Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Este protocolo produz complexos covalentemente estabilizados de peptídeos transmembrana para estudos estruturais destinados a entender como as proteínas de membrana interagem umas com as outras por meio de seus domínios lipídicos incorporados. Primeiro, expresse uma proteína de fusão marcada com hist contendo a sequência transmembrana de interesse em e coli. Em seguida, extraia a proteína da fração do corpo de inclusão usando guiné e detergente usando uma matriz de afinidade de níquel.

Concentrar a proteína de fusão marcada com hist e o dissulfeto reticulá-la até à forma diametral, lavando a coluna numa solução contendo agentes oxidantes. Em seguida, elui a proteína de fusão reticulada em ácido acético Tri Fluor e trate com brometo de cianogênio para liberar o parceiro de fusão, prossiga para isolar o produto peptídico reticulado da mistura de digestão por HPLC de fase reversa. Em última análise, a identidade e a pureza dos produtos são verificadas por análises de página SDS e espectrometria de massa.

A principal vantagem desta técnica é que complexos sociométricos puros são produzidos para estudos estruturais usando técnicas como solução ou RMN de estado sólido. Mesmo quando dois domínios transmembranares são conhecidos por interagir, a solubilidade do peptídeo e a formação de complexos são frequentemente Começar com um complexo estabilizado covalentemente bem definido pode ampliar significativamente a gama de condições experimentais que podem ser testadas para coleta de dados de alta qualidade.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em lidar com esses fragmentos de proteína extremamente hidrofóbicos. Este protocolo e os conselhos fornecidos no manuscrito que o acompanha são projetados para fornecer uma solução simples para alguns dos desafios mais comuns no processo de previsão e purificação. Palato, uma cultura de um litro de bactérias que expressam a fusão do peptídeo tripa e ressuspendem em 50 mililitros de tampão de lise.

Em seguida, execute três ciclos de sonicação na saída máxima por um minuto e deixe esfriar no gelo por cinco minutos. Colher o material insolúvel do corpo de inclusão por centrifugação a 20 000 g durante 15 minutos de decantação e retirar o sobrenadante. As etapas de sonicação e centrifugação podem ser repetidas se for necessária uma pureza melhorada da fração IB.

Reserve amostras do pellet e do material sobrenadante para análise de página SDS para confirmar a viagem. A localização por fusão de TM em corpos de inclusão agora dissolve os pellets do corpo de inclusão em solução de guiné usando entre 25 e 50 mililitros por litro de cultura. Misture suavemente em temperatura ambiente por várias horas com solação ocasional.

Em seguida, limpe o lisado do corpo de inclusão por centrifugação a 75.000 a 100.000 vezes G por uma hora. À temperatura ambiente, filtre o supernat através de uma membrana de 0,2 mícron em um tubo cônico de 50 mililitros. Combine o lisado de corpo de inclusão limpo com resina de afinidade de níquel que foi equilibrada em solução guine para ligação em lote.

Misture a suspensão suavemente durante a noite em temperatura ambiente. Carregue a suspensão de resina de níquel lisado do corpo de inclusão em uma coluna de fluxo de gravidade vazia com suporte de leito poroso até que todo o volume flua. Colete e coloque de lado o fluxo através do qual ainda pode conter proteína de fusão não ligada.

Em seguida, lave a resina de níquel por gravidade. Escoamento com cinco volumes de leito de solução de ureia contendo mercaptoetanol de feixe de cinco milimolares. Efectuar uma segunda lavagem sem mercaptoetanol de feixe para a terceira lavagem.

Use solução de ureia suplementada com sulfato de cobre e glutationa oxidada. Em seguida, feche a saída da coluna e incube 30 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação máxima de ligações de dissulfeto. Lave a solução de ureia oxidante com 10 volumes de leito de água.

Em seguida, aplique uma linha de vácuo para secar o leito da coluna e feche a saída da coluna. Agora, em uma capa de segurança química, adicione 1,5 volumes de leito de TFA puro, mexa a resina de níquel com uma pequena espátula para garantir uma exposição uniforme ao ácido e incube por cinco minutos. Colete o eluato ácido pressurizando suavemente com uma linha de ar comprimida, se necessário, para empurrar todo o líquido.

Repita a etapa de diluição ácida com outros 1,5 volumes de leito de TFA puro Para medir o rendimento da proteína, faça a diluição do TFA EIT em trifluoroetanol e meça a absorvência em 280 nanômetros contra A-T-F-A-T-E. Dilua o ácido elu até 80% da concentração final de TFA gota a gota. Adição de água enquanto mistura suavemente.

Se você precipitar formas, adicione de volta uma pequena quantidade de TFA até que a solução clareie. Em seguida, recorrija para 80% com água. Reserve uma amostra de pré-digestão de cinco microlitros para análise de página SDS e congele-a imediatamente em nitrogênio líquido.

Em seguida, pese os cristais de brometo de cianogênio por aproximadamente 0,2 gramas por mililitro de amostra. Tomando cuidado para pesar o produto químico tóxico com segurança. Adicionar o brometo de cianogénio à amostra numa capa de segurança e misturar delicadamente até dissolver completamente.

Agora lave o recipiente de reação dentro do selo de gás inerte e incube por três a quatro horas em temperatura ambiente protegido da luz. Reserve uma amostra de cinco microlitros pós-digestão para análise de página SDS, congelando-a imediatamente em nitrogênio líquido e liofiliza-a junto com a amostra de pré-digestão. Em seguida, transfira a reação de digestão para um de diálise de celulose regenerada, permitindo um aumento significativo no volume.

Dialise a amostra durante a noite contra quatro litros de água no capuz químico feminino. Na manhã seguinte, remover a solução de reação dialisada com precipitado de proteína em suspensão do de diálise e transferir a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, congele e liofilize a amostra por vários dias para remover a água e quaisquer vestígios de cianogênio, brometo e TFA dissolvam até 100 miligramas de produtos digeridos liofilizados em três mililitros de mistura de ácido fórmico puro até que a solução clareie completamente.

Colocar a amostra numa coluna de balança preparativa zoax SB 300 C3 num fluxo de solvente A utilizando um laço de amostra de cinco mililitros. Em seguida, eluir os produtos do digerido num gradiente de solvente B, sobre pelo menos cinco volumes de coluna. Analise as frações de HPLC por página SDS e espectrometria de massa MALDI TOF para identificar as espécies de interesse e confirmar sua liofilização em massa esperada.

As fracções de HPLC que contêm o produto peptídico reticulado. Se o produto secar até se transformar em um filme em vez de um pó, ele pode ser dissolvido novamente em um pequeno volume de HFIP congelado em líquido e liofilizado. Novamente, o resultado será um cone branco fofo que é facilmente derrubado e pesado Uma sequência de DNA que codifica as regiões transmembrana e sinalizadora da molécula de sinalização transmembrana do receptor imunológico.

O DAP 12 foi clonado no vetor peptídico PMM usando os locais de restrição Hindi três e BAM H um. A construção de expressão bacteriana resultante produz uma proteína de fusão de viagem marcada com resíduos internos exclusivos de metionina e cistina para clivagem de brometo de cianogênio e reticulação oxidativa. O nível de expressão alcançado para fusões de tripas varia dependendo da sequência de aminoácidos do peptídeo anexado.

Esta preparação rendeu aproximadamente 120 miligramas de proteína de fusão intacta pura de um litro de cultura e quatro mililitros de matriz de níquel. Após a lise celular, a proteína de fusão foi localizada no pellet do corpo de inclusão. Aproximadamente 70% da fusão DAP 12 TM da tripa purificada com níquel foi dissulfeto reticulado à forma DME.

Embora os produtos peptídicos DAP 12 TM não sejam facilmente identificáveis no total de amostras de digestão de brometo de cianogênio, a comparação das bandas intactas de fusão e fragmento de viagem na amostra de digestão reduzida indica que a digestão da fusão foi aproximadamente 60% completa nesta separação típica de produtos de digestão. Em uma coluna C3 em escala preparativa usando HPLC de fase reversa, os produtos ligados aludiram em um gradiente de dois estágios do solvente B. O produto peptídico reticulado de sulfeto diss é identificável na análise de página SDS das principais frações de HPLC sob condições não redutoras e redutoras. A análise de espectrometria de massa de Maldi tof confirma a identidade do peptídeo deme no pico quatro com o produto principal em 6729,2 Daltons.

Não se esqueça de que trabalhar com brometo de cianogênio, solventes orgânicos e ácidos concentrados pode ser extremamente perigoso. Equipamento de proteção adequado deve ser usado durante a execução desses procedimentos e o brometo de cianogênio nunca deve ser manuseado fora da capa de segurança química aprovada. Esta técnica forneceu o principal material de estudo para três estruturas diferentes de solução n mr de complexos peptídicos transmembranares, demonstrando como os receptores imunes de múltiplas subunidades se reúnem por meio de interações proteicas dentro da membrana dos linfócitos.

Acreditamos que a aplicação desta técnica será igualmente valiosa para outros sistemas de proteínas de membrana.