Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de

O objetivo geral deste procedimento é rotular neurônios individuais no sistema nervoso central de embriões de drosófila em estágio inicial 17. Isso é feito coletando ovos e permitindo que eles se desenvolvam até o estágio certo. A segunda etapa do procedimento é clorar e alinhar manualmente os ovos.

Seguindo essa diva, a colonização e o filete dos embriões tornam o cordão nervoso acessível. A etapa final é marcar células individuais por aplicação ionoretica do olho da matriz lipofílica. Em última análise, os resultados permitem a visualização da morfologia de um único neurônio, se desejado, no contexto de padrões de expressão de GFP conhecidos e/ou em fundo mutante.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes de rotulagem de células únicas, como o markum, é que ela funciona no embrião e permite visualizar células identificadas intencionalmente. A demonstração visual desse método é extremamente útil, pois muitas etapas são delicadas e, portanto, difíceis de aprender. Permita que moscas saudáveis ponham embriões em placas de ágar.

Substitua a placa a cada uma hora e meia a 25 graus Celsius e retenha os embriões. Incubar os embriões em suas placas a 25 ou 18 graus Celsius até que atinjam o estágio de desenvolvimento necessário. Quando estiver pronto, transfira os embriões para uma lâmina coberta com fita adesiva dupla face.

Evite transferir qualquer ágar com os embriões, pois isso interferirá na sua adesão à fita. Na fita. Deixe os embriões secarem por cinco a 10 minutos enquanto espera.

Cubra uma lamínula de 24 milímetros por 60 milímetros com cola de heptano. Coloque uma pequena gota de cola no centro da lâmina e espalhe-a em uma película muito fina usando uma lamínula quadrada de 18 milímetros. Depois que os embriões secarem, toque-os suavemente com uma agulha.

O córion se abrirá e o embrião grudará na agulha. Transfira imediatamente os embriões desclorados para um bloco de ágar para evitar que sequem. Alinhe-os 10 em uma fileira, com os lados ventrais para cima.

Corte o excesso de ágar do bloco com um bisturi. Em seguida, toque suavemente os embriões com a lamínula revestida com cola de heptano. Eles devem aderir à lamínula com os lados ventrais voltados para baixo.

Aplique uma moldura de fita adesiva ao redor da lamínula e prenda-a a uma lâmina de microscópio. Manter os embriões em cima da lamínula. Cubra os embriões com quantidades generosas de PBS no lado dorsal de cada embrião, perto de sua extremidade posterior.

Penetre na membrana vitel com uma agulha de vidro, rasgue a membrana ao longo da linha média dorsal e arraste o embrião para fora da membrana. Agora reoriente o lado ventral do embrião para baixo em outro lugar no substrato de cola de heptano. Lixe o embrião com uma agulha de vidro, perfurando suavemente a parede do corpo e rasgando ao longo da linha média dorsal.

Usando a agulha, empurre a parede do corpo para baixo para que ela grude na lâmina. Rasgue o intestino em suas extremidades anterior e posterior e levante o intestino. Como vários embriões serão arquivados na mesma lâmina, é útil ser muito preciso com sua orientação ou fazer um desenho de sua orientação.

Em seguida, os embriões podem ser levemente fixados por 10 a 15 minutos em 7,4% de formaldeído em PBS, seguido de quatro lavagens em PBS, com extremo cuidado para evitar tocar os embriões na superfície da solução. As forças de tensão superficial irão destruí-los sob um objetivo de 10 x. Centralize o campo de visão em um embrião preparado, aumente a ampliação e localize a célula de interesse sob óptica DIC ou sob fluorescência.

Se a célula-alvo expressar GFP, certifique-se de que o diafragma de campo do microscópio esteja aberto apenas até a borda do campo de view, não além de uma iluminação estreita. O feixe ajudará no posicionamento da micropipeta de volta para a objetiva de 10 x e colocará o eletrodo de banho para o amplificador CC na solução longe do embrião e do caminho da micropipeta. Monte a micropipeta de injeção cheia de solução de cloreto de lítio no suporte e conecte-a ao micromanipulador.

Usando os controles de curso, posicione a micropipeta abaixo da objetiva e bem acima do embrião. Se o ângulo do micro peppe for muito íngreme, a ponta não entrará em foco. Se for muito raso, o eixo irá sujar contra a parede do banho centralizar a ponta no campo de visão.

Agora abaixe a micropipeta e concentre-se alternadamente até que a pipeta esteja no PBS e não muito acima do embrião. Agora mude para a objetiva de alta potência e centralize a pipeta dentro do campo de visão. Quando o eixo estiver em foco, mova a micropipeta no eixo X até que sua ponta fique no centro do campo de visão.

A ponta da micropipeta deve estar bem acima do nível do embrião. Mude para a iluminação de fluorescência e examine a ponta. Verifique se há vazamento no olho de corante.

Ajuste a corrente CC para que o cristal do olho de corante não se acumule na ponta. Agora abaixe a micropipeta no eixo Z em direção ao embrião. Ajustando progressivamente o foco à medida que o embrião entra em foco.

Mude para usar o controle fino. Concentre a célula a ser injetada no centro do campo e, em seguida, concentre-se novamente na ponta da micropipeta. A partir deste ponto, pode ser mais conveniente usar o controle de estágio do microscópio para mover o embrião em relação à micropipeta.

Coloque a ponta da micropipeta em contato com a célula e faça uma depressão em sua superfície. Passe vários nano amperes de corrente despolarizante por alguns segundos. Um pequeno cristal de olho de corante se formará na célula para confirmar que a célula foi marcada.

Abra brevemente o obturador para iluminar o campo com luz fluorescente. Se o corpo da célula mostrar sinais de rotulagem, aplique corrente por mais alguns segundos. Em seguida, desligue a corrente e puxe rapidamente o embrião para longe da micropipeta usando os controles de estágio.

Se nenhuma marcação do olho D for evidente, a micropipeta pode ter sido bloqueada e precisa ser substituída. Se a ponta da pipeta prender outros tecidos na raiz da célula e manchar esse tecido, tente retirar ligeiramente a micropipeta e reaproximar a célula antes de recorrer à substituição da micropipeta conforme necessário. Continue rotulando outras células no mesmo embrião ou em outros embriões na mesma lâmina.

Mova a ponta para a borda do campo de visão e repita o procedimento. Remova a maior parte da solução na câmara de injeção. Em seguida, fixe os embriões adicionando 7,4% de formaldeído PBS por 10 minutos, seguido de quatro lavagens com PBS.

A preparação agora pode ser fotoconvertida ou montada para microscopia confocal usando o protocolo descrito. Um interneurônio cheio de dai foi perfeitamente convertido em fotos sob a ótica DIC. O contexto espacial da célula marcada dentro do tecido circundante não marcado foi bem resolvido.

Por exemplo, as posições do corpo celular dentro do córtex e da projeção da fibra dentro da neuropílula podem ser vistas nesta preparação. A gota de tinta era um pouco grande demais. Várias células vizinhas foram marcadas simultaneamente, o que torna difícil relacionar projeções individuais a corpos celulares distintos.

Observe também que, sob o microscópio fluorescente, a resolução de fundo é muito menor sem conversão de fotos. Várias células em segmentos vizinhos também podem ser injetadas nesta preparação, um anticorpo contra duas manchas rápidas de fales na neuropílula. Apesar dos corpos celulares claros, a preparação mostra um possível efeito colateral de períodos prolongados de fotoconversão.

As células mais intensamente marcadas tendem a ficar mais coradas e começam a inchar em comparação com a marcação de uma única célula com óptica confocal. A marcação de corantes oculares em embriões que carregam construções repórter GFP pode fornecer contexto espacial e identidade da célula preenchida com D dentro de populações específicas de tipos de células neuronais ou gliais positivas para GFP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e realizar rotulagens de neurônios individuais no SNC embrionário após oph.

Mas, ao tentar este procedimento, lembre-se de que cada etapa é exigente, portanto, espere algumas repetições até que todo o procedimento ocorra sem problemas.