Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish
29 de setembro de 2013
Este protocolo descreve o método de armadilha de genes de mutagénese insercional utilizando Gal4-VP16, como o repórter primário e GFP / RFP como repórteres secundárias em peixes-zebra. Cerca de um em cada dez alta expressar F0 gene rendimento peixe armadilha descendência co-expressando GFP e RFP. O processo de rastreio pode ser facilmente dimensionado para se adaptar ao tamanho do laboratório que realiza o ecrã mutagénese insercional.
O objetivo geral deste procedimento é produzir peixes mutantes usando transposição de quebra de genes em vetores com GAL quatro, VP 16 como o principal repórter da armadilha de genes. Isso é feito primeiro co-injetando o vetor da armadilha genética junto com duas transposições altas em embriões de peixe-zebra. Os embriões injetados são rastreados para fluorescência de GFP três dias após a fertilização e aproximadamente 30% dos embriões mais brilhantes são selecionados para estabelecer o pool F zero.
Em seguida, os peixes F zero são cruzados com a linha de teste U-A-S-M-R-F-P para rastrear a transmissão da linha germinativa de eventos de armadilha de genes. A etapa final é cruzar o F1 para estabelecer a geração F de duas e gerar embriões para caracterização molecular de eventos de armadilhas gênicas por PCR inversa e cinco raças primas. Em última análise, cerca de um em cada 10 peixes F zero rastreados deve produzir progênie de armadilha genética.
A transposição de quebra de genes foi projetada para não produzir mutações após a integração nas entradas dos genes codificadores de proteínas. Nossos vetores GBT usam G quatro P 16 como o principal repórter da armadilha genética. Essa modificação aumenta a sensibilidade para genes expressos em níveis baixos e nos possibilita usar mutantes de armadilha de genes sem evitar fenótipos como G quatro drivers para a expressão específica de tecidos de outros transgenes.
Acreditamos que o principal gargalo de nosso método é alcançar taxas suficientemente altas de integração do gene trapp na linha germinativa de peixes F zero. Nesta demonstração, abordaremos várias etapas críticas, preparação de DNA, MICROINJEÇÃO e triagem F zero. O vetor de armadilha de um gene GBTB usa GAL quatro VP 16 como o principal repórter de armadilha de genes.
Duas transposições altas mínimas nas extremidades são usadas para integração de armadilhas genéticas. Os eventos de armadilha genética são detectados diretamente por um repórter EGFP sob o controle de 14 X GAL quatro UAS. Todo o de armadilha genética é flanqueado por bloqueios diretos P sítios.
Isso torna os eventos de armadilhas gênicas reversíveis pela expressão de pentes Cree para estabelecer a prova de uma relação de causalidade entre uma integração específica de armadilhas gênicas e um fenótipo observado. Além disso, o U-A-S-E-G-F-P é ladeado por locais FRT diretos. A injeção de mRNA de pentes flip levará à excisão do U-A-S-E-G-F-P, deixando a mutação da armadilha gênica não marcada pela fluorescência do EGFP e permitindo seu uso em linhagens transgênicas que marcam tecidos específicos ou eventos de desenvolvimento por fluorescência do GFP antes da microinjeção.
Prepare a transposição no DNA e transponha o mRNA. Prepare o DNA do vetor de armadilha de um gene GBTB. Usando um mini kit de preparação padrão e seguindo o protocolo do fabricante, é essencial incluir a etapa de lavagem do PB ao preparar o DNA.
Caso contrário, o mini DNA de preparação será contaminado por RNAs, A levando à degradação dos transpostos Mr.NA, diluir o DNA em água livre de RNAs a 10 nanogramas por microlitro. Para preparar os dois transpostos altos, o mRNA primeiro linearizou PT três TS T dois usando xbo um. Em seguida, transcreva o DNA linearizado usando uma máquina de mensagens M T três kit de transcrição in vitro com uma modificação.
Adicione 0,5 microlitros de inibidor de RNAs de bloqueio de costela após a etapa de tratamento do DNA, purifique o mRNA usando um kit padrão e avalie a qualidade do mRNA transcrito in vitro por eletroforese em gel agros. Dilua o mRNA em água livre de RNAs a 40 nanogramas por microlitro e armazene como alíquotas de dois microlitros a 80 graus Celsius negativos imediatamente antes da microinjeção. Prepare a mistura de injeção adicionando oito microlitros de transposição diluída no DNA a uma alíquota de dois microlitros de mRNA transposto.
Injete três nanolitros de mistura D-N-A-R-N-A na gema de embriões de peixe-zebra de uma célula usando técnicas padrão de microinjeção visando a interface blasfemadora da gema: Após a injeção, execute cinco microlitros de sobras de solução de injeção em um gel 1%aros para controle de qualidade para garantir que o mRNA transposto não tenha sido degradado cerca de seis a oito horas após a injeção. Remova embriões não fertilizados e mortos e distribua embriões a 60 a 80 por placa de Petri de 100 milímetros. Embriões anormais e mortos são removidos um dia após a fertilização, dois dias após a fertilização e três dias após a fertilização em três dias após a fertilização sob um microscópio estéreo equipado com fluorescência ou um microscópio vertical.
Examine os embriões e remova quaisquer embriões anormais. Examine os embriões restantes sem defeitos evidentes. Para fluorescência GFP, selecione os embriões F zero mais brilhantes e crie-os usando procedimentos padrão de criação de peixe-zebra neste laboratório.
Os GBTs são geralmente injetados em linhas com padrões de pigmentação de tipo selvagem ou leopardo. É razoável esperar que 20 a 30% dos embriões injetados selecionados para criação sobrevivam até a idade adulta. A integração do vetor de armadilha de um gene GBTB pode levar à expressão de EGFP por dois mecanismos diferentes.
O primeiro é um verdadeiro evento de armadilha genética. O vetor integra em um gene um transcrito de fusão entre os cinco primos desse transcrito do gene endógeno e o GAL quatro VP 16 é feito e traduzido em uma proteína de fusão contendo o terminal final da proteína e revestido pelo gene mutado inserido e GAL quatro, VP 16. Esta proteína de fusão se liga ao 14 XUAS e ativa a transcrição do EGFP.
O segundo evento menos desejável é uma armadilha intensificadora. O promotor mínimo na frente do EGFP fica sob o controle de um intensificador próximo ao local de integração, levando à produção de EGFP na ausência de GAL quatro, VP 16. Para distinguir entre essas duas classes de eventos, foi feita uma linha transgênica 14 X-U-A-S-M-R-F-P marcada por GFP cristalina gama específica para lentes.
Os eventos de armadilha gênica são verificados cruzando peixes injetados com GBT com peixes homozigotos U-A-S-M-R-F-P e triagem para co-expressão de GFP e RFP, o que só é possível se GAL quatro, VP 16 for feito e ativar U-A-S-M-R-F-P em trans para iniciar o procedimento de triagem de peixes F zero cruzar o indivíduo F zero com peixes homozigotos U-A-S-M-R-F-P. Uma vez que os peixes injetados com GBT têm padrões de pigmentação de tipo selvagem ou leopardo e a linha homozigótica U-A-S-M-R-F-P está em um fundo de latão, o peixe F zero pode ser facilmente distinguido do peixe U-A-S-M-R-F-P, eliminando a necessidade de registrar se o F zero que está sendo rastreado era um macho ou uma fêmea, bem como erros potenciais resultantes de erros no registro e/ou determinação do sexo de cada peixe. No dia seguinte.
Devolva o peixe U-A-S-M-R-F-P de latão ao tanque. Coloque o peixe F zero que deu embriões em tanques estáticos individuais enquanto os embriões são coletados para triagem, limpeza e transferência de embriões coletados para novas placas de Petri na tarde do dia zero. Rastreie os embriões quanto à fluorescência de GFP e RFP um dia após a fertilização e três dias após a fertilização.
Retire embriões positivos para GFP e RFP classifique-os pelo padrão de expressão GFPPR. Se mais de um padrão for observado em uma embreagem e aumente-os para estabelecer a geração F1. Observe que os embriões 3D PF que são positivos para GFP, mas não para RFP, não são retirados, pois representam eventos de armadilha intensificadora.
Cruze o peixe F zero que produziu a progênie positiva para G-F-P-R-F-P novamente para obter um segundo lote de positivos. Os peixes F1 são rastreados para estabelecer F duas famílias para documentar o padrão de expressão do gene trapp e congelar lotes de embriões para identificação molecular de loci de armadilhas gênicas Primeiro cruze peixes F1 individuais com os peixes homozigotos U-A-S-M-R-F-P no dia seguinte. Coloque os peixes F1 que deram embriões em tanques estáticos individuais enquanto os embriões são coletados para triagem um dia após a fertilização.
A rotulagem de RFP pode não ter surgido ainda, então rastreie os embriões para fluorescência de GFP e retire os embriões positivos para GFP três dias após a fertilização para GFP e fluorescência de RFP e retire os duplos positivos. Em seguida, fotografe os embriões positivos para GFP e RFP cinco dias após a fertilização, congelando lotes de 20 embriões G-F-P-R-F-P positivos e 20 G-F-P-R-F-P negativos para identificação de genes mutantes inseridos por PCR inverso e cinco raças primárias. Crie os embriões positivos restantes para G-F-P-R-F-P para estabelecer a geração F dois em uma injeção bem-sucedida.
Pelo menos 80% dos embriões injetados com a mistura de mRNA de DNA de armadilha genética de dois transpostos exibirão algum grau de fluorescência GFP. A baixa expressão de GFP indica injeção malsucedida ou degradação de RNA transposto devido à contaminação por RNAs. Quando os embriões positivos para GFP mais brilhantes são selecionados para estabelecer o pool F zero, cerca de um em cada 10 peixes F zero selecionados produzirá progênie de armadilha genética entre os peixes F zero dos quais os eventos de armadilha genética são recuperados.
A maioria transmite um único evento de armadilha de genes, além de vários transpostos não expressos em integrações. Uma vez que todo o da armadilha gênica é flanqueado por locais P de bloqueios diretos, quaisquer mutações de armadilha gênica ilustradas neste diagrama com caixas azuis representando éxons do gene mutado são reversíveis pela expressão de pentes CRE. Essas imagens mostram que a co-expressão de GFP e RFP no sistema nervoso da NSF TP seis genes armadilha linha de injeção de RNA Cree em N SF TP seis embriões leva à perda de expressão de GFP e RFP.
Observe que não há redução da expressão de GFP na lente como esperado. A maioria dos procedimentos descritos aqui são aplicáveis a outras telas de armadilhas genéticas, bem como experimentos regulares de transgênese com TOL dois e outros transposons com o procedimento de armadilha de genes descrito aqui. A configuração de cruzamentos de 20 a 30 F zero out por semana deve resultar na recuperação de uma armadilha genética por semana.
No entanto, o procedimento pode ser facilmente ampliado.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método para mutagênese por inserção com armadilha genética em peixes-zebra usando Gal4-VP16 como o principal repórter e GFP/RFP como repórteres secundários. O procedimento permite a identificação de progênie com armadilha genética co-expressando GFP e RFP, com um processo de triagem que pode ser escalado de acordo com o tamanho do laboratório.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
- Modelos Transgênicos
Fundo
- A mutagênese por inserção com armadilha genética é uma técnica usada para criar mutações em genes específicos.
- Gal4-VP16 serve como um repórter sensível para a expressão gênica.
- GFP e RFP são utilizados para visualizar eventos de armadilha genética.
- O método visa minimizar mutações indesejadas durante a integração.
Objetivo do Estudo
- Produzir peixes-zebra mutantes para análise funcional de genes.
- Aumentar a sensibilidade da detecção de expressão gênica.
- Estabelecer um método confiável de triagem para eventos de armadilha genética.
Métodos Utilizados
- Co-injeção de vetores de armadilha genética e mRNA de transposase em embriões de peixe-zebra.
- Triagem para fluorescência GFP três dias após a fertilização.
- Cruzamento de peixes F0 com linhas testadoras U-A-S-M-R-F-P para verificar a transmissão da linha germinativa.
- Cruzamento F1 para estabelecer a geração F2 para caracterização molecular.
Principais Resultados
- Aproximadamente 30% dos embriões mais brilhantes foram selecionados para análise adicional.
- Cerca de um em cada dez peixes F0 produziu progênie com armadilha genética.
- Eventos de armadilha genética foram confirmados através da co-expressão de GFP e RFP.
- Mecanismos de integração foram identificados, incluindo eventos verdadeiros de armadilha genética e armadilha de enhancer.
Conclusões
- O método gera efetivamente mutantes de peixe-zebra para estudos de função gênica.
- Altas taxas de integração de armadilha genética são cruciais para resultados bem-sucedidos.
- Esta abordagem permite a marcação reversível de eventos de armadilha genética para pesquisas adicionais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
