Name: Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a marcar neurônios individuais no sistema nervoso central de embriões de Drosophila melanogaster usando corante lipofílico e microscopia confocal. Esta técnica permite visualizar a morfologia neuronal em contextos de expressão de GFP.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do DFG GMT

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<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
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<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Uma grande vantagem da Drosophila como sistema modelo é que ele permite a análise do desenvolvimento e função do nível de células únicas. Isto é especialmente útil em relação ao sistema nervoso, onde a diversidade de tipos de células é excepcionalmente elevada e a função e morfologia de células vizinhas pode ser totalmente diferente. O método que apresentamos aqui permite a marcação de neurónios individuais, com um corante que pode ser transformada em uma mancha permanente ou examin...

O conhecimento da morfologia neuronal ao nível das células individuais é um requisito chave para a compreensão da conectividade neuronal e função do SNC. Assim, desde os primeiros dias da neurociência, os pesquisadores têm procurado desenvolver técnicas única célula de rotulagem (ver 7 para um tratamento histórico da questão). Os métodos clássicos, tais como a coloração de Golgi proporcionar excelente resolução da morfologia neuronal, mas não são adequados, se se procura identificar um tipo específico de neurónios de uma forma dirigida, tal como a coloração ocorre de uma forma aleatória. O desenvolvimento de métodos para a coloração de células isoladas através de injecção intra celular ou juxtacellular de corantes a partir de um microeléctrodo dirigida a exigência de rotulagem específico. A aplicação de uma única injecção de corante para neurónio Drosophila apresentou um desafio importante, devido ao tamanho pequeno de tanto o organismo e dos seus neurónios. No entanto, a coloração único neurónio de Drosophila embrionárias </em&gt; Neurônios foi alcançado em meados dos anos 1980 no laboratório de Corey Goodman 15. Enquanto o método tem sido eminentemente útil e forneceu algumas informações importantes sobre mecanismos de desenvolvimento neuronal em Drosophila ao longo dos últimos 20-30 anos (por exemplo, 2, 10), muitos trabalhadores têm se esquivado de que, em grande parte por causa de suas exigências técnicas. A disponibilidade nos anos mais recentes de técnicas genéticas para a rotulagem de neurônios em Drosophila também tem contribuído para a impopularidade da injeção único neurônio corante. Expressão GAL4-dirigido de construções de membrana-alvo GFP pode fornecer excelente resolução de morfologia neural 1, 20. No entanto, este método tem certas limitações: a expressão muitas vezes inevitável da GFP em células múltiplas podem obscurecer a estrutura de neurónios individuais e um condutor da linha de GAL4 pode não estar disponível para conduzir a expressão de um neurónio particular de interesse. O MarcM (Análise de mosaico com um representantemarcador de células ressible) Método 8 pode fornecer a rotulagem de qualquer neurónio essencialmente ao nível da célula individual, mas não pode ser utilizada com sucesso no embrião e larvas cedo por causa da rotação lenta da proteína GAL80. Dadas estas limitações de rotulagem genética, acreditamos que a injecção de corante único neurónio no embrião de Drosophila continua a ser uma técnica valiosa e merece uma aplicação mais ampla. Para promover este objectivo, oferecemos aqui uma descrição detalhada do método. Uma ilustração de sua energia é fornecida pela nossa recente de conta a morfologia do conjunto completo de interneurônios neuromeres abdominais do embrião de Drosophila tardio 14. Neste estudo, o que revelou a variabilidade tanto morfológica individuais tipos de células neuronais e os princípios da organização neuromere no SNC do embrião, não teria sido possível com qualquer outro método de marcação disponíveis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml em 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Sondas Invitrogen / Molecular </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml em etanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldeído</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% em PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glicerina </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% em PBS </td></tr><tr><td> Heptano Cola </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> diluir ca. 1 a 1 com n-heptano </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> para visualizar e documentar bulas de fluorescência </td></tr><tr><td> DC - ummplifier </td><td> Dragan Corporação </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> para preparar e disect embriões </td></tr><tr><td> Plana Capilares </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> diâmetro exterior 1 mm; glas espessura 0,1 milímetros </td></tr><tr><td> Injeção Capilares </td><td> Produtos ciência </td><td> 100 GB TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> R micromanipulador </td><td> Leica </td><td></td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Modelo P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> para puxar capilares </td></tr><tr><td> Slides objeto </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio científica </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> para ver bulas após fotoconversão </td></tr><tr><td> Microscópio científica </td><td> Olimpo </td><td> BX50 </td><td> para executar as bulas </td></tr><tr><td> Câmera de vídeo Sony MC3255 </td><td> Sony / AVT Chifre </td><td> Sony MC3255 </td><td> para gravar rotulamentos após fotoconversão </td></tr></tbody></table> Tabela 1.

marcação de células individuais no sistema nervoso central de<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Neste artigo vamos descrever como individualmente rotular neurônios no sistema nervoso central embrionário de Drosophila melanogaster por injecção juxtacellular do DiI marcador fluorescente membrana lipofílica. Este método permite a visualização da morfologia das células neuronais em grande detalhe. É possível marcar qualquer célula no sistema nervoso central: os corpos celulares dos neurónios-alvo são visualizadas sob óptica DIC ou por expressão de um marcador fluorescente tal como GFP genética. Após a marcação, o DiI pode ser transformado em um castanho mancha permanente por fotoconversão para permitir a visualização da morfologia das células, com luz transmitida e óptica DIC. Alternativamente, as células marcadas com DiI pode ser observada directamente em microscopia confocal, permitindo geneticamente introduzidos proteínas repórter fluorescentes a ser colocalised. A técnica pode ser usada em qualquer animal, independentemente do genótipo, tornando possível a análise fenótipos mutantes a resolução de células simples.

A Figura 4 ilustra os resultados típicos da técnica, é descrita aqui. Figura 4A mostra um exemplo de um interneurônio DiI cheio único que foi limpa photoconverted. Ele demonstra muito bem a quantidade de detalhes estas oferecem preparações. Quando visto sob óptica DIC contexto espacial da célula marcada no interior do tecido não-rotulada envolvente se torna visível, por exemplo, a posição do corpo da célula dentro do córtex e da projecção de fibras dentro do neurópilo. <p c...

Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões, o que permite a análise da morfologia neuronal ou por luz transmitida ou microscopia confocal.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular neurônios individuais no sistema nervoso central de embriões de drosófila em estágio inicial 17. Isso é feito coletando ovos e permitindo que eles se desenvolvam até o estágio certo. A segunda etapa do procedimento é clorar e alinhar manualmente os ovos.Seguindo essa diva, a colonização e o filete dos embriões tornam o cordão nervoso acessível. A etapa final é marcar células individuais por aplicação ionoretica do olho da matriz lipofílica. Em última análise, os resultados permitem a visualização da morfologia de um único neurônio, se desejado, no contexto de padrões de expressão de GFP conhecidos e/ou em fundo mutante.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de rotulagem de células únicas, como o markum, é que ela funciona no embrião e permite visualizar células identificadas intencionalmente. A demonstração visual desse método é extremamente útil, pois muitas etapas são delicadas e, portanto, difíceis de aprender. Permita que moscas saudáveis ponham embriões em placas de ágar.Substitua a placa a cada uma hora e meia a 25 graus Celsius e retenha os embriões. Incubar os embriões em suas placas a 25 ou 18 graus Celsius até que atinjam o estágio de desenvolvimento necessário. Quando estiver pronto, transfira os embriões para uma lâmina coberta com fita adesiva dupla face.Evite transferir qualquer ágar com os embriões, pois isso interferirá na sua adesão à fita. Na fita. Deixe os embriões secarem por cinco a 10 minutos enquanto espera.Cubra uma lamínula de 24 milímetros por 60 milímetros com cola de heptano. Coloque uma pequena gota de cola no centro da lâmina e espalhe-a em uma película muito fina usando uma lamínula quadrada de 18 milímetros. Depois que os embriões secarem, toque-os suavemente com uma agulha.O córion se abrirá e o embrião grudará na agulha. Transfira imediatamente os embriões desclorados para um bloco de ágar para evitar que sequem. Alinhe-os 10 em uma fileira, com os lados ventrais para cima.Corte o excesso de ágar do bloco com um bisturi. Em seguida, toque suavemente os embriões com a lamínula revestida com cola de heptano. Eles devem aderir à lamínula com os lados ventrais voltados para baixo.Aplique uma moldura de fita adesiva ao redor da lamínula e prenda-a a uma lâmina de microscópio. Manter os embriões em cima da lamínula. Cubra os embriões com quantidades generosas de PBS no lado dorsal de cada embrião, perto de sua extremidade posterior.Penetre na membrana vitel com uma agulha de vidro, rasgue a membrana ao longo da linha média dorsal e arraste o embrião para fora da membrana. Agora reoriente o lado ventral do embrião para baixo em outro lugar no substrato de cola de heptano. Lixe o embrião com uma agulha de vidro, perfurando suavemente a parede do corpo e rasgando ao longo da linha média dorsal.Usando a agulha, empurre a parede do corpo para baixo para que ela grude na lâmina. Rasgue o intestino em suas extremidades anterior e posterior e levante o intestino. Como vários embriões serão arquivados na mesma lâmina, é útil ser muito preciso com sua orientação ou fazer um desenho de sua orientação.Em seguida, os embriões podem ser levemente fixados por 10 a 15 minutos em 7,4% de formaldeído em PBS, seguido de quatro lavagens em PBS, com extremo cuidado para evitar tocar os embriões na superfície da solução. As forças de tensão superficial irão destruí-los sob um objetivo de 10 x. Centralize o campo de visão em um embrião preparado, aumente a ampliação e localize a célula de interesse sob óptica DIC ou sob fluorescência.Se a célula-alvo expressar GFP, certifique-se de que o diafragma de campo do microscópio esteja aberto apenas até a borda do campo de view, não além de uma iluminação estreita. O feixe ajudará no posicionamento da micropipeta de volta para a objetiva de 10 x e colocará o eletrodo de banho para o amplificador CC na solução longe do embrião e do caminho da micropipeta. Monte a micropipeta de injeção cheia de solução de cloreto de lítio no suporte e conecte-a ao micromanipulador.Usando os controles de curso, posicione a micropipeta abaixo da objetiva e bem acima do embrião. Se o ângulo do micro peppe for muito íngreme, a ponta não entrará em foco. Se for muito raso, o eixo irá sujar contra a parede do banho centralizar a ponta no campo de visão.Agora abaixe a micropipeta e concentre-se alternadamente até que a pipeta esteja no PBS e não muito acima do embrião. Agora mude para a objetiva de alta potência e centralize a pipeta dentro do campo de visão. Quando o eixo estiver em foco, mova a micropipeta no eixo X até que sua ponta fique no centro do campo de visão.A ponta da micropipeta deve estar bem acima do nível do embrião. Mude para a iluminação de fluorescência e examine a ponta. Verifique se há vazamento no olho de corante.Ajuste a corrente CC para que o cristal do olho de corante não se acumule na ponta. Agora abaixe a micropipeta no eixo Z em direção ao embrião. Ajustando progressivamente o foco à medida que o embrião entra em foco.Mude para usar o controle fino. Concentre a célula a ser injetada no centro do campo e, em seguida, concentre-se novamente na ponta da micropipeta. A partir deste ponto, pode ser mais conveniente usar o controle de estágio do microscópio para mover o embrião em relação à micropipeta.Coloque a ponta da micropipeta em contato com a célula e faça uma depressão em sua superfície. Passe vários nano amperes de corrente despolarizante por alguns segundos. Um pequeno cristal de olho de corante se formará na célula para confirmar que a célula foi marcada.Abra brevemente o obturador para iluminar o campo com luz fluorescente. Se o corpo da célula mostrar sinais de rotulagem, aplique corrente por mais alguns segundos. Em seguida, desligue a corrente e puxe rapidamente o embrião para longe da micropipeta usando os controles de estágio.Se nenhuma marcação do olho D for evidente, a micropipeta pode ter sido bloqueada e precisa ser substituída. Se a ponta da pipeta prender outros tecidos na raiz da célula e manchar esse tecido, tente retirar ligeiramente a micropipeta e reaproximar a célula antes de recorrer à substituição da micropipeta conforme necessário. Continue rotulando outras células no mesmo embrião ou em outros embriões na mesma lâmina.Mova a ponta para a borda do campo de visão e repita o procedimento. Remova a maior parte da solução na câmara de injeção. Em seguida, fixe os embriões adicionando 7,4% de formaldeído PBS por 10 minutos, seguido de quatro lavagens com PBS.A preparação agora pode ser fotoconvertida ou montada para microscopia confocal usando o protocolo descrito. Um interneurônio cheio de dai foi perfeitamente convertido em fotos sob a ótica DIC. O contexto espacial da célula marcada dentro do tecido circundante não marcado foi bem resolvido.Por exemplo, as posições do corpo celular dentro do córtex e da projeção da fibra dentro da neuropílula podem ser vistas nesta preparação. A gota de tinta era um pouco grande demais. Várias células vizinhas foram marcadas simultaneamente, o que torna difícil relacionar projeções individuais a corpos celulares distintos.Observe também que, sob o microscópio fluorescente, a resolução de fundo é muito menor sem conversão de fotos. Várias células em segmentos vizinhos também podem ser injetadas nesta preparação, um anticorpo contra duas manchas rápidas de fales na neuropílula. Apesar dos corpos celulares claros, a preparação mostra um possível efeito colateral de períodos prolongados de fotoconversão.As células mais intensamente marcadas tendem a ficar mais coradas e começam a inchar em comparação com a marcação de uma única célula com óptica confocal. A marcação de corantes oculares em embriões que carregam construções repórter GFP pode fornecer contexto espacial e identidade da célula preenchida com D dentro de populações específicas de tipos de células neuronais ou gliais positivas para GFP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e realizar rotulagens de neurônios individuais no SNC embrionário após oph.Mas, ao tentar este procedimento, lembre-se de que cada etapa é exigente, portanto, espere algumas repetições até que todo o procedimento ocorra sem problemas.

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Neste artigo vamos demonstrar como dissecar o sistema nervoso central do terceiro instar as larvas Drosophila.

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Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de um cérebro transgênico de Drosophila para imagens de células gliais de células únicas. O cérebro expressa proteínas direcionadas à membrana fundidas com diferentes combinações de epítopos antigênicos sob o controle de um sistema de recombinase específico da glia. Os cérebros isolados e fixados são corados com anticorpos primários específicos para os epítopos antigênicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo.

Coloração por imunofluorescência de cérebros de Drosophila para a imagem de célula única de células gliais

Fonte: Inal, M. A. et. al., Rastreamento retrógrado de Drosophila neurônios motores embrionários usando corantes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o método de rotulagem retrógrada de Drosophila neurônios motores usando corantes lipofílicos. O corante entra no axônio, viaja retrógrada e rotula os neurônios em verde, permitindo a visualização detalhada de sua morfologia e projeções sob um microscópio confocal.

Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Este artigo descreve um protocolo eficiente de dissecação imaginária de discos e coloração de anticorpos, econômico com reagentes e facilita o manuseio de discos imaginários em pequenas quantidades.

Dissecação em pequena escala e coloração por anticorpos de discos imaginários antenas oculares e das asas de Drosophila melanogaster

Aprenda a marcar neurônios individuais no sistema nervoso central de embriões de Drosophila melanogaster usando corante lipofílico e microscopia confocal. Esta técnica permite visualizar a morfologia neuronal em contextos de expressão de GFP.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de

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