seguinte. Primeiro, mergulhe as lâminas em uma solução de 20 microgramas por mililitro de proteinase K e PBS por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, enxágue três vezes em PBS por cinco minutos cada em um agitador orbital. Incubar as seções com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitar. Em seguida, lave as lâminas como antes.

Em seguida, incube as seções em solução permeável por dois minutos no gelo. Após a incubação, lave duas vezes em PBS. Como antes, use um tecido de laboratório para secar a área da lâmina ao redor das seções.

Em seguida, use uma caneta para desenhar ao redor das seções do slide. Isso evita o vazamento da solução de coloração, permitindo assim que um pequeno volume seja usado. Incubar uma secção em cada par com uma mistura de reacção em túnel preparada de acordo com as instruções do fabricante.

Adicione uma solução de transporte sem reagente de túnel à seção de controle negativo. Em seguida, incube as lâminas por uma hora a 37 graus Celsius. Decorrido o tempo de incubação, lavar as lâminas três vezes em PBS num agitador orbital, como antes.

Em seguida, seque a área ao redor do tecido com um lenço de laboratório. Em seguida, incubar as seções com a solução POD do conversor por 30 minutos a 37 graus Celsius sem agitar. Em seguida, enxágue as seções três vezes por cinco minutos cada com tris HCL.

Transfira as lâminas para um suporte e coloque-as em um frasco de coplin contendo 0.05% DAB e 0.003% de peróxido de hidrogênio. Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em um agitador orbital no gelo por sete minutos após a incubação, lavando o PBS como antes, se desejar. As lâminas podem ser armazenadas no PBS antes de prosseguir com a coloração do contador de mísseis, conforme detalhado na parte de texto do protocolo.

As imagens a seguir mostram os efeitos do peptídeo neurotrófico, A DNF nove contra a apoptose induzida por álcool usando ensaio de túnel na eminência ganglionar como E 13 estágio pré-natal induzido por exposição ao álcool aumenta a morte celular, conforme indicado pelas pontas de seta no grupo A LC em comparação com o grupo PF. A administração de um D nf nove juntamente com a exposição pré-natal ao álcool induziu uma diminuição nas células positivas do túnel. A análise estatística demonstrou que a administração de AD e F nine preveniu o aumento induzido pelo álcool nas células positivas do túnel.

Os valores são mostrados como médias mais menos o erro padrão da média. Um único asterisco indica um valor de P inferior a 0,052. O asterisco indica um valor de P inferior a 0,01 pelo teste post hoc de Newman Coles.

Cada grupo continha um N de quatro. Então, após o seu desenvolvimento, esta técnica caminho para os pesquisadores e o campo do desenvolvimento do cérebro para explorar os efeitos de drogas ou compostos e desenvolvimento do cérebro em camundongos.