Name: Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprenda a isolar e enriquecer bactérias magnetotáticas de ambientes aquáticos doce usando ímãs e microscopia. Este método simples facilita estudos ecológicos e aplicações biotecnológicas.

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Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation EUA (EAR-0920299 e 0745808-EAR); National Science Foundation EUA Leste Asiático e Pacífico Verão Institutos, a Sociedade Geológica da América Programa Bolsa Pesquisa e os Subsídios para Pesquisa de Pós-Graduação Alumni e Bolsa da Universidade Estadual de Ohio. Gostaríamos de agradecer ao editor e dois revisores anônimos por seus comentários perspicazes.

1. MTB Colecção <ol><li> Ao decidir sobre um local de água doce para coletar bactérias magnetotáticas (MTB), muitas vezes é melhor começar com uma lagoa ou de baixa movimentação de fluxo que tem uma camada de sedimento suave lamacenta. Nesta demonstração coletamos uma amostra na margem do rio Olentangy no campus da Universidade Estadual de Ohio (OSU), em Columbus, Ohio (EUA). Embora isso fosse um local conveniente para a demonstração, o protocolo aqui descrito é aplicável a qualquer localização aquática. Os materiais utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela 1. Encontrar um local onde a profundidade da água está entre 10 e 100 cm. Em um local tão, você deve coletar a camada superior mais de sedimentos usando uma clara, recipiente com tampa. Colher o sedimento e de água para dentro do recipiente até que é preenchido com um terço até metade do sedimento e o volume restante com água. Manter o recipiente submersa até ser enchido com água e, em seguida, firmemente tampar o recipiente wom a sua tampa de rosca de topo. Não é necessário misturar o sedimento. Limpe a parte externa do recipiente com uma toalha seca e depois tirar a amostra para o seu laboratório. Não é necessário apressar a amostra de volta para seu laboratório. Deixamos amostras de BTT em recipientes de plástico no campo por vários dias antes de trazê-los de volta para o nosso laboratório. O MTB deve ser viável por várias semanas a meses, desde que você armazenar as amostras em um local fresco e com sombra no campo. </li><li> Uma vez que a amostra está no seu laboratório, soltar a tampa e deixe que cobre o recipiente para reduzir a quantidade de evaporação. Armazenar o recipiente à temperatura ambiente num quarto escuro, gaveta, ou cobrir completamente o recipiente com uma folha de alumínio. Permitir que o sedimento e partículas finas de completamente assentar no fundo do recipiente, deixando a amostra em repouso durante várias horas a vários dias. Não é necessário misturar o sedimento, MTB prefere um ambiente sem ser perturbado. As paredes claras do recipiente de plásticopermitirá que você para confirmar que as partículas foram para o fundo. Dependendo da sua amostra, MTB podem permanecer vivos na amostra por muitos meses. </li></ol> 2. Isolamento MTB <ol><li> Quando estiver pronto para isolar os ímanes MTB, local nos lados do recipiente de plástico a cerca de 1 cm acima da interface sedimento-água (Figura 1A). Ter cuidado para não perturbar o sedimento no fundo do recipiente. Coloque o pólo sul de uma barra magnética de um lado do recipiente e no lado norte de um outro íman em barra no lado oposto (Figura 1A). Quase todo o íman pode ser utilizado, tal como uma barra de agitação magnética ou ima grande. Tudo pode ser utilizado para suportar os ímans à altura correcta acima da interface água-sedimento. Descobrimos que os magnetos descansando sobre a parte superior de uma caixa de papelão ou de plástico é o melhor, no entanto, os ímans podem também ser gravados para o exterior do recipiente de plástico. Espere 30 minutos a várioshoras para as bactérias que nadar para o ímã. </li><li> Use uma pipeta estéril para recolher a água com cuidado de dentro do recipiente (Figura 1A), perto da posição do ímã de barra sul-pólos (para amostras coletadas no hemisfério Norte). Esta água deve conter o MTB que foram atraídos para o ímã de barra sul-pólo. Em seguida, uma pista de corrida capilar deve ser utilizada para enriquecer ainda mais o MTB. </li></ol> 3. Autódromo de MTB <ol><li> A fim de enriquecer a sua amostra com bactérias magnetotáticas, uma pista de corrida capilar é necessário (Figuras 1B e 1C). Estes necessitam de ser feita antes de isolar as células do recipiente transparente de plástico. </li><li> Use uma polegada 5,75 (146 mm) de vidro Pasteur pipeta para fazer uma pista de corrida. Use uma caneta de diamante ou arquivo para cortar a parte superior da pipeta, o comprimento da pipeta não é crucial, mas deve ser capaz de conter aproximadamente 1-2 ml de água. Em seguida, utilizar um bico de Bunsen para derreter a ponta de modo a quetorna-se selado (Figura 1C). A pipeta resultante deve ter uma extremidade aberta e uma extremidade fechada. </li><li> Fazer várias dessas pistas e, em seguida, autoclave. Além disso, você terá de autoclave algodão e várias agulhas de metal longos. </li><li> Adicionar água de amostra filtrada, recolhida a partir de perto da interface água-sedimento mostrado na Figura 1A, com uma pista de corrida autoclavado utilizando uma agulha de metal longa ligado a uma seringa filtrada. O tamanho dos poros do filtro deve ser 0,22 milímetros para eliminar os detritos e contaminantes da água. É importante ter a certeza absoluta de que não há bolhas de ar no capilar de vidro. </li><li> Ligue o fundo da pista com algodão estéril (Figura 1B). Utilize a agulha de metal para empurrar o algodão para a extremidade selada da pista de modo que é de 0,5 - 1 cm de distância entre a ponta fechada (Figura 1C). </li><li> Utilizando uma pipeta estéril, adicionar a água MTB contendo (a partir de Secção 2.2) para a amostra de reservoir (extremidade aberta) de uma pista de corridas de MTB preparada (Figura 1B). </li></ol> 4. Enriquecimento MTB <ol><li> Uma vez que a pista é preenchido com fluido amostra, colocá-lo em seu lado em uma superfície horizontal (por exemplo, uma bancada) e coloque o pólo sul de um ímã de barra (no hemisfério norte) próximo à ponta fechada da pista (Figuras 1B e 1C). </li><li> Esperar 5 a 30 minutos para o MTB para migrar através do algodão. Então, você deve coletar o líquido perto da ponta da pista. Espera demasiado longa pode introduzir contaminantes, tais como outras bactérias móveis, para a ponta do capilar. Opcionalmente, você pode usar um microscópio de luz para ver a ponta da pista e ver o MTB recolher na ponta da pista do. Isso permitirá que você para determinar quanto tempo leva o MTB para migrar através do tampão de algodão. </li><li> Gentilmente usar a faca de diamante para fazer um pequeno arranhão perto tampão de algodão e tirar fora o fim da pista. </li> &lt;li&gt; Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha fina (25 ou calibre 27), para remover o líquido da ponta da pista. Esta amostra líquida agora deve conter o MTB enriquecido. </li></ol> 5. Observação MTB por microscopia de luz <ol><li> Colocar uma gota (10-20 ul) da amostra de MTB enriquecido para uma lamela. </li><li> Rapidamente virar a lamela mais para que a queda está agora virada para baixo e pendurado na lamela. </li><li> Coloque a lamela em um o-ring, que repousa sobre uma lâmina de vidro. O anel de vedação deve ter um diâmetro ligeiramente menor que a lamela (cerca de 1 cm), Figura 2. </li><li> Coloque essa queda pendurado em um estágio microscópio de luz e foco em uma borda da gota. Um objectivo 60X seco funciona muito bem, porque a maioria tem uma grande abertura numérica (NA; por exemplo, 0,93), mas não necessitam de óleo, o que é difícil de utilizar para o método de gota em suspensão (Figura 2). </li><li> Coloque a extremidade sul de um ímã de barra próximo ao d penduradorop e MTB começará a migrar em direcção ao bordo de queda mais próximo do íman (Figura 3). Dentro de alguns minutos MTB muitos devem estar na borda da gota (Figura 3). Provar-se que as bactérias são magnéticos, invertendo o pólo do íman e em seguida observar a bactéria nadar na direcção oposta. </li></ol> 6. MTB observação por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) <ol><li> Colocar uma gota (~ ul 20) do MTB enriquecido numa grelha de cobre e permitir que as bactérias que se contentar com 10 min. </li><li> Wick fora o excesso de água com um pedaço de papel de filtro limpo. </li><li> Opcionalmente, a grade pode ser negativamente coradas com acetato de uranilo a 2%, pH 2% de ácido fosfotúngstico 7,2, ou 2,5% de molibdato de sódio 7, 8, 9. Isto é feito através da colocação da grelha de cobre sobre uma gota de corante, imediatamente após a incubação da grade com o MTB enriquecido. Incubar a grade com a mancha negativa, os tempos podem variar, dependendo da rain utilizado, e, em seguida, para fora da mecha de fluido com um pedaço de papel de filtro limpo. </li><li> Observe o MTB usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Figura 4). Para o trabalho descrito aqui MTB foram adsorvidos a Formvar estabilizado e revestidos de carbono 200 redes de malha de cobre (Ted Pella # 01800). As grelhas foram colocados com o lado de carbono para baixo sobre uma gota de suspensão de células para um máximo de 10 min, em seguida, imediatamente lavadas uma vez através da colocação da grade em uma gota de água durante 30 segundos. Para a coloração, as grades foram colocados numa gota de acetato de uranilo a 2% (Ted Pella # 19481) durante 30 segundos a 5 minutos, e depois secou-se completamente através de um pedaço de papel de filtro. As grades foram analisadas por MET usando um FEI Espírito Tecnai em 80kV ou FEI Tecnai F20 usando alto ângulo STEM campo escuro anular em 200KV. </li></ol>

<ol><li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190, 377-379 (1975).</li>
<li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36, 217-238 (1982).</li>
<li>Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Biomineralization+of+Magnetite+%28Fe3O4%29+and+Greigite+%28Fe3S4%29+in+a+Magnetotactic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Controlled Biomineralization of Magnetite (Fe3O4) and Greigite (Fe3S4) in a Magnetotactic Bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 3232-3239 (1995).</li>
<li>Lefevre, C. T., Menguy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cultured+Greigite-Producing+Magnetotactic+Bacterium+in+a+Novel+Group+of+Sulfate-Reducing+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Cultured Greigite-Producing Magnetotactic Bacterium in a Novel Group of Sulfate-Reducing Bacteria.</a> Science. 334, 1720-1723 (2011).</li>
<li>Simmons, S. L., Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((South-seeking+magnetotactic+bacteria+in+the+Northern+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere.</a> Science. 311, 371-374 (2006).</li>
<li>Wolfe, R., Thauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27capillary+racetrack%27+method+for+isolation+of+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 45, 31-35 (1987).</li>
<li>Rodgers, F. G., Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+structure+in+a+many-celled+magnetotactic+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intercellular structure in a many-celled magnetotactic prokaryote.</a> Archives of Microbiology. 154, 18-22 (1990).</li>
<li>Moench, T. T., Konetzka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+and+study+of+a+magnetotactic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation and study of a magnetotactic bacterium.</a> Archives of Microbiology. 119, 203-212 (1978).</li>
<li>Balkwill, D., Maratea, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+a+magnetotactic+spirillum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of a magnetotactic spirillum.</a> Journal of Bacteriology. 141, 1399-1408 (1980).</li>
<li>Lins, U., Freitas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+homemade+apparatus+for+harvesting+uncultured+magnetotactic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple homemade apparatus for harvesting uncultured magnetotactic microorganisms.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 34, 111-116 (2003).</li>
<li>Jogler, C., Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Cloning+of+the+Magnetotactic+Metagenome%3A+Identification+of+Magnetosome+Island+Gene+Clusters+in+Uncultivated+Magnetotactic+Bacteria+from+Different+Aquatic+Sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toward Cloning of the Magnetotactic Metagenome: Identification of Magnetosome Island Gene Clusters in Uncultivated Magnetotactic Bacteria from Different Aquatic Sediments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 3972-3979 (2009).</li>
<li>Lin, W., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+Isolated+but+Uncultivated+Magnetotactic+Bacterium+of+the+Phylum+Nitrospirae+from+Beijing%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Newly Isolated but Uncultivated Magnetotactic Bacterium of the Phylum Nitrospirae from Beijing, China.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 668-675 (2012).</li>
<li>Li, J., Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization%2C+crystallography+and+magnetic+properties+of+bullet-shaped+magnetite+magnetosomes+in+giant+rod+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+and+Planetary+Science+Letters%22%5BJournal%5D)">Biomineralization, crystallography and magnetic properties of bullet-shaped magnetite magnetosomes in giant rod magnetotactic bacteria.</a> Earth and Planetary Science Letters. 293, 368-376 (2010).</li>
<li>Oestreicher, Z., Valerde-Tercedor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosomes+and+magnetite+crystals+produced+by+magnetotactic+bacteria+as+resolved+by+atomic+force+microscopy+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1331-1335 (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Bactérias magnetotáticas não são necessariamente encontrados em cada ambiente aquático 8, mas quando elas ocorrem, eles podem ser encontrados na ordem de 100 - 1000 células por mililitro 2. A fim de observar o MTB microscopia óptica, você vai precisar de cerca de 50 bactérias / ml em sua amostra 8. Se não houver nenhum ou poucos MTB em sua amostra, então você precisa selecionar um novo site ambiental para coletar suas amostras ou você terá de tentar uma ou mais das técnicas discutidas na...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do item </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95933 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur pipetas de vidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td></td></tr><tr><td> O-ring </td><td> Loja de ferragens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542B </td><td></td></tr><tr><td> Ímã de barra </td><td> Fisher Scientific </td><td> S95957 </td><td></td></tr><tr><td> Recipiente </td><td> Qualquer </td><td></td><td> Qualquer plastic ou recipiente de vidro que pode conter pelo menos 0,5 L e pode ser selada </td></tr><tr><td> Algodão </td><td> Qualquer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio com lente seca 60X </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Uma lente de 60X a seco não é absolutamente necessária, mas isto apresenta uma NA elevada sem utilizar óleo </td></tr><tr><td> Diamante caneta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de 0,22 milímetros </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-719C </td><td></td></tr><tr><td> 1 seringa ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9788564 </td><td></td></tr><tr><td> Microtubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar / carbono200 mesh, grades de cobre </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 01800 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> 19481 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Espírito TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, coleta e enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do meio ambiente

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Bactérias magnetotáticas (MTB) são microorganismos aquáticos que foram pela primeira vez descritos nomeadamente em 1975 uma das amostras de sedimentos coletados em salinas de Massachusetts (EUA). Desde então MTB foram descobertos em água e sedimentos estratificados-colunas de todo o mundo 2. Uma característica comum a todos MTB é que eles contêm magnetossomos, que são intracelulares, nanocristais ligado à membrana magnéticas de magnetita (Fe 3 O 4) e / ou greigite (Fe 3 S 4) ou ambos os 3, 4. No hemisfério norte, MTB normalmente são atraídos para a extremidade sul de um ímã de barra, enquanto no hemisfério sul geralmente são atraídos para a extremidade norte de um ímã de 3,5. Esta propriedade pode ser explorada durante a tentativa de isolar a partir de amostras ambientais MTB. Uma das formas mais comuns de enriquecer MTB é a utilização de um contentor de plástico transparente de recolher os sedimentos e água a partir de uma fonte natural,tal como um tanque de água doce. No hemisfério norte, o sul de uma barra magnética é colocada contra a parte exterior do recipiente um pouco acima do sedimento na interface sedimento-água. Depois de algum tempo, a bactéria pode ser removido do interior do recipiente perto do magneto com uma pipeta e, em seguida, enriquecido ainda mais por meio de um capilar de pista 6 e um magnete. Uma vez enriquecido, a bactéria pode ser colocado sobre uma lamela de microscópio, utilizando um método de gota pendente e observados num microscópio de luz, ou depositado sobre uma grelha de cobre e observadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM). Usando este método, isolado MTB pode ser estudada microscopicamente para determinar características tais como o tipo de comportamento de natação, e número de flagelos a morfologia das células, das células, a forma dos cristais magnéticos, número de magnetossomos, o número de cadeias de magnetossomos em cada célula, a composição de os cristais nanomineral e presença de vacúolos intracelulares.

Um íman é uma ferramenta eficaz que pode ser usado para isolar as bactérias magnetotáticas (MTB) contidas em amostras ambientais (Figura 1A). A pista de corrida capilar (Figura 1B) utiliza as propriedades magnéticas de MTB de atrair os através de um tampão de algodão, onde eles podem ser separados a partir de microrganismos não-magnetotáticas também contidos na amostra ambiental. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload...

Nós demonstramos um método para recolher bactérias magnetotáticas (MTB), que podem ser aplicadas para águas naturais. MTB podem ser isolados e enriquecidos a partir de amostras de sedimento utilizando uma configuração relativamente simples que aproveita magnetismo da bactéria natural. Isolado MTB pode então ser analisada em detalhe utilizando luz e microscopia eletrônica.

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar bactérias magnetotáticas de um ambiente de água doce. Isso é feito coletando primeiro amostras de sedimentos de água da beira de um rio ou lago. O segundo passo é isolar as bactérias magnetotáticas contidas na amostra ambiental usando uma barra magnética.Em seguida, as bactérias magnetotáticas são enriquecidas usando uma pista de corrida capilar de vidro e um ímã. Finalmente, as bactérias magnetotáticas são caracterizadas por microscopia óptica. Em última análise, a microscopia eletrônica de transmissão é usada para mostrar o tamanho e a forma das bactérias e suas zonas magnetológicas contendo magnetita.Este método nos ajuda a entender questões-chave, microbiologia ambiental, como como o magneto evoluiu na Terra e como as bactérias táticas magneto sintetizaram ímãs de tamanho nanométrico. Demonstrando o procedimento hoje estará Zachary, um Stryker. Zachary é um candidato a doutorado em meu laboratório.Ele trabalha com meu irmão e eu aqui na Ohio State University. Ao decidir sobre um local de água doce para coletar bactérias táticas magnéticas ou MTB, geralmente é melhor começar com uma lagoa ou riacho lento que tenha uma camada de sedimentos lamacentos macios. Nesta demonstração, coletamos uma amostra na beira do rio Oland Tangy, no campus da Ohio State University em Columbus, Ohio.Encontre um local onde a profundidade da água esteja entre 10 e 100 centímetros e, usando um recipiente transparente com tampa de rosca, encha o recipiente com a camada superior de sedimento e o espaço restante com água, tampando o recipiente debaixo d'água no laboratório, afrouxe a tampa e deixe-o cobrindo o recipiente para reduzir a evaporação e armazene-o no escuro por várias horas a vários dias para permitir que o sedimento e encontrar partículas para assentar. Para fazer pistas de corrida para enriquecer o MTB. Comece usando uma caneta ou lima de diamante para cortar a parte superior de uma pipeta pastier de vidro de 5,75 polegadas, deixando espaço suficiente para um a dois mililitros de água.Em seguida, use um queimador e para selar a autoclave da ponta. Vários levantam faixas junto com algodão e longas agulhas de metal. Quando estiver pronto para isolar o MTB, coloque ímãs nas laterais do recipiente de plástico, aproximadamente um centímetro acima da interface da água do sedimento com os pólos sul e norte em lados opostos do recipiente.Tome cuidado para não perturbar o sedimento. Espere de 30 minutos a várias horas para que as bactérias nadem até o ímã. Em seguida, use uma seringa para remover o fluido do sample recipiente próximo à interface sedimento-água.Conecte um filtro à seringa e uma agulha de metal ao filtro, certificando-se de que não haja bolhas no capilar. Use a agulha para adicionar a água de amostra filtrada a uma pista de autoclave com algodão estéril e a agulha de metal. Tampe a pista de corrida empurrando o algodão dentro do capilar a 0,5 a um centímetro de distância da extremidade selada.Usando uma pipeta estéril, remova as bactérias magnetotáticas do recipiente onde elas estão agrupadas perto do pólo sul do ímã e adicione o MTB contendo água na extremidade aberta da pista de corrida. Assim que a pista estiver cheia de sample fluido, coloque-o de lado em uma superfície horizontal e coloque o pólo sul de uma barra magnética ao lado da ponta de vedação da pista. Aguarde de cinco a 30 minutos para que o MTB migre pelo algodão.Use uma faca de diamante para fazer um pequeno arranhão perto do tampão de algodão e solte a extremidade da pista de corrida. Use uma seringa de um mililitro com uma agulha estreita para remover o fluido enriquecido com MTB da ponta da pista de corrida. Para observar o MTB por microscopia de luz, coloque uma gota da amostra enriquecida em uma lamínula.Coloque a lamínula em um O-ring que está apoiado em uma lâmina de vidro. Isso é chamado de gota suspensa. O O-ring deve ter um diâmetro ligeiramente menor do que a lamínula.Em seguida, coloque a lâmina em um microscópio de luz e concentre-se em uma borda da gota. Em seguida, para atrair o MTB para um lado da queda, coloque a extremidade sul de uma barra magnética perto desse lado em alguns minutos, muitos MTB devem estar na borda da queda. Para observar o MTB por TEM, coloque uma grade de cobre de 200 mesh estabilizada e revestida de carbono na gota da bactéria enriquecida e deixe a amostra assentar por 10 minutos.Depois de lavar a amostra em uma gota de água por 30 segundos, coloque-a em uma gota de acetato de mictório a 2% por 30 segundos a cinco minutos e, em seguida, use um pedaço de papel de filtro para secar completamente, analise as amostras usando microscopia eletrônica de transmissão a 200 quilovolts. Aqui é mostrada uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão de uma única bactéria magnetotática enriquecida a partir de uma amostra de sedimento ambiental. A espiral e a morfologia das zonas celulares e magnéticas são claramente visíveis junto com um único flegel.Uma vez que as bactérias magnetotáticas tenham sido coletadas do ambiente, a técnica de separação magnética levará aproximadamente três horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a análise de RNA ribossômico de 16 s, podem ser realizados, o que responderá a perguntas adicionais, como qual é a relação filogenética das bactérias magnetotáticas recém-descobertas com outras e outros microrganismos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eucariontes microbianos são tanto uma fonte de carbono fotossinteticamente derivado e espécies maiores predadores em lagos permanentemente cobertas de gelo da Antártida. Este relatório descreve uma abordagem cultura enriquecimento para o isolamento metabolicamente eucariontes microbianos versáteis do lago da Antártida, Lago Bonney, e avalia potencial de fixação de carbono inorgânico através de um ensaio de radioisótopos para a ribulose-1 carboxilase oxigenase atividade ,5-bisphophate (Rubisco).

Estabelecimento de Culturas Microbianas enriquecimento eucarióticas a partir de um quimicamente estratificada Antarctic Lake e Avaliação do Potencial de Fixação de Carbono

Fonte: Le Nagard, L., et al. Bactérias magnetotáticas em crescimento do gênero Magnetospirillum: Cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra como cultivar bactérias Magnetospirillum em condições microaeróbicas usando meios líquidos e semissólidos. Ele destaca a formação de uma banda bacteriana visível na interface óxico-anóxica e sua migração ascendente à medida que o oxigênio se esgota. O vídeo também mostra como avaliar o comportamento magnetotático observando a...

Cultivo de bactérias Magnetospirillum e avaliação de seu comportamento magnetotático

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Comece com uma cultura de enriquecimento derivada do solo de zonas úmidas contendo comunidades bacterianas.A cultura exibe atividade de Feammox, oxidação de amônio acoplada à redução de ferro férrico, indicando o enriquecimento de uma bactéria capaz desse processo metabólico.Diluir em série a cultura usando meios.Risque as amostras diluídas em placas de ágar de teste suplementadas com ferro férrico e amônio.Use placas de controle que não possuam ferro férrico ou amônio, ou contenham ferro...

Isolamento de redutores de ferro oxidantes de amônio de uma cultura de enriquecimento derivada do solo de pântano 

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o isolamento de bactérias marinhas degradadoras de poluentes por diluição em série, seleção de colônias e crescimento em meio contendo EE2. Ao usar EE2 como única fonte de carbono, o protocolo identifica cepas bacterianas capazes de metabolizar esse poluente ambiental.

Triagem de Bactérias Marinhas para o Isolamento de Cepas Degradantes de Poluentes

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento seletivo de bactérias marinhas degradadoras do petróleo ao enriquecer amostras de água do mar em meios à base de petróleo, possibilitando a recuperação de cepas puras com potencial de aplicações na biorremediação de petróleo bruto e limpeza ambiental.

Enriquecimento seletivo e isolamento de bactérias marinhas degradadoras de óleo a partir de amostras de água do mar

Técnicas de cultivo microbianas no local da enriquecimento ou em situ podem facilitar o isolamento dos táxons de difícil-para-cultura microbianos, especialmente de ambientes de baixa biomassa ou geoquímica extremas. Aqui, descrevemos um set-up eletroquímico sem usar uma fonte de alimentação externa para enriquecer cepas microbianas capazes de transporte de elétrons extracelular (EET).

Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

Apresentamos um procedimento para o cultivo de várias estirpes de Magnetospirillum magnetotacticum em dois tipos diferentes de meios de crescimento. Magnetospirillum magnetotacticum gryphiswaldense estirpe MSR-1 é cultivado em líquido e O gradiente de concentração de2 meios semi-sólidos enquanto cepa de M. magneticum AMB-1 e M. magnetotacticum cepa MS-1 são cultivadas em meio líquido.

Crescimento de bactérias de Magnetotactic do género Magnetospirillum magnetotacticum: cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Células natural killer são uma pequena população de linfócitos. Aqui nós mostramos como isolar estas células do sangue humano por seleção negativa, usando um kit de StemCell Technologies. As células obtidas são viáveis ​​e intocada por anticorpos e, portanto, pronto para ser usado para uma série de procedimentos.

Enriquecimento das células NK do sangue humano com o Kit RosetteSep de StemCell Technologies

Aprenda a isolar e enriquecer bactérias magnetotáticas de ambientes aquáticos doce usando ímãs e microscopia. Este método simples facilita estudos ecológicos e aplicações biotecnológicas.

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

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