Name: Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Aprenda a produzir complexos peptídicos transmembrana estabilizados por dissulfeto para estudos estruturais usando E. coli e cromatografia de afinidade. Este método permite análises por RMN de solução.

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O financiamento para esta obra é fornecida pelo National Health and Medical Research Council da Austrália (NHMRC projeto de subsídio para 1.011.352 MEC e MJC; institutos de pesquisa independentes Regime de Apoio Infra-estrutura [IRIISS] subvenção para WEHI) e do Governo de Victoria (VESKI Inovação Fellowship ao MEC; vitoriana do Governo do Estado de Infra-estrutura de Apoio Operacional à WEHI). MEC é uma rainha Elizabeth II Fellow do Conselho de Pesquisa Australiano. EFXB reconhece o apoio do Programa de Bolsas de Norma Hilda Schuster, da Universidade de Melbourne.

1. Clonagem e Design Construct Clonar as sequências de interesse no vector PMM-peptídeo (que podem ser fornecidos a pedido), utilizando os locais de restrição HindIII e BamHI (ver Figura 1). O inserto de DNA de cadeia dupla deve incorporar, na seguinte ordem: um sítio HindIII, um único codão de metionina para a clivagem com CNBr, a E. peptídeo coli codões optimizados sequência codificadora, um codão de paragem, um sítio BamHI. Todas as outras metioninas no péptido devem ser eliminados e a sequência de dipeptídeo asp-pro deve ser evitada, uma vez que vai também ser clivado em condições ácidas. Um único resíduo de cisteína devem ser introduzidos em cada sequência de péptido de acordo com o posicionamento desejado da reticulação dissulfito no complexo final, e todas as outras cisteínas deve ser mutado para serina. O plasmídeo transporta uma cassete de resistência à canamicina para selecção. 2. Expressão de trpLE-peptiFusão de <ol><li> Faça-se e estéril filtro M9/Kan meio de crescimento mínima (0,1 mM CaCl 2, 2 mM de MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH 4 Cl, 4 g de glicose / L, 50 mg / L de sulfato de canamicina). Suplemento com Centrum Completa A a zinco para fornecer vitaminas do complexo B e metais vestigiais:. Dissolver 1 comprimido em 40 ml de H2O com agitação durante 30 min, centrifugação para remover o material insolúvel e o sobrenadante filtro estéril laranja Solução estoque armazenamento a 4 ° C no escuro durante 2 semanas, e utilizar 4 ml / L em M9. NOTA: 15 N-NH 4 Cl enriquecido, 13 C-glucose enriquecida ou outros precursores estáveis, marcada com isótopos podem ser incluídos no meio M9, nesta fase, se desejado. </li><li> Inocular uma cultura de 100 ml de arranque a partir de recém-transformadas BL21 (DE3) estirpe E. coli em meio M9/Kan. Crescer durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm. </li><li> Na manhã seguinte, verificar a DO600 da cultura iniciadora - este deve estar na gama de 2 ou superior. Dilui-se a 100 ml da cultura de arranque em 1 l de volume total de Centrum suplementado meio M9. Dividido em dois frascos de 2 L confundidos (500 ml de cultura em cada frasco) e crescer a 37 ° C com agitação a 140 rpm até que a DO600 atinge 0,6. </li><li> Ajuste a temperatura agitador a 18 ° C e continuar a agitar durante 1 hora, permitindo que as culturas para refrigerar completamente antes da indução. </li><li> Tomar uma amostra de pré-indução por análise SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD = 1 600), em seguida, adicionar IPTG para 0,1 mM de concentração final para induzir a expressão da fusão do peptídeo trpLE. Continuar a crescer a 18 ° C/140 rpm durante a noite (16-20 horas) sob indução IPTG. </li></ol> 3. Preparação inclusão Corpo e Encadernação matriz de níquel <ol><li> A DO final 600 de culturas de expressão durante a noite em meio mínimo é variável e should estar compreendida entre 2,5 e 5,0. Tomar uma amostra para análise de SDS-PAGE (equivalente a 50 ul de uma cultura de OD 600 = 1) e recolher as células por centrifugação durante 20 min a 5.000 x g. </li><li> Ressuspender o sedimento de células a partir de 1 L de cultura em 50 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). As suspensões de células podem ser armazenadas congeladas para posterior processamento. </li><li> Lisar as células por sonicação em gelo na saída máxima durante 1 min e repouso em gelo durante 5 min. Nós usamos um sonicador Misonix 3000 (saída máxima de 600 watts), com uma ponta de ½ polegada de alta intensidade substituível. Repita sonicação / arrefecimento por três ciclos. </li><li> Colete insolúvel de corpos de inclusão do material (IB) por centrifugação durante 15 min a 20000 xg e desprezar o sobrenadante. Uma camada, solto fino de cor clara de detritos celulares pode ser visível na parte superior do sedimento denso IB, o que pode ser lavado com água ou tampão com agitação suave. Passos 3.3 e 3.4 podem ser repetidas para melhorar a pureza da fracção de IB se desivermelho. As amostras de pellet e sobrenadante de material deve ser tomado para análise de SDS-PAGE para confirmar a localização trpLE-TM fusão de corpos de inclusão. </li><li> Dissolver IB pelotas em solução de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), utilizando-se 25-50 ml por litro de cultura processado. Esta etapa irá exigir várias horas com agitação e sonicação leve ocasional. </li><li> Limpar o lisado IB por centrifugação durante 1 hora a 75,000-100,000 xg e 20 ° C. Decantar o sobrenadante e filtra-se através de uma membrana de 0,2 | iM. </li><li> Combina-se o lisato limpo IB, num tubo cónico de 50 ml ou de um recipiente maior, que pode ser fechada de forma segura, com resina de afinidade de níquel que foi lavado com água e equilibra-se a solução de guanidina. Use resina 3-4 ml resolvido por litro de cultura processado por fusão que expressam a um grau similar como trpLE-DAP12TM aqui mostrado (Figura 3, pista 2). Ligam descontínuo, incubando durante a noite na sala de t<html> emperatura com mistura suave. </li></ol> 4. Na coluna de reticulação oxidativa <ol><li> Carregar o IB suspensão resina lisado / níquel em uma coluna vazia de fluxo por gravidade com o apoio leito poroso, adicionando continuamente até que todo o volume flui. Coletar e colocar de lado o fluxo contínuo, o que ainda pode conter proteína de fusão não ligado. </li><li> Lava-se a resina de níquel por escoamento por gravidade, com 5 volumes de leito de uma solução de ureia (ureia 8 M, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 200 mM), contendo 5 mM β-ME. </li><li> Lava-se a resina de níquel de novo com 5 volumes de leito de uma solução de ureia sem β-ME. </li><li> Lava-se a resina de níquel de uma terceira vez com 5 volumes de leito de uma solução de ureia que foi suplementado com 20 mM de CuSO4 e 2 mM de glutationa oxidada. Após esta lavagem, feche a saída da coluna e incuba-se 30 min à temperatura ambiente para permitir a formação de ligações dissulfureto máxima. </li></ol> 5. TFA eluição e Quantificação conteúdo &quot;&gt; ATENÇÃO: ácido trifluoroacético (TFA) provoca queimaduras graves em contacto com a pele e os vapores são altamente irritantes TFA concentrado deve ser usado apenas em um capuz químico aprovado fumos com óculos de proteção e luvas sem látex Verifique a compatibilidade química de todos.. materiais utilizados; polipropileno é compatível com todas as etapas deste protocolo. <ol><li> Lavar a solução de ureia a oxidante com 10 volumes de leito de água e secar o leito da coluna por aplicação de uma linha de vácuo para a saída da coluna. </li><li> Fechar a saída da coluna e adicionar 1,5 volumes do leito de puro (99-100%) de TFA. Agita-se a resina de níquel com uma pequena espátula para assegurar uma exposição a ácido e incubar durante 5 min. Abrir a saída da coluna e recolher o eluato ácido, pressurizando suavemente com uma seringa ou uma linha de ar comprimido, se necessário, para empurrar para fora de todo o líquido. </li><li> Repetir o passo de eluição do ácido com mais 1,5 volumes do leito de TFA puro. Trabalhar rapidamente nesta etapa, para evitar a dissolução completa do Beaded agarose matriz. Produção de proteína pode ser determinada, neste ponto de acordo com a equação de Beer-Lambert e o coeficiente de extinção molar teórica da sequência trpLE-péptido. Diluir a amostra do eluato de TFA (01:20 - 01:50), em trifluoroetanol (TFE) e medir a absorvência a 280 nm, utilizando-se TFA / TFE para a mesma diluição como um branco. </li></ol> 6. Digestão CNBr ATENÇÃO: O brometo de Cyanogen (CNBr) é extremamente tóxico e deve ser tratado apenas em um capuz químico aprovado fumos. PPE incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas sem látex são absolutamente necessários. CNBr é reativa à umidade e deve estar à temperatura ambiente antes de abrir. Contacte o seu escritório de segurança institucional para obter instruções sobre a neutralização / eliminação de CNBr contaminados soluções e materiais. <ol><li> Dilui-se o eluato até à concentração de ácido de 80% TFA final por adição gota a gota de água enquanto se mistura com cuidado. Se se formar um precipitado, umadd volta de um pequeno volume (0,5 a 1 ml) de TFA puro, até a solução fique límpida, em seguida, re-corrigir a 80% com água. Tomar uma amostra de 5 ul de pré-digest por análise SDS-PAGE, a congelação em azoto líquido e a liofilização da amostra imediatamente. </li><li> Adicionar cristais de CNBr de aproximadamente 0,2 g / ml, tendo o cuidado para pesar o produto químico tóxico com segurança fechados, em pré-doseados tubos ou usando uma balança no interior do exaustor de fumos química. Misture suavemente até que esteja completamente dissolvido. Lavar e selar o recipiente de reacção sob atmosfera de gás inerte (azoto ou árgon fluxo) e incubar 3-4 horas à temperatura ambiente, protegida da luz. </li><li> Dê uma amostra de 5 pós digerir-ul de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. Transferir a reacção de digestão com uma cassete de celulose regenerada ou da tubagem de diálise (o acetato de celulose se dissolve em ácido concentrado), com um corte de peso molecular de 3,5 kDa, ou menos, de acordo com o tamanho do complexo de péptido esperado. Dializar durante a noite a 4 L de água nocoifa química para reduzir a concentração de TFA e decompor qualquer CNBr que não reagiu. Deixar espaço na cassete de diálise ou tubo de um aumento significativo no volume (tanto como duas a três vezes), durante a diálise durante a noite. </li><li> Remover a solução de reacção com dialisado precipitado suspenso a partir da cassete de diálise ou tubo (a maior parte da proteína irá precipitar quando a concentração de TFA é reduzido), e transferir a suspensão para tubos de 50 ml cónicas. Congelar e liofilizar para remover a água e vestígios de CNBr / TFA. Este passo é provável que requerem vários dias. ATENÇÃO: Tanto a reação digerir dialisado e da água de diálise deve continuar a ser tratada como tóxico e tratados / eliminados com as devidas precauções. </li><li> Amostras de culturas de fases de indução e de pré-colheita, de corpos de inclusão do sobrenadante e sedimento, eluído TFA e digerido CNBr-material pode ser analisada por SDS-PAGE. Preparar as amostras por meio de aquecimento a 95 ° C em Invitrogen NuPAGE LDS sampltampão e. TFA eluato e amostras digest deve ser preparada em condições tanto redutoras e não redutoras para facilitar a identificação do produto e avaliação de reticulação oxidativa. </li><li> Separa-se as amostras sobre um gel NuPAGE 12% Bis-Tris acrilamida pré-molde com MES SDS-tampão de corrida para resolução óptima dos produtos mais pequenos de resumo. </li></ol> 7. De fase reversa HPLC da purificação por dissulfureto reticulados complexos de péptido <ol><li> Dissolve-se a 100 mg de produtos liofilizados digest em 2-3 ml de ácido fórmico puro e carga para uma escala preparativa (21,2 x 150 mm) da Agilent ZORBAX SB-300 C3 coluna PrepHT em solvente A (tipicamente 10-20% de acetonitrilo e 5 -10% de isopropanol em água com 0,1% de TFA). </li><li> Eluir os produtos digest com um gradiente de solvente B (acetonitrilo ou isopropanol com 0,1% de TFA) ao longo de pelo menos 5 volumes de coluna. Veja a discussão para sugestões sobre a seleção de condições de gradiente ideais para seqüências de peptídeos diferentes. </li><li> Tomar50-100 ul de amostras de cada fracção de HPLC para a análise de SDS-PAGE e congelar e liofilizar imediatamente. A remoção dos solventes de HPLC é rápido e deverá estar completo em 1-2 horas. </li><li> Preparar as amostras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE, por aquecimento a 95 ° C em tampão de amostra Invitrogen NuPAGE LDS sem agente redutor. Arrefece-se e dividir cada amostra uniformemente em dois tubos de microcentrífuga, adicionando 100 mM de DTT para uma delas e re-aquecimento breve. </li><li> Separa-se as amostras reduzidas e não reduzidas por HPLC sobre uma NuPAGE 12% de gel de acrilamida tris-bis pré-molde com MES SDS-tampão de corrida, como acima. Pequenas, peptídeos hidrofóbicos muitas vezes não ocupam Coomassie mancha bem e pode não funcionar em seus esperados pesos moleculares. No entanto, a comparação das amostras reduzidas e não reduzidas deve facilitar a identificação dos produtos de péptidos com ligações cruzadas e de avaliação da pureza. </li><li> Analisar os péptidos candidatos fracções contendo por laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa (ver discussão) para identificar as espécies de interesse e confirmar a sua massa esperada. </li><li> Combinar, congelar e liofilizar fracções de HPLC contendo o puro, complexo de péptido TM reticulado e ter um peso seco do produto final para determinar o rendimento. Frações com conteúdo isopropanol alta não podem permanecer congelados. Se as fracções peptídicas secar até uma película, em vez de um produto macio liofilizado, re-dissolve-se o filme completamente em um pequeno volume de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar e liofilizar novamente. O produto HFIP tratado deve ser um cone pequeno, branco, que é facilmente inclinada para fora e pesados. </li></ol>

<ol><li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+into+the+blind+spot%3A+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li>
<li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li>
<li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li>
<li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface%3A+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li>
<li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li>
<li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li>
<li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li>
<li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li>
<li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. xpression <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment%2C+CB2%28180-233%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li>
<li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li>
<li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li>
<li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li>
<li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li>
<li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li>
<li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer%27s+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li>
<li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li>
<li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

A expressão de fusões trpLE-TM. Na nossa experiência, trpLE-TM fusões são pobremente expressa em meio de cultura rico, a 37 ° C, e as condições de cultura aqui descritas tenham sido bem sucedida para muitas sequências diferentes contendo 1-4 domínios TM com rendimentos variando 50-150 mg / L de fusão pura e intacta. Codificação de fusões de três ou de quatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 e TM4-TM7, respectivamente) ou um fragmento do núcleo catalítico da peptidase sinal peptídeo humano (quatro domí...

Este protocolo detalhes um procedimento que desenvolvemos para produzir complexos estabilizados por dissulfureto de transmembrana (TM) péptidos para estudos estruturais de RMN utilizando solução. O processo tira partido da expressão robusta proporcionada pelo sistema de fusão ΔtrpLE1413 (ver abaixo) e permite que os complexos de peptídeos de TM da composição definida para ser gerados usando técnicas sofisticadas de isótopos estáveis ​​de rotulagem para as modernas experiências de RMN multidimensionais. Nós empregamos essas técnicas para determinar as estruturas de RMN, que revelou várias novas e importantes informações sobre como linfócitos activadores immunoreceptors são montados a partir de subunidades de proteínas de membrana múltiplas através de interacções entre os seus domínios TM (recentemente revisto em 1). Estas técnicas são aplicáveis ​​a muitos outros sistemas de membrana de proteína, bem como uma grande variedade de métodos analíticos a jusante para além RMN solução. Enquanto o exemplo dado aqui utiliza resíduos de cisteína nativospara criar um complexo que imita o naturalmente ligado por dissulfureto da proteína, a concepção é igualmente adequado para a criação de pontes de dissulfureto para estabilizar complexos de engenharia que são normalmente mantidas juntas por mais fracas, de interacções não covalentes tais como homo-e hetero-dímeros de complexos TM receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da família de proteínas ou complexos de 2-4 heterodiméricos αβ integrina 5,6. Extremamente hidrofóbicos sequências de péptidos tais como os derivados a partir da bicamada lipídica que mede porções de proteínas TM são assuntos extremamente difíceis para estudos bioquímicos e biofísicos. Para além de ser muito difícil de manipular utilizando proteína padrão e técnicas de química de péptidos, são frequentemente muito tóxicos para as células e, portanto, são difíceis de produzir por via recombinante. Nós e outros 7,8 9-11 têm tido um sucesso significativo expressar tais sequências peptídicas difíceis em bactérias tal como no quadro-carboxi-terminalfusões com uma versão modificada da sequência ΔtrpLE1413 derivado da E. coli operão trp 12. O polipéptido ~ 13 kDa trpLE codificada por esta sequência pode ser produzido em níveis elevados no âmbito de um promotor T7 e é totalmente localizado para corpos de inclusão em que os problemas relacionados com a toxicidade e / ou de instabilidade são contornadas. Modificação da sequência, por adição de um ácido amino-terminal 9 de histidina-tag 13 e eliminação de resíduos internos de metionina e cisteína da sequência de 14 trpLE permitidos trpLE peptídicos fusões de ser purificadas por cromatografia de afinidade de metal-ião e digerido com brometo de cianogénio (CNBr ) para libertar a sequência peptídica desejada. Temos utilizado com sucesso este sistema para expressar mais de uma dúzia de diferentes seqüências como fusões trpLE representam fragmentos de proteínas de membrana que contêm até quatro domínios TM (7,8 e resultados inéditos, ver também seção de discussão). Oinovação chave neste protocolo é a identificação das condições em que os não estruturados e muito pouco solúvel trpLE-TM fusões podem ser eficientemente dissulfureto reticulado no contexto de um fluxo de trabalho simplificado. Vários aspectos da expressão de elevado rendimento, manipulação e purificação de produtos peptídicos foram também cuidadosamente optimizadas, e as recomendações aqui apresentadas são igualmente relevantes para a produção de não-reticuladas de dissulfureto (monomérico) Produtos TM peptídicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Brometo de cianogénio </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas. Muito tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. O contato com ácidos liberta gases muito tóxicos. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, número CAS 76-05-1 </td><td> Substância perigosa. Mercadorias perigosas., Provoca queimaduras graves. Nocivo por inalação. Nocivo para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, número CAS 60-24-2 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Tóxico por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Irritante para a pele. Risco de lesões oculares graves. Pode causar sensibilização em contacto com a pele. Muito tóxico para os organismos aquáticos, pode causar a longo prazo efeitos negativos no meio ambiente aquático. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Número do produto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> Substância perigosa. PRODUTOS PERIGOSOS. Nocivo por inalação e ingestão. Causa queimaduras. </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Líquido inflamável e vapor. Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Número de Produto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Quando aquecido, dezembroomposes de dióxido de carbono e amónia; se queimado, emite pequenas quantidades de óxidos de azoto. Pode causar vermelhidão e irritação da pele e dos olhos. </td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Número CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo se ingerido, causa irritação ocular grave, provoca irritação da pele, toxicidade oral aguda, irritante da pele Irritante aos olhos. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Número-T8532 produto CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 é um detergente não iónico, 100% do ingrediente activo, que é muitas vezes utilizado em aplicações bioquímicas para solubilizar as proteínas. Triton X-100 não tem propriedades antimicrobianas e considerado como um detergente comparativamente suave não desnaturante </td></tr><tr><td> Sua-Select gel níquel-Affinity </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel de Afinidade O níquel é um produto de metal imobilizado iões de cromatografia de afinidade (IMAC). O Nick HIS-Selectel gel de afinidade é um quelato de propriedade quadridentado em agarose frisado carregada com níquel, que é concebido para ligar especificamente proteínas contendo histidina. </td></tr><tr><td> (-)-Glutationa, oxidado </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Num catálogo 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix sonicador S-3000 </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (descontinuado) </td><td> Potência máxima de 600 watts. Ponta da sonda substituível 1,2 cm leva 1,2 cm de alta intensidade, alto volume de dicas e uma gama de alta intensidade, baixo volume dicas. Mais próximos modelos atualmente disponíveis nesta empresa são Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic sistema de cromatografia DuoFlow, versão de software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Num catálogo 760-0047, Config Não: AU500571, No de série: 484BR3705 </td><td> Liga-se a péptidos de colunas de fase reversa de HPLC em alta aqfase móvel ueous e são eluídos de colunas de RP HPLC com fase orgânica elevada móvel. Em RP HPLC péptidos são separados com base no seu carácter hidrófobo. Os péptidos podem ser separados através da execução de um gradiente linear de solvente orgânico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-coluna analítica de HPLC, de 21,2 x 150 mm, tamanho de partícula 5 | iM </td><td> Agilent </td><td> Não Produto: 895150-909 </td><td> HPLC em fase reversa colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pré géis elenco para eletroforese de proteínas </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Cassetes diálise, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nenhum produto: 87724 </td><td> Amostra de diálise </td></tr></tbody></table>

complexos de produção de transmembrana disulfide-estabilizados peptídicos para estudos estruturais

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Interacções físicas entre os lípidos incorporados alfa-helicoidais domínios de proteínas da membrana desempenham um papel crucial na dobragem e montagem de complexos de proteínas de membrana e em processos dinâmicos, como transmembranar (TM) de sinalização e regulação dos níveis de proteína da superfície celular. Compreender as características estruturais de condução a associação de seqüências particulares requer sofisticadas análises biofísicos e bioquímicos de complexos peptídeo TM. No entanto, a hidrofobicidade extrema de domínios TM torna-os muito difíceis de manipular utilizando técnicas de química de péptidos e a produção de material de estudo adequado muitas vezes se torna proibitivamente desafiador. Identificando as condições sob as quais os péptidos podem adoptar conformações helicoidais estáveis ​​e formam complexos espontaneamente acrescenta outro nível de dificuldade. Apresentamos aqui um processo para a produção de homo-ou hetero-dímeros de complexos de peptídeos de TM a partir de materiais que são expressas em E. coli, o que permite a incorporação de etiquetas de isótopos estáveis ​​para a ressonância magnética nuclear (RMN), ou não naturais, ácidos aminados para outras aplicações de forma relativamente barata. A principal inovação neste método é que os complexos de TM são produzidos e purificados como covalentemente associadas (dissulfureto reticulado) montagens que podem formar estruturas estáveis, estequiométrica e homogéneo, quando reconstituído em lípido detergente, ou outros materiais de membrana-miméticos. Nós também apresentamos procedimentos cuidadosamente otimizados para expressão e purificação que são igualmente aplicáveis ​​se produzir domínios únicos TM ou complexos reticulados e dar conselhos para adaptar estes métodos para novas seqüências TM.

O nível de expressão obtido para fusões trpLE é variável e fortemente dependente da sequência de amino-ácido do péptido ligado. Figura 3 mostra a análise de SDS-PAGE de pré-indução (pista 1) e de tempo de colheita (pista 2) As amostras de uma cultura que produziu aproximadamente 120 mg de puro, fusão trpLE-DAP12TM intacta a partir de 1 litro de cultura e de 4 ml de matriz de níquel. Toda a fusão trpLE-DAP12TM foi localizado para a inserção do corpo de pelotas (pista 4), em oposição ao sobrenadante (pist...

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Este protocolo produz complexos covalentemente estabilizados de peptídeos transmembrana para estudos estruturais destinados a entender como as proteínas de membrana interagem umas com as outras por meio de seus domínios lipídicos incorporados. Primeiro, expresse uma proteína de fusão marcada com hist contendo a sequência transmembrana de interesse em e coli. Em seguida, extraia a proteína da fração do corpo de inclusão usando guiné e detergente usando uma matriz de afinidade de níquel.Concentrar a proteína de fusão marcada com hist e o dissulfeto reticulá-la até à forma diametral, lavando a coluna numa solução contendo agentes oxidantes. Em seguida, elui a proteína de fusão reticulada em ácido acético Tri Fluor e trate com brometo de cianogênio para liberar o parceiro de fusão, prossiga para isolar o produto peptídico reticulado da mistura de digestão por HPLC de fase reversa. Em última análise, a identidade e a pureza dos produtos são verificadas por análises de página SDS e espectrometria de massa.A principal vantagem desta técnica é que complexos sociométricos puros são produzidos para estudos estruturais usando técnicas como solução ou RMN de estado sólido. Mesmo quando dois do

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.

Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

Um protocolo para a síntese de um 1,2-Ditiolano modificado de peptídeo e a caracterização das estruturas supramoleculares resultantes do peptide auto-montagem.

Síntese e caracterização de 1,2-Ditiolano modificado peptídeos auto-montagem

Rica em cisteína peptídeos dobram em distintas estruturas tridimensionais dependendo sua conectividade de dissulfeto. Síntese alvo de isómeros de bissulfeto individual é necessária quando oxidação de reserva não implica que a conectividade de bissulfeto desejado. O protocolo lida com a síntese seletiva de peptídeos 3-bissulfeto-ligado e sua análise estrutural usando estudos NMR e MS/MS.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

Aprenda a produzir complexos peptídicos transmembrana estabilizados por dissulfeto para estudos estruturais usando E. coli e cromatografia de afinidade. Este método permite análises por RMN de solução.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

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