Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

O objetivo geral deste procedimento é isolar bactérias magnetotáticas de um ambiente de água doce. Isso é feito coletando primeiro amostras de sedimentos de água da beira de um rio ou lago. O segundo passo é isolar as bactérias magnetotáticas contidas na amostra ambiental usando uma barra magnética.

Em seguida, as bactérias magnetotáticas são enriquecidas usando uma pista de corrida capilar de vidro e um ímã. Finalmente, as bactérias magnetotáticas são caracterizadas por microscopia óptica. Em última análise, a microscopia eletrônica de transmissão é usada para mostrar o tamanho e a forma das bactérias e suas zonas magnetológicas contendo magnetita.

Este método nos ajuda a entender questões-chave, microbiologia ambiental, como como o magneto evoluiu na Terra e como as bactérias táticas magneto sintetizaram ímãs de tamanho nanométrico. Demonstrando o procedimento hoje estará Zachary, um Stryker. Zachary é um candidato a doutorado em meu laboratório.

Ele trabalha com meu irmão e eu aqui na Ohio State University. Ao decidir sobre um local de água doce para coletar bactérias táticas magnéticas ou MTB, geralmente é melhor começar com uma lagoa ou riacho lento que tenha uma camada de sedimentos lamacentos macios. Nesta demonstração, coletamos uma amostra na beira do rio Oland Tangy, no campus da Ohio State University em Columbus, Ohio.

Encontre um local onde a profundidade da água esteja entre 10 e 100 centímetros e, usando um recipiente transparente com tampa de rosca, encha o recipiente com a camada superior de sedimento e o espaço restante com água, tampando o recipiente debaixo d'água no laboratório, afrouxe a tampa e deixe-o cobrindo o recipiente para reduzir a evaporação e armazene-o no escuro por várias horas a vários dias para permitir que o sedimento e encontrar partículas para assentar. Para fazer pistas de corrida para enriquecer o MTB. Comece usando uma caneta ou lima de diamante para cortar a parte superior de uma pipeta pastier de vidro de 5,75 polegadas, deixando espaço suficiente para um a dois mililitros de água.

Em seguida, use um queimador e para selar a autoclave da ponta. Vários levantam faixas junto com algodão e longas agulhas de metal. Quando estiver pronto para isolar o MTB, coloque ímãs nas laterais do recipiente de plástico, aproximadamente um centímetro acima da interface da água do sedimento com os pólos sul e norte em lados opostos do recipiente.

Tome cuidado para não perturbar o sedimento. Espere de 30 minutos a várias horas para que as bactérias nadem até o ímã. Em seguida, use uma seringa para remover o fluido do sample recipiente próximo à interface sedimento-água.

Conecte um filtro à seringa e uma agulha de metal ao filtro, certificando-se de que não haja bolhas no capilar. Use a agulha para adicionar a água de amostra filtrada a uma pista de autoclave com algodão estéril e a agulha de metal. Tampe a pista de corrida empurrando o algodão dentro do capilar a 0,5 a um centímetro de distância da extremidade selada.

Usando uma pipeta estéril, remova as bactérias magnetotáticas do recipiente onde elas estão agrupadas perto do pólo sul do ímã e adicione o MTB contendo água na extremidade aberta da pista de corrida. Assim que a pista estiver cheia de sample fluido, coloque-o de lado em uma superfície horizontal e coloque o pólo sul de uma barra magnética ao lado da ponta de vedação da pista. Aguarde de cinco a 30 minutos para que o MTB migre pelo algodão.

Use uma faca de diamante para fazer um pequeno arranhão perto do tampão de algodão e solte a extremidade da pista de corrida. Use uma seringa de um mililitro com uma agulha estreita para remover o fluido enriquecido com MTB da ponta da pista de corrida. Para observar o MTB por microscopia de luz, coloque uma gota da amostra enriquecida em uma lamínula.

Coloque a lamínula em um O-ring que está apoiado em uma lâmina de vidro. Isso é chamado de gota suspensa. O O-ring deve ter um diâmetro ligeiramente menor do que a lamínula.

Em seguida, coloque a lâmina em um microscópio de luz e concentre-se em uma borda da gota. Em seguida, para atrair o MTB para um lado da queda, coloque a extremidade sul de uma barra magnética perto desse lado em alguns minutos, muitos MTB devem estar na borda da queda. Para observar o MTB por TEM, coloque uma grade de cobre de 200 mesh estabilizada e revestida de carbono na gota da bactéria enriquecida e deixe a amostra assentar por 10 minutos.

Depois de lavar a amostra em uma gota de água por 30 segundos, coloque-a em uma gota de acetato de mictório a 2% por 30 segundos a cinco minutos e, em seguida, use um pedaço de papel de filtro para secar completamente, analise as amostras usando microscopia eletrônica de transmissão a 200 quilovolts. Aqui é mostrada uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de uma única bactéria magnetotática enriquecida a partir de uma amostra de sedimento ambiental. A espiral e a morfologia das zonas celulares e magnéticas são claramente visíveis junto com um único flegel.

Uma vez que as bactérias magnetotáticas tenham sido coletadas do ambiente, a técnica de separação magnética levará aproximadamente três horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a análise de RNA ribossômico de 16 s, podem ser realizados, o que responderá a perguntas adicionais, como qual é a relação filogenética das bactérias magnetotáticas recém-descobertas com outras e outros microrganismos.