Name: Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante Drosophila Embriogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a imagem ao vivo do apuramento celular por apoptose em embriões de Drosophila usando microscopia confocal. Este método permite monitorar dinamicamente fagócitos e células apoptóticas em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado por uma Marie Curie Reintegração Grant (IRG249084). Agradecemos a todos os membros do laboratório Kurant.

Para seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo duas populações de células deve ser rotulada: células fagocitárias e células apoptóticas. Para marcar populações de células fagocíticas usamos uma linha de Drosophila que contém o marcador simular cytGFP, que rotula as células fagocíticas exclusivamente no embrião: macrófagos, células gliais e ectoderma 8. Pode-se usar diferentes marcadores de células fagocíticas, incluindo linhas contendo um driver Gal4 específico hemocyte (CRQ-Gal4) ou glia específico Gal4 condutor (repo-Gal4) e um repórter fluorescente geneticamente codificado sob controle UAS (uas-GFP). Para monitorar as células apoptóticas durante a remoção de células apoptóticas usamos diferente apoptose / marcadores de fagocitose. A anexina V (Molecular Probes), que serve como um marcador precoce de células apoptóticas 10; Phiphilux (OncoImmunin) é um f luorogénico de substrato caspase-3, o qual é utilizado como um apopto depoissis marcador e Lyso Tracker (Molecular Probes) funciona como um marcador phagosome. Nós injetar estes reagentes usando o sistema de microinjeção PicoPump PV 820. 1. Preparando-se <ol><li> Heptano cola: Desenrole a fita dupla face e colocar tanto quanto você pode em um frasco de cintilação, encha com heptano, vedar o frasco com Parafilm e rock por 24 horas. Adicionar heptano se a cola é muito espesso. </li><li> Nós permitimos que as moscas para colocar em uma placa de ágar suco de uva pré-aquecido + levedura colar de 2 horas, e depois transferir a placa a 25 ° C por 10-12 horas (depende do estágio desejado) antes da microinjeção e gravações lapso de tempo de embriões injetados. Nós recolher embriões a partir das placas de agar mantido a 25 ° C, proporcionando, assim, a partir de embriões de estágio de 15 ou 16 anos de desenvolvimento. </li><li> Preparação da agulha: Para preparar agulhas para injeção, nós usamos um &quot;instrumento Sutter &#39;extrator de agulhas e finos filamentos de vidro de paredes (tubo capilar FHC). A ponta do capilar agrupada está quebradon a um diâmetro de 0,5-2 mM. </li><li> Lamela com cola: Utilizando uma ponta de pipeta de dispersar uma gota de cola de heptano numa linha no meio da lamela. Deixe secar por alguns segundos. Prepare algumas dessas lamelas. </li></ol> 2. Preparação embrião <ol><li> Coletar embriões a partir de placas de ágar e transferi-los para um filtro de células (SPL Life Sciences), utilizando um pincel limpo e água corrente. O filtro é realizada ao longo de um copo para recolher águas residuais. </li><li> Lavar os embriões no filtro de células usando água até que toda a pasta de levedura é removida. </li><li> Seca-se o excesso de água, limpando o exterior do filtro utilizando Kimwipes. </li><li> Colocar o filtro de células numa placa de Petri limpo e adicionar 50% de branqueador suficiente para cobrir os embriões no filtro celular. Dechorionate os embriões para 2 min ocasionalmente (2-3 vezes), misturando-os. </li><li> Enxágüe com água extensivamente até embriões soltos o odor lixívia. </li><li> Coloque o filtro de células em um ambiente limpoPlaca de Petri e cobrir os embriões com água para evitar ressecamento. </li><li> Antes de iniciar a configuração embriões, carregar 1 ul do reagente desejado para as duas agulhas (por vezes, uma agulha pode ser obstruído). Demora cerca de 5 min para o líquido atinja a ponta da agulha. </li><li> Corte um pedaço retangular de ágar suco de uva e coloque-o sobre uma lâmina de microscópio. Transferência de embriões dechorionated da placa de Petri para a peça de agar usando um pincel limpo. </li><li> Sob um microscópio de dissecção fluorescente seleccionar adequadamente encenado embriões que expressam o marcador GFP usando um pincel molhado e colocar cada embrião perto da borda da peça de ágar numa linha um após o outro (Figura 1A). Os embriões devem ser colocadas com o lado ventral para cima para a fagocitose imagiologia por glia no Sistema Nervoso Central (SNC). </li><li> Configure cerca de 10 embriões em uma linha. </li><li> Anexar os embriões para uma lamela revestida no meio, com uma tira de cola heptano (Figura 1B, C </strong&gt;). </li><li> Coloque a lamela na câmara de desidratação por aproximadamente 5 minutos (isso depende da umidade da sala ea quantidade a ser injetada). </li><li> Após a secagem até cobrir os embriões com óleo halocarbono 700 (Sigma) para evitar a desidratação. </li><li> Coloque a lamela numa lâmina de microscópio com os embriões voltados para cima. Você pode colocar uma gota de água sobre a lâmina para evitar que se deslocam da lamela. Os embriões estão prontos para injeção. Local de injecção é tipicamente na face lateral no meio do embrião. </li></ol> 3. Injeção de embrião <ol><li> Coloque a agulha de um micromanipulador. </li><li> Para quebrar a ponta da agulha de colocar a extremidade da lamela no campo de visão e ajustar a agulha para o mesmo plano focal. Muito se mover cuidadosamente a lamela até atingir a ponta da agulha e quebra. </li><li> Incidindo sobre os embriões, coloque a agulha no óleo e certifique-se de obter uma gota de líquido da agulha. Isso significa que a ponta da agulha foiassim quebrada. </li><li> Sem tocar o suporte de agulha move o embrião dentro da agulha e injectar uma gota para o embrião. Mova o embrião longe e avançar para a próxima até que todos os embriões são injetados. </li></ol> 4. Imagem Nós imagem os embriões em um microscópio confocal invertido com objetiva de 40X ou 100X. Procuramos um embrião bem posicionado com o sistema nervoso central, no meio, o que demonstra uma forte expressão da GFP e uma boa marcação das células apoptóticas após a injecção. Para o período de gravações lapso de embriões vivos costumamos escolher 5 ou 6 fatias confocal (2 mm de espessura cada). Depois, fazemos uma projecção de 3 fatias (6 m de espessura), a fim de observar as células inteiras. Nós usamos marcadores de células em apoptose, que são estáveis ​​e não lixívia facilmente. Para evitar GFP branqueamento fazemos gravações em intervalos de 60 seg. Em alguns casos, os embriões podem começar a rolardurante o tempo de gravação de vídeo. Portanto, vamos dar uma olhada de vez em quando na gravação, a fim de parar e começar de novo, se necessário.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Desembaraço celular por apoptose é um último estágio crítico de apoptose, que é altamente dinâmico. Portanto, estudos sobre o processo em tempo real são de extrema importância. Aqui nós descrevemos um protocolo que permite o monitoramento de folga celular por apoptose no desenvolvimento de embriões de Drosophila vivendo. Neste processo, duas populações de células deve ser marcado com marcadores específicos: células apoptóticas e fagócitos. O repórter simular cytGFP é adequado para monitorizar fagocític...

A eliminação adequada de células indesejadas ou aberrante através de apoptose e fagocitose subsequente é crucial para o desenvolvimento embrionário, bem como para a homeostase dos tecidos no adulto. A fagocitose de células apoptóticas ou na depuração de células apoptóticas é um processo altamente dinâmico, que prossegue em quatro passos: (1) o recrutamento de fagócitos para a célula apoptótica (&#39;encontrar-me&#39;), (2) reconhecimento da célula como um alvo para a fagocitose ( &#39;comer-me&#39;) e (3) imersão, seguido de (4) e da maturação do fagossoma e degradação da partícula apoptótica 1-5. Existem dois tipos de fagócitos: macrófagos &quot;profissionais&quot; e as células dendríticas imaturas, e os &quot;não-profissional&quot; células vizinhas tecido residentes, que são cruciais para a liberação celular por apoptose durante metazoan desenvolvimento 6,7. No desenvolvimento de Drosophila, a eliminação de células supérfluas por apoptose ocorre em três metrosfases Ain, pela primeira vez em meados da década de embrião e, em seguida, em meados pupa, e novamente na adulta. Durante a embriogênese partículas apoptóticos são removidos por fagócitos &quot;profissionais&quot;, macrófagos e pelo &quot;não-profissional&quot; ectoderma e glia 8,9. No nosso trabalho anterior, identificaram um receptor fagocitária, de seis mícrons, sob (SIMU), que é expresso exclusivamente em células fagocíticas durante a embriogénese. Usando o promotor simulação que gerou um marcador específico para as populações de células fagocíticas (simular cytGFP) que nos permite monitorar macrófagos, ectoderma e glia simultaneamente em um embrião em desenvolvimento ao vivo 8. Além disso, por utilização de marcadores específicos para células apoptóticas em diferentes fases da apoptose, que é capaz de seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagente</td></tr><tr><td>Anexina V </td><td>Sondas Moleculares</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>Sondas Moleculares</td><td>LysoTracker</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Tubo capilar</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo de apuramento celular por apoptose durante<em&gt; drosophila</em&gt; embriogênese

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

A eliminação adequada de células indesejáveis ​​ou aberrante através de apoptose e fagocitose subseqüente (clearance celular por apoptose) é crucial para o desenvolvimento normal em todos os organismos metazoários. Recarga celular por apoptose é um processo altamente dinâmico intimamente relacionado com a morte das células, as células apoptóticas unengulfed são mal vistas in vivo sob condições normais. A fim de compreender as diferentes etapas de depuração de células apoptóticas e comparar os fagócitos &quot;profissionais&quot; - macrófagos e células dendríticas em &#39;não profissional&#39; - células vizinhas tecido residente, in vivo de imagens em directo do processo é extremamente valiosa. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a liberação celular por apoptose em embriões de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica das diferentes etapas da fagocitose usamos marcadores específicos para células em apoptose e fagócitos. Além disso, podemos monitorar dois sistemas em paralelo fagócitos: macrófagos &#39;profissionais&#39; e &#39;semi-profeglia ssional &#39;no sistema nervoso central em desenvolvimento (SNC). O método aqui descrito emprega o embrião de Drosophila como um modelo excelente para estudos de depuração de células apoptóticas em tempo real.

Representativos de fotogramas de um filme em que as células apoptóticas são rotulados com anexina V, e as células gliais, ectoderme e macrófagos são rotulados com simular cytGFP são mostrados na Figura 2. Cada quadro é uma projeção de três fatias de 2 m cada. O embrião de fase 15 está adequadamente posicionada mostrando o SNC embrionárias em meio com células gliais bem marcado (g). Macrófagos (m), que são na sua maioria fora do SNC, mostram forte expressão GFP citop...

Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células apoptóticas<em&gt; In vivo</em&gt;. Este método emprega viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões como um poderoso modelo de monitorização da fagocitose de células apoptóticas através de marcação específica de células apoptóticas e fagócitos.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a dinâmica da eliminação de células apoptóticas no embrião de drosófila. Isso é realizado com moscas transgênicas contendo um marcador GFP citoplasmático, que rotula populações de células fagocíticas. Embriões com o marcador GFP Simio são coletados, lavados e revestidos. Em seguida, os embriões são posicionados para injeção, seguida pelo monitoramento do SNC.O terceiro passo é a marcação de células apoptóticas mediante injeção de embriões com marcadores específicos de fagocitose de apoptose, como um X em cinco; o passo final é realizar gravações em lapso de tempo do SNC embrionário utilizando microscopia confocal. Em última análise, os resultados podem mostrar a localização e o comportamento de células apoptóticas e fagócitos durante diferentes estágios da eliminação de células apoptóticas por meio de microscopia confocal com fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como imunohistoquímica em embriões fixados, é que podemos acompanhar a dinâmica da eliminação de células apoptóticas.A eliminação de células apoptóticas é um processo altamente dinâmico que envolve diversas etapas. Esta técnica permite acompanhar as diferentes etapas utilizando marcadores específicos para células apoptóticas e fagócitos. O protocolo começa com a confecção de uma cola a partir de reagentes convencionais: desenrole uma fita adesiva dupla face, depois enrole-a novamente para ajustá-la a um frasco de cintilação.Encha o frasco com heptano e feche-o com parafina. Em seguida, fixe o frasco a um agitador rotativo e agite suavemente por 24 horas. No dia seguinte, à temperatura ambiente, a cola preparada é transferida para um novo frasco.Use uma pipeta de vidro PE para transferir a cola preparada para um novo recipiente. Após o preparo, use uma ponteira de pipeta para aplicar a cola sobre lamínulas. Disperse uma gota de cola de heptano em uma linha ao longo do centro da lamínula.Deixe a cola secar por alguns segundos. As lamínulas podem então ser armazenadas em temperatura ambiente, dentro de uma caixa fechada, por até um mês, após anestesiar as moscas com dióxido de carbono. Reúna cerca de 400 moscas em um recipiente de coleta com uma placa aquecida de suco de uva para postura, substituída a 25 graus Celsius por duas horas. Colete a placa de suco de uva para postura e cubra o recipiente com uma nova placa para manter as moscas em boas condições.A placa coletada contém embriões com idade entre zero e duas horas. Devolva a placa de ágar com suco de uva contendo os embriões a um incubador a 25 graus Celsius até que atinjam o ponto temporal de desenvolvimento desejado. Neste exemplo, os embriões são incubados entre 10 e 12 horas, de modo que atinjam o estágio 15 ou 16 após seu desenvolvimento.Use água da torneira e um pincel limpo para transferir os embriões da placa para um filtro celular. Mantenha o filtro sobre um recipiente para que quaisquer embriões derramados possam ser recuperados. Enxágue os embriões coletados até que toda a pasta de levedura seja removida.Em seguida, seque a água em excesso limpando a parte externa do funil de filtração. Coloque o funil de filtração em uma placa de Petri limpa para remover completamente o córion. Adicione água sanitária a 50% para cobrir os embriões no funil de filtração e aguarde dois minutos, agitando-os duas a três vezes.Em seguida, enxágue os embriões até que não cheirem mais a água sanitária. Coloque os embriões no recipiente celular em uma placa de Petri limpa e cubra-os com água para evitar que sequem. Para a injeção dos embriões.Prepare previamente as agulhas de injeção utilizando um puxador de agulhas e filamentos de vidro de parede fina. Carregue um microlitro do reagente desejado em duas agulhas, sendo que uma delas servirá como reserva. Um marcador estável que não desbote facilmente, como um X em cinco, constitui um bom reagente.Agora, coloque um pedaço retangular de ágar suco de uva sobre uma lâmina de microscópio. Transfira os embriões do funil para o ágar. Usando um pincel limpo sob um microscópio de dissecação fluorescente, selecione embriões adequadamente estagiados para injeção utilizando o marcador GFP.Usando um pincel úmido, mova os embriões selecionados para uma fileira de 10, com suas faces ventrais voltadas para cima. Posicione a fileira na borda do bloco de ágar. Pode-se observar GFP no sistema nervoso central do embrião.Agora fixe os embriões em uma lamínula com uma tira da cola de heptano. A posição correta dos embriões é muito importante para o sucesso da injeção. Tenha calma e certifique-se de que os embriões estejam alinhados com precisão na orientação adequada.Em seguida, coloque a lamínula na câmara de desidratação por cerca de cinco minutos. Após secar os embriões, cubra-os com óleo de carbono Hello 700 para evitar desidratação adicional. Por fim, coloque uma gota de água em uma lâmina de microscópio.Em seguida, coloque a borda da tampa com os embriões para cima sobre a lâmina de microscópio úmida. Os embriões estão agora prontos para a injeção. Comece acoplando uma agulha a um micromanipulador e à bomba de pico.A bomba controla a quantidade de líquido injetado ao empurrar nitrogênio para dentro da agulha. Um pedal controla a ejeção regulada do nitrogênio sob o microscópio. Foque na ponta da agulha e posicione-a próximo à borda da lamínula, com a ponta da agulha e a lamínula em foco, com muita precisão.Mova a lamínula até que ela atinja a ponta da agulha e a quebre. O diâmetro da abertura deve ser de meio a dois micrômetros. Agora, foque os embriões.Introduza a agulha no óleo. Se a ponta da agulha tiver sido quebrada corretamente, deve haver uma gota de líquido vazando para o óleo. Quando você pressionar o pedal sem tocar o porta-agulhas, mova a platina de modo que a borda lateral do embrião seja perfurada pela agulha.Injete rapidamente uma gota da solução no embrião. Remova o embrião e prossiga para o próximo até que todos os 10 embriões sejam injetados. Imagem os embriões em um microscópio confocal invertido com objetiva de 40 x ou 100 x.Procure um embrião bem posicionado com o SNC no centro, apresentando forte expressão de GFP e marcação de células apoptóticas. Para fazer gravações em lapso de tempo, escolha cinco ou seis cortes confocais para fixar em micrômetros nesses locais. Realize uma varredura a cada 60 segundos, um intervalo no qual o desbotamento da GFP não deve ser um problema.Posteriormente, faça uma projeção de três cortes com espessura de seis mícrons para observar as células inteiras. Em alguns casos, um embrião pode começar a girar durante o tempo de gravação do vídeo. Portanto, monitore a gravação para que nenhum tempo seja perdido com embriões em movimento.Um embrião em estágio 15 corretamente posicionado mostra o SNC embrionário no centro, com gliócitos bem marcados por um macrófago g M, que estão principalmente fora do SNC. Expressão forte de GFP no citoplasma. Células ectodérmicas E também são marcadas com GFP no citoplasma.Esses quadros mostram células apoptóticas marcadas com an ex in five e ectoderma e macrófagos marcados com cite GFP. Cada quadro é uma projeção de três cortes, e cada corte tem dois mícrons de espessura. Muitas células positivas para an ex in five estão dentro e fora do SNC.O evento destacado mostra uma célula glial englobando uma partícula apoptótica. Observe o comportamento de sondagem da célula glial. Ela toca a partícula apoptótica algumas vezes antes de se comprometer com o englobamento da célula apoptótica após seu desenvolvimento.A técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da eliminação de células apoptóticas explorassem a fagocitose de células apoptóticas durante o desenvolvimento. Utilizando esta técnica, podemos investigar o comportamento altamente dinâmico da eliminação de células apoptóticas.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Este vídeo demonstra uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias homogeneizadas de Drosophila melanogaster. Este método fornece informações sobre a fisiologia celular, determinando a extensão do engolfamento celular apoptótico.

O ensaio de fagocitose: uma técnica de imunocoloração para visualizar o engolfamento de células apoptóticas nas células embrionárias de Drosophila melanogaster

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Aprenda a imagem ao vivo do apuramento celular por apoptose em embriões de Drosophila usando microscopia confocal. Este método permite monitorar dinamicamente fagócitos e células apoptóticas em tempo real.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante

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