Name: Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda o isolamento e cultura de cardiomiocitos de camundongos neonatais para estudos de biologia cardiovascular. Este método robusto permite análises biomecânicas e imunofluorescência de proteínas em células cardíacas.

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Somos gratos ao Prof emérito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Instituto Federal Suíço de Tecnologia, Suíça) para a introdução de técnicas de isolamento para rato neonatal e cardiomiócitos de rato. Gostaríamos de agradecer ao Prof Ju Chen e Prof Sylvia Evans (UCSD, EUA) para o seu apoio. Trabalho no laboratório de EE foi financiado por um MRC Carreira Estabelecimento Grant. SL é apoiado por uma K99/R00 caminho para a independência do prêmio NIH / NHLBI (HL107744). TMM foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (11POST7310066).

O seguinte procedimento descreve um protocolo de 16,17 de dois dias para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais de rato. Todas as soluções são estéreis ou esterilizadas por filtração. Todas as ferramentas são esterilizados por esterilização da superfície com etanol a 75%. Exceto para a extração do tecido inicial, todas as etapas são realizadas em uma cultura de células de fluxo laminar capô estéril. Este protocolo destina-se ao isolamento de corações neonatais de rato 1-2 ninhada (s) - de aproximadamente 5-14 filhotes, mas pode ser adaptado para os tamanhos maiores de areia e de rato cardiomiócitos neonatais. Uso de mídia Escala / enzima, conforme apropriado. Para o trabalho com roedores neonatais, consulte as diretrizes da universidade local e regras estabelecidas pelo legislador e / ou programas de cuidados de animais e aderir ao seu protocolo de animais aprovado institucionalmente. Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê de UC San Diego Institucional (IACUC), e aderir a federegulamentos ral e estadual. Dia 1. 1. Isolamento de tecido cardíaco de ratos Neonatal <ol><li> Preparar 50 ml de 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado com 20 mM de BDM 6-8, e dispersar em dois pratos de bactérias estéreis colocados em gelo. </li><li> Preparar 10 ml de meio de isolamento, em 50 mL de tubos Falcon cónicos estéreis. Mantenha todas as soluções no gelo. Esterilizar tesoura (uma curva, uma reta) e fórceps (curvas, Dumont No.7). </li><li> Ratinhos neonatais de 1-3 dias de idade são lavados rapidamente em solução de etanol a 75% para a esterilização da superfície. Os filhotes de cachorro são decapitados com uma tesoura estéril (em linha reta), eo peito é aberto ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica eo coração (Figura 1A, Suplementar filme S1). Comentário Técnico: ratos neonatais com mais de 3 dias ser utilizado, mas resulta em menor número de células viáveis ​​2. </li><li> Os corações são extraídoso corpo com uma tesoura curva e transferidos imediatamente para o prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM, em gelo. Todos os seguintes passos são realizados no capuz de cultura de células estéril. </li><li> Remover o tecido pulmonar, embarcações maiores (e átrios, se desejar). Corações na solução de lavagem de PBS 1x (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo) para remover o sangue. Transferência lavada corações de primeiro prato para o segundo prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo), com a pinça ou uma colher perfurada (Figura 1B). </li><li> Transferência limpo corações / lavado em uma gota de meio de isolamento (cerca de 250 mL; Figura 1C) em um terceiro prato bacteriana (no gelo) e use a tesoura curva para picar corações em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5-1 mm 3, ou menores; Figura 1D, 1E). </li><li> Transferir corações picados num cónicatubo contendo 10 ml de meio de isolamento (em gelo), e incuba-se com agitação suave a 4 ° C durante a noite. </li></ol> Dia 2. 2. Tissue digestão enzimática e chapeamento de Células <ol><li> Pesa-se 15 mg de mistura de colagenase / dispase (Roche), e dissolve-se a mistura de enzima em 10 ml de meio L15-5 complementado com BDM (meio de digestão) 20 mM. Filtro esterilizado o meio de digestão na capa de cultura de células para um novo tubo de 50 ml estéril Falcon. </li><li> Preparar 30 ml de meio L-15 suplementado com BDM 20 mM, e meio de plaqueamento. </li><li> Placas de cultura de células casaco com solução de colagénio (Sigma C-8919) para um mínimo de 1 hora. Remover solução de colágeno (pode ser reutilizada) e de colágeno revestido pratos de cultura de células secas em fluxo laminar estéril de cultura celular capô. </li><li> Remover o tubo cónico contendo os corações pré-digeridas a partir de 4 ° C. Os fragmentos devem ser agregados (Figura 1G). Deixe os fragmentos de tecido para afundaro fundo do tubo e remover o sobrenadante (a certeza de não perder quaisquer fragmentos de tecido;. normalmente, cerca de 1 ml do meio de isolamento pode permanecer no tubo). Adicionar 5 ml de meio de digestão e 5 mL de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para fragmentos de tecido e a suspensão oxigenado usando oxigénio ou ar, durante 1 minuto. </li><li> Transferir o tubo cónico selado contendo os fragmentos de tecido cardíaco em meio de digestão a 37 ° C num banho de água durante cerca de 2 minutos para ajustar a temperatura da solução de digestão. </li><li> Incubar fragmentos de tecidos cardíacos, a 37 ° C com agitação suave durante 20-30 minutos (por exemplo, agitador a 37 ° C, definida como não mais do que 60 rpm). Tempos de digestão pode depender muito mistura de enzimas e número de lote Cuidado:. Períodos de incubação mais longos ou concentrações mais elevadas de enzimas pode reduzir a viabilidade celular. </li></ol> Comentário técnico: Recomendamos o uso de uma mistura de colagenase / dispase de Roche (Ref. ª: 10269638001), que tem muito pouca variabilidade de lote para lote. A enzima clássico para o isolamento de cardiomiócitos de rato é tripsina e / ou colagenase tipo II 3,16-20 disponível a partir de Worthington (Cat No CLS-2). No entanto, o desempenho da colagenase II podem diferir substancialmente de lote para lote. Worthington normalmente permite o teste de vários lotes de colagenase para otimizar os tempos de digestão enzimática e uso. Alternativamente, Worthington vende um kit de isolamento de cardiomiócitos com uma mistura de enzima de pré-testada incluído, que pode ser adaptado para o isolamento de cardiomiócitos de rato 17 (Cat No.: NCIS). <ol start="7"><li> Coloque célula-filtro estéril (40-100 mM malha de nylon) em frescos estéreis de 50 ml de tubo falcon cônico. Coador de células pré-molhado com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM. Tritura-se fragmentos do tecido gentilmente através de um pré-humedecido de 10 ml de cultura de células de pipeta para cerca de 10-20 vezes. Os fragmentos de tecido deve dispersar principalmente durante este passo, libertando as células em suspension (Figura 1H). </li><li> Vamos maiores fragmentos de tecido de sedimentos e sobrenadante transferência contendo células suspensas em tubo cônico fresco através de células-filtro (Figura 1I). </li><li> Re-suspender os fragmentos de tecido não digeridas em 5 ml de meio de digestão e incubar durante um adicional de 5-10 minutos a 37 ° C com agitação suave. </li><li> Depois de continuar a digestão dos fragmentos de tecido restantes, gentilmente triturar tecido por 10-20 vezes e adicionar tubo contendo células cônicas a partir do primeiro digerir através de filtro de células. Lavar células-filtro com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para permitir a passagem de todas as células digeridos. </li><li> Centrifugado tubo cónico contendo cardiomiócitos em suspensão durante 5 minutos a 300 rpm (aprox. 50-100 xg). Retirar o sobrenadante (contendo principalmente fibroblastos e células endoteliais), e re-suspensão da pelota celular em 10 ml de meio de placagem. </li><li> Células da placa em 10 centímetros de células prato de cultura (Figura 2A) e incubar durante 1H -3 em cultura de células incubadora. Este passo de pré-plaqueamento remove os fibroblastos e as células endoteliais (Figura 2B), que irá aderir ao prato de cultura de células não revestido (Figura 2C). </li><li> Após incubação, lavam cardiomiócitos não aderentes de 10 centímetros prato de cultura (re-suspender as células pipetando repetidamente o meio de plaqueamento em cima do prato), e as células ressuspensas transferência para um tubo Falcon de centrífuga estéril cónica (15 ml ou 50 ml). Opcional: Repita o passo de pré-chapeamento para remover fibroblastos adicionais a partir de células-suspensão. Se desejado, as células de fibroblastos e endoteliais aderentes podem ser ainda cultivadas. </li><li> Contagem de células (por exemplo, usando Neubauer hemocitômetro, tripan exclusão do azul de coloração 21). </li><li> Células da placa em colágeno revestido placas de cultura de células com uma densidade de cerca de 1,5 x 10 5 células por cm 2 (Figura 2D, ver também comenta na Tabela 1 na chapariae revestimento). Coloque os pratos em cultura de células incubadora e deixar em repouso por 12-18 horas para permitir a aderência e disseminação de cardiomiócitos. </li></ol> Dia 3 - Cultura de cardiomiócitos neonatais <ol><li> Prepare meio de manutenção e Pré-aquecer em 37 ° C banho-maria. Consulte a Tabela 1 para a adição de inibidores da proliferação ou agentes cronotrópicos, ou o processo para a transfecção lipossómica de cardiomiócitos neonatais de rato. </li><li> Um dia após o plaqueamento, cardiomiócitos deveria ter aderido à placa de cultura de células e de forma otimizada começar a se contrair espontaneamente (Figura 2E, 2F; Suplementar filme S2; consulte a Tabela 2 para problemas comuns durante o procedimento de isolamento / cultura). Substitua chapeamento meio com meio de manutenção, e da cultura por mais 1-5 dias. Mudança de meio, conforme necessário. </li></ol>

O uso de modelos animais para estudar doenças cardíacas se tornou padrão na pesquisa cardiovascular. Mais perto caracterização bioquímica desses modelos (ou seja, estudando as respostas diretas de células cardíacas a estímulos bioquímicos ou biomecânicos) normalmente requer o isolamento de tecidos cardíacos ou cardiomiócitos. Estudos que investigam as respostas fisiológicas do coração ex vivo (por exemplo, a acetilcolina 40, ou em cenários de isquemia-reperfusão 41) geralmente uti...

Os primeiros relatórios para a dissociação de sucesso e cultura de células cardíacas de roedores remonta à década de 1960 1,2. Mesmo então, Harary e Farley notado que os cardiomiócitos cultivados &quot;pode ​​fornecer um sistema único para o estudo dos requisitos da contractilidade periódica [, e podem] fornecem um meio para determinar a contribuição de diversas vias metabólicas para a [bater] processo&quot;. Embora Harary e Farley cardiomiócitos isolados e cultivados de ratos jovens, bem como o protocolo original foi adaptado e modificado por muitos cientistas ao longo dos anos, o procedimento de isolamento e cultura geral não mudou muito. No entanto, os melhores enzimas 3, soluções padronizadas de 4,5, e a adição do canal reversível e miosina ATPase BDM para proteger as células durante o procedimento de isolamento de 6-9 melhorou significativamente célula-produtividade e viabilidade. Adulto miocardiopatia vs neonatalcitos Cardiomiócitos isoladas e cultivadas a partir de murganhos ou ratos recém-nascidos têm várias vantagens sobre as culturas de cardiomiócitos adultos. Em primeiro lugar, o procedimento de isolamento para neonatais do rato ou do rato corações é mais fácil e menos dispendiosa, quando comparada com o isolamento de cardiomiócitos de rato ou um rato adulto 10. Cardiomiócitos neonatais são muito menos sensíveis a reintrodução de um meio contendo cálcio após dissociação, aumentando consideravelmente o rendimento celular. Outra grande vantagem é que os cardiomiócitos neonatais do mouse passar por uma desdiferenciação mais rápida - ciclo rediferenciaï que normalmente resulta em bater espontaneamente células 20 horas após o plaqueamento, enquanto cardiomiócitos adultos normalmente exigem estimulação para induzir contração. Cardiomiócitos neonatais também são mais facilmente transfectable com os métodos de transfecção lipossomal, enquanto cardiomiócitos adultos necessitam de vetores virais para a entrega bem sucedida de DNA transgênico. Em contraste com cardiomiócitos neonataiss, a cultura de cardiomiócitos de roedores adultos 11-13 permite investigações de degradação miofibrilar e eventual restabelecimento do aparelho contrátil. Estas alterações morfológicas características em cardiomiócitos adultos ocorrem em períodos de 1-2 semanas. A desdiferenciação - ciclo rediferenciaï é acompanhado por reexpressão do programa gene fetal, imitando assim alterações patológicas observadas em cardiomiopatias humanos 14. Outra vantagem de cardiomiócitos de rato adulto durante a cultura de cardiomiócitos neonatais é a capacidade de cultura destas células por longos períodos de tempo. Rato vs cardiomiócitos de rato O isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos recém-nascidos tem algumas vantagens sobre o de cardiomiócitos neonatais rato, incluindo rendimentos mais elevados de células viáveis ​​e aumento das taxas de transfecção. No entanto, a ampla utilização de modelos de ratos geneticamente modificados para doenças cardíacas (por exemplo, &lt;/ Em&gt; a lim muscular rato knockout proteína como modelo para cardiomiopatia dilatada 15) levou à adaptação do procedimento de isolamento de cardiomiócitos derivados de camundongos recém-nascidos. Embora os protocolos usados ​​para isolar neonatais cardiomiócitos de ratos e camundongos são quase idênticas, maior cuidado deve ser tomado na seleção de uma mistura de enzimas apropriadas para o último. Com efeito, os cardiomiócitos neonatais de rato são geralmente mais susceptíveis a overdigestion, resultando numa redução de rendimento celular e viabilidade. Além disso, a densidade do revestimento deve ser ajustado, por cardiomiócitos derivados de ratinhos neonatais são um tanto menor em comparação com células derivadas a partir de corações de ratos recém-nascidos. Com muitos usos para a investigação de parâmetros morfológicos, eletrofisiológicos, bioquímicos, celulares e biológicos e biomecânicos, bem como para o processo de myofibrillogenesis, cardiomiócitos neonatais cultivadas tornaram-se um dos sistemas mais versáteis para o estudo dafunções das células cardíacas in vitro. O primeiro passo para um ensaio bem sucedido no entanto, depende de uma metodologia simples e de confiança para isolar cardiomiócitos neonatais de rato. Nosso protocolo tira a sua metodologia de muitas fontes e foi otimizada para a reprodutibilidade e robustez. Discutimos fatores que influenciam cardiomiócitos-rendimento e viabilidade, e fornecer uma variedade de opções para a otimização de condições de isolamento e de cultura.

<table><tbody><tr><td>BDM (monóxido de 2,3-butanodiona) 6-8</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>prepara solução estoque de 0,2 M em HBSS (sem Ca2+, Mg2+), esterilizar por filtro, pode ser mantido em 4 &#176; C até 6 meses; Cuidado: O uso prolongado de BDM exceto durante o procedimento de isolamento pode resultar em células sem batimento, diminuição da viabilidade celular e / ou expressão gênica significativamente alterada durante a cultura de cardiomiócitos 46,47 .</td></tr><tr><td>Colagenase / Distribuição</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>pode ser substituída por colagenase tipo II de Worthington</td></tr><tr><td>Colagenase tipo II3</td><td>Worthington</td><td>Substituto CLS-2</td><td>para mistura de colagenase/dispase da Roche</td></tr><tr><td>1x solução de tripsina (0,25%) com EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x solução de penicilina/estreptomicina com EDTA em HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (sem Ca2+, Mg2+)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&#8217; s solução salina balanceada; sem Ca2+, Mg2+) 4</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glicose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino</td><td>cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>grau de cultura de células</td></tr><tr><td></td><td>cellgro</td><td>35-030-CV</td><td>cultura de células grau</td></tr><tr><td>Leibovitz L-155</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (cloridrato de citosina-B-D-arabino-furanosídeo)</td><td>Inibidor de proliferação Sigma</td><td>C-6645</td><td>, preparar solução estoque de 1 mM em H2O, esterilizar por filtro, armazenar em 4 &#176; C</td></tr><tr><td>fenilefrina</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>agente cronotrópico, preparar solução estoque 100 mM em H2O, esterilizar por filtro, armazenar em 4 &#176; C ou -20 &#176; Cloridrato de</td></tr><tr><td>isoproterenol</td> C <td>Sigma</td><td>I-6501</td><td>agente cronotrópico, preparar solução estoque 1 mM em H2O, esterilizar por filtro, armazenar a 4 &#176; C ou -20 &#176; C</td></tr><tr><td>0,1% solução de colágeno</td><td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>matriz extracelular para revestimento</td></tr> de <tr><td>solução de colágeno tipo 1 de 3 mg/ml</td><td>Alternativa avançada BioMatrix</td><td>5005-B</td> ao filtro de células da <td>solução de colágeno Sigma</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>tamanho de filtro apropriado:40 &#956; M-100 &#956; Filtro</td></tr> de <tr><td>seringa M 0,2 &#956; m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>para filtração estéril de digestão tesoura reta média Ferramentas de</td></tr><tr><td></td><td>Ciências Finas</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>tesoura curva</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 7 fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>colher perfurada</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>10370-19</td><td>opcional, para transferência de coração tecido</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>coloração de células vivas</td></tr><tr><td>Hemocitômetro Neubauer</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>alternativamente usar: hemocitômetro descartável C-chip ou sistemas automatizados de contagem de células</td></tr><tr><td>50 ml Tubos Falcon</td><td>Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos Falcon Seringa</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>20 ml</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 30 mm</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>para cultura padrão de cardiomiócitos Placa de cultura de</td></tr><tr><td>células de 30 mm, fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>para imagens de células vivas com microscópio invertido</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 10 cm</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>para pré-revestimento</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>para transfecção lipossomal, alternativamente use lipofectamina 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>substituto para Escort III</td></tr><<tr>td colspan="4">Buffers e meios: <ul> <li>Meio de isolamento (esterilização por filtro) 20 mM BDM 0,0125% tripsina em HBSS4 (sem Ca2+, Mg2+)</li> <li>Meio de digestão (esterilização por filtro) 20 mM BDM 1,5 mg/ml Mistura enzimática de colagenase/dispase da Roche em meio L15</li> <li>Meio de revestimento 65% DMEM glicose alta 19% M-199 10% soro de cavalo 5% soro fetal de bezerro 1% penicilina/estreptomicina</li> <li>Meio de manutenção 78% DMEM glicose alta 17% M-199 4% soro de cavalo 1% penicilina/estreptomicina optional: 1 &#956; M AraC 1 &#956; M isoproterenol ou fenilefrina 0,1 mM</li> </ul> O meio de revestimento e manutenção pode ser armazenado a 4 &#176; C por até 6 meses.</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de neonatais rato cardiomyocytes

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cardiomiócitos neonatais cultivadas têm sido muito utilizados para estudar myofibrillogenesis e funções miofibrilares. Cardiomiócitos cultivados permitir a fácil manipulação e investigação das vias bioquímicas, e seu efeito sobre as propriedades biomecânicas do batimento espontâneo cardiomiócitos. O protocolo de 2 dias a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Mostramos como dissecar facilmente corações de recém-nascidos, dissociar o tecido cardíaco e enriquecer cardiomiócitos a partir da população de células cardíacas. Discute-se o uso de diferentes misturas de enzimas para a célula-dissociação, e seus efeitos sobre células-viabilidade. Os cardiomiócitos isolado pode ser posteriormente utilizado para uma variedade de,, ensaios com células-biológica ou bioquímica biomecânico electrofisiológicos morfológicas. Nós otimizamos o protocolo para a robustez e reprodutibilidade, usando soluções só comercialmente disponíveis e enzima mistura que show variabilidade pouco de lote para lote. Nós também tratar de problemas comuns associados com o isolamento e cultura de cardiomiócitos, e oferecem uma variedade de opções para a otimização das condições de isolamento e de cultura.

Usando este protocolo, foram isoladas a partir de 8 corações um dia de idade ratos neonatal (Figuras 1A, 1B, Suplementar filme S1). Após a lavagem e picagem dos corações com a tesoura (Figuras 1C-1F), fragmentos de tecido foram pré-digeridas em meio de isolamento durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Após a pré-digestão (Figura 1G), transferimos os fragmentos de tecidos em meio de digestão acabado de fazer, e incubou-se os fragmentos de tecido durante 20 minutos a...

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar cardiomiócitos neonatais de camundongos para uso em ensaios subsequentes. Isso é feito primeiro dissecando os corações de camundongos neonatais e, em seguida, cortando manualmente o tecido cardíaco em pequenos fragmentos. Na segunda etapa, as células cardíacas são dissociadas por meio de uma série de digestões enzimáticas. Em seguida, as células isoladas são plaqueadas, para enriquecer os cardiomiócitos. Por fim, os cardiomiócitos cultivados podem ser observados, aderidos à placa e exibindo comportamento de batimento espontâneo. Em última análise, a localização subcelular de proteínas dentro de células musculares cardíacas transfectadas com construções de expressão eucariótica, pode ser observada por microscopia imunofluorescente.- A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos é a robustez e reprodutibilidade no isolamento e cultura de cardiomiócitos de camundongos neonatais.- Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular e fornecer informações sobre a biologia celular molecular única das células do músculo cardíaco, como abordar como pequenas moléculas podem influenciar as

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Desenvolvemos um novo e reprodutível técnica para isolar culturas primárias de células do músculo liso da artéria pulmonar (PASMC), a partir de ratinhos jovens como P7, permitindo assim um melhor estudo das vias de sinalização celular envolvidas na contracção do músculo liso neonatal e relaxamento.

Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

O isolamento de cardiomiócitos de ratos neonatais é um procedimento demorado e imprevisível.  Este estudo descreve métodos de criopreservação e descongelamento de cardiomiócitos de ratos neonatais que permitem o uso mais eficiente das células. Os NRCMs descongelados podem ser usados para vários experimentos sem a necessidade de realizar isolamentos a cada vez.

O isolamento e criopreservação de Neonatais Rato Cardiomyocytes

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Aprenda o isolamento e cultura de cardiomiocitos de camundongos neonatais para estudos de biologia cardiovascular. Este método robusto permite análises biomecânicas e imunofluorescência de proteínas em células cardíacas.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

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