Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é produzir peixes mutantes utilizando transposição com quebra de gene em vetores com GAL4, VP16 como repórter primário de armadilha gênica. Isso é realizado primeiramente pela coinjeção do vetor de armadilha gênica juntamente com a transposase Tol2 em embriões de peixe-zebra. Os embriões injetados são triados quanto à fluorescência de GFP aos três dias pós-fertilização e aproximadamente 30% dos embriões mais brilhantes são selecionados para estabelecer o pool F0.

Em seguida, os peixes F zero são cruzados com a linhagem repórter U-A-S-M-R-F-P para triagem da transmissão pela linhagem germinativa de eventos de aprisionamento gênico. O passo final consiste em cruzar os F1 com indivíduos de linhagem diferente para estabelecer a geração F dois e gerar embriões para caracterização molecular dos eventos de aprisionamento gênico por PCR inversa e RACE a partir da extremidade cinco prima. Em última análise, cerca de um em cada 10 peixes F zero triados deve produzir prole com aprisionamento gênico.

Transposões quebradoras de genes foram projetadas para não produzir mutações ao se integrarem nas regiões iniciais de genes codificadores de proteínas. Nossos vetores GBT utilizam G quatro P 16 como repórter principal de aprisionamento gênico. Essa modificação aumenta a sensibilidade para genes expressos em níveis baixos e torna possível o uso de mutantes por aprisionamento gênico sem superexpressão de fenótipos como drivers G quatro para expressão tecido-específica de outros transgenes.

Acreditamos que o principal gargalo do nosso método está em alcançar taxas suficientemente altas de integração do gene trap na linhagem germinativa de peixes F zero. Nesta demonstração, abordaremos várias etapas críticas: preparação do DNA, MICROINJEÇÃO e triagem de F zero. O vetor de gene trap GBTB um utiliza GAL quatro VP 16 como repórter primário do gene trap.

Extremidades mínimas longas invertidas são usadas para a integração do gene trap. Eventos de gene trap são detectados diretamente por um repórter EGFP sob o controle de 14 X GAL quatro UAS. Todo o cassete de gene trap é delimitado por sítios direct locks P.

Isso torna os eventos de aprisionamento gênico reversíveis pela expressão de Cre, permitindo estabelecer a comprovação de uma relação de causalidade entre uma integração específica de aprisionamento gênico e um fenótipo observado. Além disso, o cassete U-A-S-E-G-F-P é flanqueado por sítios FRT diretos. A injeção de mRNA de Flipase levará à excisão do cassete U-A-S-E-G-F-P, deixando a mutação de aprisionamento gênico sem marcação pela fluorescência de EGFP e permitindo seu uso em linhagens transgênicas que marcam tecidos específicos ou eventos de desenvolvimento pela fluorescência de GFP antes da microinjeção.

Prepare o DNA do transposão e o mRNA do transposão. Prepare o DNA do vetor de armadilha gênica GBTB. Utilizando um kit de mini preparo padrão e seguindo o protocolo do fabricante, é essencial incluir a etapa de lavagem PB ao preparar o DNA.

Do contrário, o DNA do mini prep será contaminado por RNAs, o que leva à degradação do mRNA transcrito. Dilua o DNA em água livre de RNAses até 10 nanogramas por microlitro. Para preparar o mRNA transcrito de alto rendimento, primeiro linearize o vetor PT3TS-T2 com XboI. Em seguida, transcreva o DNA linearizado utilizando um kit de transcrição in vitro MEGAscript T7 com uma modificação.

Adicione 0,5 microlitros do inibidor de RNAs rib lock após a etapa de tratamento do DNA, purifique o mRNA utilizando um kit padrão e avalie a qualidade do mRNA transcrito in vitro por eletroforese em gel de agarose. Dilua o mRNA em água livre de RNAses a 40 nanogramas por microlitro e armazene em alíquotas de dois microlitros a menos 80 graus Celsius, logo antes da microinjeção. Prepare a mistura de injeção adicionando oito microlitros de DNA transposon diluído a uma alíquota de dois microlitros de mRNA transposon.

Injete três nanolitros da mistura de DNA-RNA no vitelo de embriões de peixe-zebra de uma célula utilizando técnicas padrão de microinjeção, visando a interface entre o vitelo e o embrião. Após a injeção, aplique cinco microlitros da solução injetável remanescente em um gel de agarose a 1% para controle de qualidade, garantindo que o mRNA transcrito não tenha sido degradado. Cerca de seis a oito horas após a injeção, remova os embriões não fertilizados e mortos, e distribua os embriões em placas de Petri de 100 milímetros, com 60 a 80 por placa. Embriões anormais e mortos são removidos um, dois e três dias após a fertilização, sendo a avaliação realizada no terceiro dia após a fertilização com o auxílio de um microscópio estereoscópico equipado com fluorescência ou um microscópio ereto.

Examine os embriões e remova qualquer embrião anormal. Analise os embriões restantes sem defeitos evidentes. Para a fluorescência GFP, selecione os embriões F zero mais brilhantes e criem-nos utilizando procedimentos padrão de criação de peixes-zebra neste laboratório.

GBTs são geralmente injetados em linhagens com padrões de pigmentação selvagem ou leopardo. É razoável esperar que de 20 a 30% dos embriões injetados selecionados para criação sobrevivam até a fase adulta. A integração do vetor de armadilha gênica GBTB pode levar à expressão de EGFP por dois mecanismos diferentes.

O primeiro é um evento real de armadilha gênica. O vetor se integra a um gene, formando um transcrito híbrido entre a extremidade 5' desse transcrito gênico endógeno e o GAL quatro VP 16, que é produzido e traduzido em uma proteína de fusão contendo a extremidade N-terminal da proteína, revestida pelo gene mutado inserido e pelo GAL quatro, VP 16. Essa proteína de fusão se liga ao 14 XUAS e ativa a transcrição de EGFP.

O segundo evento, menos desejável, é um armadilha de potenciador. O promotor mínimo na frente da EGFP passa para o controle de um potenciador próximo ao local de integração, levando à produção da EGFP na ausência de GAL quatro, VP 16. Para distinguir entre essas duas classes de eventos, foi criada uma linhagem transgênica 14 X-U-A-S-M-R-F-P marcada com GFP da gama cristalina específica do cristalino.

Os eventos de armadilha gênica são verificados cruzando peixes injetados com GBT com peixes homozigotos U-A-S-M-R-F-P e realizando triagem para coexpressão de GFP e RFP, o que só é possível se GAL quatro, VP 16 for produzido e ativar U-A-S-M-R-F-P em trans para iniciar o procedimento de triagem de peixes F zero. Como os peixes injetados com GBT apresentam padrões de pigmentação selvagem ou leopardo e a linhagem homozigota U-A-S-M-R-F-P possui fundo brass, os peixes F zero podem ser facilmente diferenciados dos peixes U-A-S-M-R-F-P, eliminando a necessidade de registrar se o F zero em triagem era macho ou fêmea, bem como possíveis erros decorrentes de equívocos no registro ou na determinação do sexo de cada peixe. No dia seguinte.

Devolver os peixes U-A-S-M-R-F-P de latão para o seu tanque. Colocar os peixes F zero que produziram embriões em tanques estáticos individuais enquanto os embriões são coletados para triagem limpa e transferir os embriões coletados para novas placas de Petri na tarde do dia zero. Triar os embriões quanto à fluorescência GFP e RFP em um dia após a fertilização e três dias após a fertilização.

Retire os embriões positivos para GFP e RFP e os separe conforme o padrão de expressão G-F-P-R-F-P. Se mais de um padrão for observado em uma postura, mantenha-os para estabelecer a geração F1. Observe que embriões 3D PF positivos para GFP, mas não para RFP, não devem ser retirados, pois representam eventos de armadilha de enhancer.

Cruze os peixes F zero que produziram descendentes positivos para G-F-P-R-F-P novamente para obter um segundo lote de positivos. Os peixes F1 são analisados para estabelecer famílias F2, documentar o padrão de expressão do gene trapp e congelar lotes de embriões para identificação molecular dos locos do gene trap. No dia seguinte, realize primeiro o cruzamento de peixes F1 individuais com peixes U-A-S-M-R-F-P homozigotos. Coloque os peixes F1 que produziram embriões em tanques estáticos individuais, enquanto os embriões são coletados para triagem no primeiro dia após a fertilização.

A marcação com RFP pode ainda não ter aparecido, portanto examine os embriões quanto à fluorescência de GFP e retire os embriões positivos para GFP aos três dias após a fertilização; em seguida, examine quanto à fluorescência de GFP e RFP e retire os embriões duplo-positivos. Em seguida, fotografe os embriões positivos para GFP e RFP no quinto dia após a fertilização e congele lotes de 20 embriões G-F-P-R-F-P positivos e 20 embriões G-F-P-R-F-P negativos para identificação dos genes inseridos mutados por PCR inversa e 5' RACE. Crie os embriões restantes G-F-P-R-F-P positivos para estabelecer a geração F2 em um ensaio bem-sucedido de injeção.

Pelo menos 80% dos embriões injetados com a mistura de mRNA do transposão de armadilha gênica exibirão algum grau de fluorescência GFP. A baixa expressão de GFP indica injeção mal-sucedida ou degradação do RNA do transposão devido à contaminação por RNAses. Quando os embriões positivos para GFP mais brilhantes são selecionados para estabelecer o pool F₀, cerca de um em cada 10 peixes F₀ analisados produzirá prole com armadilha gênica entre os peixes F₀ dos quais os eventos de armadilha gênica são recuperados.

A maioria transmite um único evento de aprisionamento gênico, além de várias inserções de transposons não expressas. Como todo o cassete de aprisionamento gênico é delimitado por sítios P diretos, qualquer mutação por aprisionamento gênico ilustrada neste diagrama — com caixas azuis representando éxons do gene mutado — pode ser revertida pela expressão da recombinase CRE. Essas imagens mostram a coexpressão de GFP e RFP no sistema nervoso da linhagem de aprisionamento gênico NSF TP seis; a injeção de RNA de CRE em embriões NSF TP seis leva à perda da expressão de GFP e RFP.

Observe que não há redução da expressão de GFP no cristalino, como esperado. A maioria dos procedimentos descritos aqui também é aplicável a outras telas de armadilha gênica, bem como a experimentos regulares de transgênese com o TOL2 e outros transposons com o procedimento de armadilha gênica descrito aqui. Montar de 20 a 30 cruzamentos F0 por semana deve resultar na recuperação de uma armadilha gênica por semana.

No entanto, o procedimento pode facilmente ser ampliado.