Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

O objetivo deste procedimento é obter imagens da interface do tecido cerebral intacto em torno de microdispositivos cronicamente implantados no tecido cerebral de roedores. Isso é feito utilizando primeiro elastômero de silicone de célula rápida e um acrílico dental de duas partes para cobrir a craniotomia e formar uma calota craniana ao redor do dispositivo implantado no cérebro. Depois de perfundir o animal com fixador e processamento de tecido post-mortem, a parte implantada no cérebro do dispositivo é separada da tampa da cabeça queimando o acrílico dental e cortando a célula rápida.

Em seguida, o cérebro é removido e fatiado com um vioma para capturar o implante em uma seção de tecido. A etapa final é preparar o tecido para imagens fluorescentes lavando a rotulagem e, em seguida, limpando a seção do tecido em solução de limpeza óptica. Em última análise, a microscopia confocal é usada para mostrar a resposta biológica intacta que o implante cerebral penetrante produz no tecido circundante na escala subcelular.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como explicar, o dispositivo, é que a técnica evita romper o tecido ao redor e aderente ao dispositivo implantado, de modo que o tecido de interface possa ser examinado intacto. Este método baseia-se em técnicas avançadas de imuno-histoquímica e microscopia e resulta em dados de microscopia confocal que descrevem em detalhes a região ao redor de um dispositivo implantado cerebral. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroprótese, como o grau em que a morte celular local, a formação de cicatrizes gliais e a reorganização dos vasos sanguíneos realmente afetam a vida útil dos dispositivos de microeletrodos implantados no cérebro.

Embora este método possa fornecer informações sobre a interface neural crônica de matrizes de microeletrodos implantados no cérebro. As técnicas envolvidas neste método também podem ser aplicadas a outras áreas de pesquisa em neurociência, incluindo cânulas implantadas ou fibra óptica Em uma capela de exaustão, inicie o procedimento removendo cuidadosamente a pele e outros tecidos ao redor da calota craniana de acrílico, usando uma pinça e uma tesoura pequena enquanto usa as luvas insensíveis ao calor. Use um ferro soldado para produzir uma janela no acrílico amassado e exponha uma área de vedação rápida subjacente.

O dispositivo deve estar visível envolto na vedação rápida transparente. Em seguida, sob um microscópio cirúrgico, corte o elastômero de silicone com uma microtesoura curva. Em seguida, remova pequenos pedaços de vedação rápida com uma pinça e uma microtesoura até a posição em que o dispositivo entra no cérebro.

Continue cortando ao longo da superfície da craniotomia para separar os componentes do dispositivo que se ligam ao polissilício e ao crânio dos componentes implantados no cérebro. Tenha cuidado ao cortar os componentes expostos do dispositivo. Evite empurrar ou arrastar os implantes no tecido fixo.

Em seguida, remova o osso ao redor da tampa da cabeça com cuidado usando as shes cruas depois disso. Use uma espátula para separar o cérebro com o dispositivo implantado do crânio. Agora coloque o cérebro em uma placa de Petri de vidro cheia de HBHS.

Use o bloqueio cerebral e as lâminas de barbear para seccionar o cérebro e criar um plano plano que corresponda ao ângulo dos dispositivos implantados. Depois disso, pressione duas lâminas de barbear através do tecido cerebral expondo a superfície plana que será montada no Vibram. Em seguida, coloque um pouco de gelo sob a plataforma Vibram.

Em seguida, seque brevemente a superfície do tecido em uma toalha de papel. Depois disso, oriente a amostra de forma que a dimensão mais ampla seja paralela à direção do movimento da lâmina de tom vibratório para ajudar a evitar que a lâmina derrube o tecido imediatamente, cole o plano plano no palco com super cola. Depois que a cola endurece um PBS resfriado para o prato de vibrato ao redor do tecido.

Agora corte as fatias de tecido entre 250 a 500 mícrons usando a taxa máxima de vibração e uma taxa de progressão lenta da lâmina com um ângulo de lâmina de 10 graus da horizontal. Em seguida, colete as fatias cuidadosamente com um pincel e uma espátula e armazene um HBHS em uma placa de 24 poços a quatro graus Celsius enquanto coleta as fatias, mantenha um registro da espessura e localização de cada fatia à medida que são removidas para a placa de 24 poços. Assim que o dispositivo Insitu estiver visível, colete uma fatia de tecido com cerca de 500 mícrons de espessura.

Para capturar o dispositivo em uma única fatia de tecido para coletar uma seção de tecido mais fina, fatias de 100 mícrons podem ser cuidadosamente coletadas para se aproximar do dispositivo. Nesse ponto, uma fatia com menos de 500 mícrons de espessura pode ser coletada com o dispositivo dentro. Comece o processamento de tecidos lavando as fatias três vezes a cinco minutos por lavagem em HBHS.

Em seguida, incube-os em hidreto de borah de sódio por 15 minutos. Cada lado da fatia vire lentamente a fatia usando um pincel pequeno e evite tocar em qualquer área ao redor do dispositivo implantado. Uma micro colher de aço inoxidável ou revestida de Teflon também pode ser usada junto com o pincel pequeno.

Agora lave as fatias três vezes a cinco minutos por lavagem em solução de lavagem em temperatura ambiente. Bloqueie-os em solução de lavagem por duas horas em temperatura ambiente enquanto vira as fatias. Após uma hora após duas horas, incubar as fatias em anticorpo primário durante cerca de 48 horas a quatro graus Celsius.

Em seguida, execute seis lavagens rápidas de três minutos com solução de lavagem. Em seguida, execute seis lavagens de uma hora em solução de lavagem. Depois disso, incube-os em anticorpo secundário por aproximadamente 48 horas a quatro graus Celsius.

Novamente, execute seis lavagens rápidas de três minutos, seguidas de seis lavagens de uma hora em solução de lavagem. Em seguida, remova a solução de lavagem e adicione a solução de limpeza de calcário U2 à base de glicerol. Cubra o prato com papel alumínio e guarde a quatro graus Celsius.

Deixe as fatias grossas limparem aproximadamente uma semana ou seções de tecido muito grossas por duas a três semanas de quatro graus Celsius. Após a folga, monte as seções de tecido nas lâminas usando solução de limpeza como meio de montagem. Sele todas as lâminas com esmalte transparente e guarde-as a quatro graus Celsius de distância da luz, usando objetivas de microscópio de maior distância de trabalho.

Comece a imagem com um microscópio confocal de varredura a laser ou um microscópio de dois fótons. Demonstraremos com um software de envio XS L SM seven 10 Carl Xi e um estágio de tradução XY controlado por computador para imagem Um panorama 3D ao redor de um implante para corrigir o índice de refração da solução de limpeza. Nesta demonstração, inserimos um valor de índice de refração de 1,4 no software do microscópio Leica Zen para a solução de limpeza U2.

Essa configuração ajusta sutilmente os intervalos de passos Z para levar em conta a incompatibilidade do índice de refração no tecido próximo ao dispositivo. Avalie aproximadamente a janela do eixo Z apropriada e as configurações de coleta de dados na dimensão zdi para cada canal fluorescente usando baixa potência do laser, cerca de 0,5 a 5% e tamanhos de passo Z grandes. Em seguida, use o software de panorama Zen para definir a objetiva no centro XY do panorama eventual e para determinar o número de posições de coleta necessárias para os eixos x e y.

Para cobrir sua região de interesse, reavalie e finalize a janela de coleta do eixo Z verificando rapidamente o primeiro e o último quadros da pilha. Em seguida, defina manualmente a sensibilidade do detector e a potência do laser para rampar adequadamente com o aumento da profundidade. O objetivo é normalmente manter aproximadamente a mesma intensidade de imagem, independentemente da profundidade da imagem na fatia de tecido, e também evitar alto ruído de fundo.

Colete cada série de dados de imagem fluorescente, se necessário, para evitar sinais sobrepostos, execute linhas de laser sequencialmente. Altere as configurações do software para coletar os dados ou os dados de transmitância e use um laser de comprimento de onda mais penetrante e mais longo, como 6 a 33 nanômetros para capturar esses canais. Em seguida, determine a potência do laser apropriada e detecte uma sensibilidade para coleta de refletância e transmitância e repita a mesma série de coleta ao redor do dispositivo implantado.

Por fim, exporte os dados para posterior quantificação e análise de processamento. A imagem através de ambos os lados da lâmina pode permitir que você avalie a interface em torno de um dispositivo, como mostrado aqui, onde a microglia ao longo do suporte de silício de um MEA é visível de um lado e a microglia ao longo dos locais dos eletrodos e traços são visíveis do outro lado. Uma vez que o tecido montado pode ser visualizado usando um estágio de tradução XY, as visões gerais dos rótulos fluorescentes em toda a fatia de tecido podem ser geradas na resolução desejada.

Aqui, núcleos celulares corados com ganchos 3, 3, 3 4 2 e monócitos microglia marcados com 3 2 9. O Anti IBA foi fotografado simultaneamente em canais separados. A luz de transmissão e a refletância também foram coletadas mostrando a localização do implante de quatro semanas em relação aos ganchos e dados IVA um, a sobreposição de todos os canais, mas a transmissão é mostrada aqui.

O exame detalhado da interface do tecido morfologicamente preservado em torno dos microdispositivos implantados pode ser coletado sob alta ampliação para análise da resposta local do tecido, a refletância e a transmitância permitem a localização do dispositivo, enquanto o anticorpo fluorescente ou os marcadores químicos permitem imagens detalhadas dos componentes do tecido ao longo da interface do tecido intacto. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realmente dedicar um tempo à separação cuidadosa dos dispositivos implantados através da tampa da cabeça e planejar que essa etapa leve mais de 30 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar e processar fatias de cérebro contendo dispositivos implantados.

Você também deve ser capaz de rotular e coletar dados histológicos que descrevem a neurobiologia em torno desses dispositivos.