Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações de campo extracelular do prosencéfalo de um peixe-zebra larval intacto. Isso é feito imobilizando primeiro as larvas de peixe-zebra em um bloco de aros. Em seguida, um microeletrodo de gravação é colocado no prosencéfalo sob visualização direta.

A etapa final é registrar a atividade elétrica do prosencéfalo. Em última análise, os resultados podem ser usados para monitorar a atividade anormal de convulsões eletrográficas em larvas intactas de peixe-zebra. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando estava tentando demonstrar que as convulsões poderiam ser provocadas em larvas de peixe-zebra A criação de peixes-zebra segue os procedimentos padrão descritos anteriormente. Brevemente.

O peixe-zebra adulto é instalado em tanques de reprodução com divisórias no lugar. Quando as luzes da sala se acendem na manhã seguinte, as divisórias são removidas e os peixes têm de 20 a 60 minutos de tempo de acasalamento sem perturbações. Os ovos são então coletados dos tanques, transferidos para uma placa de Petri com água de ovo e limpos de detritos com uma pipeta de transferência, agora coloque os ovos em uma incubadora e, em cerca de dois dias, os ovos eclodirão.

Uma vez eclodido, remova o córion e quaisquer outros detritos com uma pipeta de transferência e retorne as larvas à incubadora até que atinjam o ponto de tempo de desenvolvimento desejado. Na preparação, puxe os capilares de vidro de silicato de 1,2 milímetro de diâmetro externo para as agulhas usando um extrator de micropipeta. Armazene as agulhas em uma placa de Petri de 150 milímetros sobre rampas de massa.

Agora embale, carregue o microeletrodo com a solução de cloreto de sódio de dois molares. Usando uma seringa de um litro com um filtro de seringa de quatro milímetros e filamento acoplado, bata no bolo perto da ponta da agulha até que haja poucas ou nenhuma bolha restante. Prepare uma solução fresca de ágar 1,2% LMP em água com ovo e mantenha-a derretida em um banho de 37 graus Celsius.

Em seguida, prepare uma lamínula com a câmara de gravação apropriada e coloque-a no freezer por cinco a 10 minutos. Este exemplo usa uma câmara de imagem de banho de diamante aberta de baixo perfil em uma placa de placa de Petri limpa para submergir um seabra larval, peixe em uma gota de água de ovo usando uma pipeta de transferência. Em seguida, misture uma gota de solução contendo um agente anestésico e paralisante por cinco a 10 minutos.

Monitore o peixe-zebra quanto à perda de movimento. Em seguida, remova a lamínula e a câmara de gravação do freezer. Coloque a câmara no microscópio estéreo stage para a câmara.

Usando uma pipeta de transferência, adicione vários mililitros de agros ao peixe na água e misture-os usando uma ponta de micropipeta ou agulha fina e romba. Posicione as larvas de forma que o aspecto dorsal do peixe fique exposto à superfície do agros. Depois que o agros endurecer, use uma espátula plana para transferir o bloco agro com as larvas para uma câmara de gravação montada em um equipamento de eletrofisiologia.

Na plataforma, adicione de dois a cinco mililitros de mídia de gravação de peixe-zebra à câmara de gravação. Se forem necessárias mudanças no medicamento, perfundir a câmara com uma solução de registro a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto, sem necessidade de oxigenação. Em seguida, insira um microeletrodo no estágio da cabeça do amplificador montado em um micromanipulador tridimensional.

Uma vez carregado, verifique se o manipulador microm tem uma boa amplitude de movimento e ajuste. Em seguida, traga a ponta do microeletrodo para o plano de visão do microscópio bem alto do palco e, usando o ajuste de curso, abaixe-a para um ponto logo acima e ligeiramente à frente da cabeça do peixe-zebra. Com o microeletrodo no lugar, coloque o amplificador no modo de pinça de corrente e zere o eletrodo no campo de view.

Use o ajuste de curso para abaixar a ponta do eletrodo de modo que ela toque levemente a superfície do peixe-zebra na frente do prosencéfalo. Em seguida, com a etapa de ajuste fino, avance a ponta do eletrodo até perfurar a pele do peixe-zebra. Uma vez perfurada, permita que a micropipeta assente lentamente, avance o eletrodo vários mícrons para o prosencéfalo.

Agora use o software aScope para registrar a atividade elétrica. No modo de pinça atual, adquira dados a uma taxa de amostragem de 10 kilohertz. O peixe permanece viável por 24 horas de gravação para aplicar drogas, adicioná-las em volumes de dois a cinco mililitros e esperar de 30 a 45 minutos para que as drogas se difundam através do ágar e no peixe-zebra.

Quatro cérebros. Uma configuração de banho estático é aceitável, tornando desnecessária a perfusão contínua. Usando esses métodos, registros extracelulares também podem ser obtidos do tum óptico.

Descargas eletrográficas semelhantes a convulsões foram registradas no prosencéfalo de oito dias após a fertilização, larvas de peixe-zebra, explosões de pico multis de grande amplitude foram revogadas por uma aplicação de banho de pilocarpina 40 milimolar, uma droga convulsiva. Explosões semelhantes foram produzidas com uma droga convulsiva. Ritoxina aplicada a um milimolar.

Uma descarga espontânea foi observada de um peixe-zebra geneticamente modificado três dias após a fertilização. Neste animal, injeções de morfooligonucleotídeos no estágio de uma a duas células foram usadas para derrubar a expressão de um gene para o complexo de esclerose tuberosa, uma forma pediátrica de epilepsia associada a convulsões e autismo. Se realizado corretamente, este procedimento pode ser concluído em 30 minutos ou menos.