Identificação de A Bela Adormecida Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR
1 de fevereiro de 2013
Um método de identificação de condutores desconhecidos da carcinogénese, utilizando uma abordagem imparcial é descrito. O método utiliza o A Bela Adormecida Transposon como um mutagéneo aleatória dirigida a tecidos específicos. Mapeamento genómico de inserções de transposões que conduzem a formação de tumores identifica novos oncogenes e genes supressores tumorais
Este procedimento mostra como identificar novos oncogenes e genes supressores de tumor, mapeando a transposição em inserções no camundongo que impulsionam a formação do tumor. Isso é feito primeiro gerando e colhendo tumores do modelo de camundongo transgênico. As próximas etapas do procedimento são isolar o DNA tumoral, realizar PCR mediado por ligante, sequenciar as amostras de DNA amplificadas e analisar a transposição nas inserções.
Em última análise, o procedimento identifica genes condutores de tumor candidatos. A principal vantagem de usar PCR mediada por ligante em conjunto com uma triagem genética imparcial usando transposons da beleza adormecida é que podemos identificar facilmente novos fatores genéticos do câncer. Sempre comece a dissecação borrifando o exterior do rato sacrificado com 70% de etanol.
Os tecidos e tumores coletados devem ser divididos em quatro seções, de 50 a 100 miligramas de tamanho. Fixe uma seção em formina tamponada a 10% por 18 horas, seguida de etanol a 70%. Esta seção pode ser usada para coloração h e e e/ou imuno-histoquímica.
Congele as seções restantes em nitrogênio líquido. Estes podem ser armazenados em um freezer e usados para D-N-A-R-N-A e isolamento de proteínas para coletar DNA de uma amostra de tumor congelada. Primeiro, pique finamente o tecido com uma lâmina de barbear.
Em seguida, digerir o tecido em um tubo de 1,5 mililitro com um mililitro de tampão de lise celular e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro. A solução de protease K vórtice a mistura completamente e prossiga com uma extração de DNA padrão à base de isopropanol. Comece este protocolo recozendo os ligantes em um tubo de 1,5 mililitro.
Misture 50 microlitros de cada solução ligante com dois microlitros de cloreto de sódio concentrado. Em seguida, coloque o tubo em um bloco de calor de 95 graus Celsius. Após cinco minutos, desligue o fogo e deixe esfriar lentamente até a temperatura ambiente, o que pode levar uma hora ou mais após o resfriamento.
Os ligadores anais podem ser armazenados no freezer até que sejam necessários. Prepare 2 placas de 96 poços por Ali citando um micrograma de DNA de cada amostra em poços correspondentes em ambas as placas de 96 poços. Por exemplo, coloque um micrograma de DNA da amostra um no poço A, uma das duas placas de poço.
O DNA em uma das placas de 96 poços será digerido usando a enzima do lado direito NLA três e digerirá as amostras de DNA na outra placa de 96 poços usando a enzima BFA do lado esquerdo. Deixe o DNA digerir durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, termine a digestão pelo calor, inativando as enzimas por 20 minutos.
Agora limpe as reações de digestão usando uma mini placa de 96 poços. Usando a pipeta multicanal, transfira cada amostra para o mini saque. Placa de 96 poços.
Coloque a placa de 96 poços de saque mini em um coletor de vácuo. Aplique um vácuo na placa até que os poços pareçam secos. Normalmente, 15 minutos ao longo deste protocolo.
É preciso tomar muito cuidado para não contaminar suas amostras. Ao trabalhar com 96, as placas de poço mantêm os poços cobertos com tampas o máximo possível e evitam passar sua pipeta sobre poços abertos, pois qualquer gota de líquido indesejado pode arruinar a amostra. Remova a mini placa de saque do coletor de vácuo e bloqueie o fundo da placa com papel toalha até que esteja completamente seco.
Ressuspenda o DNA no mini saque. Placa de 96 poços adicionando 30 microlitros de água bidestilada a cada um. Bem, coloque a mini placa de saque em um agitador orbital alto por dois minutos.
Em seguida, transfira o conteúdo da mini placa de saque para uma placa limpa de 96 poços. Para realizar as reações de ligação do ligante. Prepare a reação de ligação misturando uma quantidade suficiente de tampão de ligação, um ligante ajoelhado da etapa 3.2 T quatro DNA ligase e água em um reservatório de reagente.
Use uma pipeta multicanal para transferir 10 microlitros de DNA digerido da etapa anterior para uma nova placa de 96 poços. Em seguida, use uma pipeta multicanal para Eloqua 10 microlitros da reação de ligação a todos os poços da placa de 96 poços. Afinal, os poços foram carregados com DNA e reagentes de ligação.
Incube a placa por quatro horas a 16 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte. Termine a ligadura inativando a T quatro Ligase a 65 graus Celsius por 10 minutos.
Como antes, limpe a reação de ligadura usando mini placas de saque e um coletor de vácuo para secar a placa e, em seguida, seque o fundo da placa até que esteja completamente seco. Ressuspenda o DNA em 30 microlitros de água bidestilada Coloque em um agitador orbital por dois minutos e, em seguida, transfira o conteúdo do mini prato de saque para um prato limpo.
Em seguida, execute uma segunda digestão de DNA com bam H one para destruir os transposons concat restantes. Digerir o DNA a 37 graus Celsius por três a seis horas ou durante a noite e, em seguida, a digestão é limpa usando mini placas de saque seguindo o mesmo procedimento de antes. Efectuar uma PCR de 30 ciclos utilizando um primário específico para a transposição e um primário específico para o ligante.
A reação deve conter três microlitros do DNA digerido com ligantes. Em seguida, limpe a reação de PCR usando o mini saque. Placas de 96 poços e um coletor de vácuo, conforme realizado anteriormente.
Ressuspenda o DNA em 30 microlitros de água e transfira as suspensões para um 96 limpo. Bem jogado, prossiga diluindo dois microlitros dos produtos da reação PCR em 148 microlitros de água bidestilada usando apenas dois microlitros dos produtos diluídos. Execute PCRs de 30 ciclos usando versões aninhadas dos primers em volumes de 100 microlitros.
Estes primers são para a máquina Illumina GA two X. Cada amostra terá um código de barras exclusivo de 12 pares de bases da execução de PCR, 45 microlitros de cada produto em um gel de 1% com brometo de AUM. Deve haver um esfregaço de produtos de PCR representando amplicons das muitas inserções de transposons diferentes no tumor.
Use o método de lavagem a vácuo descrito anteriormente para limpar os 50 microlitros restantes de PCR, depois ressuspenda o DNA em 50 microlitros de água e execute a lavagem a vácuo novamente. Agora Resus, suspenda o DNA em 30 microlitros de TE e transfira-o para uma placa limpa de 96 poços. Determine a concentração de DNA em cada amostra.
Em seguida, combine quantidades iguais de DNA de cada amostra em um único tubo. É possível sequenciar várias centenas de amostras de DNA em uma única pista de uma corrida Illumina, desde que cada amostra tenha sido gerada usando um primer com código de barras distinto usando o protocolo. Um LMPC bem-sucedido deve amplificar centenas de transposições em inserções em um único tumor após a execução de metade do produto de PCR secundário em um gel de 1%, um esfregaço de DNA representa essa amplificação.
Se a LM PCR não for bem-sucedida, haverá ausência do esfregaço de DNA. Em vez disso, você verá bandas definitivas de sequenciamento de DNA de um a 200 tumores em uma única pista da plataforma Illumina GA dois X deve produzir mais de 30 milhões de sequências de 100 pares de bases cada ao tentar este procedimento. É importante lembrar de trabalhar devagar e com cuidado para garantir que nenhuma contaminação ocorra após este procedimento.
A análise de fatores genéticos recém-descobertos do câncer pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como: quais desses fatores podem ser alvo de terapia?
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para identificar oncogenes e genes supressores de tumor novos por meio do mapeamento de inserções de transposons em um modelo murino. A abordagem utiliza o transposon Sleeping Beauty como um mutagênico aleatório, permitindo a descoberta de fatores genéticos responsáveis pelo câncer.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Carcinogênese
- Mapeamento Genômico
- Biologia de Transposons
Antecedentes
- A carcinogênese envolve alterações genéticas complexas.
- Os transposons podem servir como ferramentas para mutagênese.
- A identificação de genes condutores é crucial para compreender o câncer.
- A PCR mediada por ligadora melhora a detecção de inserções de transposons.
Objetivo do Estudo
- Identificar fatores desconhecidos envolvidos na formação de tumores.
- Utilizar uma abordagem de triagem genética imparcial.
- Mapear inserções de transposons no DNA tumoral.
Métodos Utilizados
- Geração de tumores em um modelo de camundongo transgênico.
- Isolamento de DNA tumoral de tumores coletados.
- PCR mediado por ligador para amplificar amostras de DNA.
- Sequenciamento e análise de inserções de transposons.
Resultados Principais
- Identificação de genes candidatos a genes motores de tumores.
- Foram descobertos novos oncogenes e genes supressores de tumor.
- O método demonstrou ser eficaz no mapeamento de alterações genéticas.
Conclusões
- O transposon Sleeping Beauty é uma ferramenta valiosa para a pesquisa do câncer.
- Este método permite a identificação imparcial de fatores genéticos causadores.
- Estudos futuros podem se basear nestas descobertas para explorar os mecanismos do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de alterações genéticas responsáveis pelo câncer permanece um desafio crítico na fase inicial de descoberta, devido ao alto ruído de fundo proveniente de mutações passageiras. O sistema de transposon Sleeping Beauty combinado com PCR mediado por ligante permite triagens genéticas diretas imparciais em camundongos para identificar oncogenes e genes supressores de tumor candidatos. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista e melhorar a confiança preditiva em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de mutagênese funcional in vivo.
- Valor Operacional: Direciona a transposição a tipos celulares específicos utilizando sistemas Cre-lox para validação de alvos tecido-específicos.
- Valor Preditivo: Identifica genes em sítios comuns de inserção como condutores de câncer de alta confiança para triagem de portfólio.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera centenas de amplicons distintos por tumor, representando os sítios de inserção do transposon para análise posterior.
- Reprodutibilidade: Utiliza etapas padronizadas de PCR mediado por ligante e PCR aninhado para garantir detecção consistente entre amostras.
- Escalabilidade: Permite o sequenciamento multiplexado de centenas de amostras de tumor em uma única leitura do Illumina por meio de iniciadores com códigos de barras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a heterogeneidade genética observada em tumores humanos ao capturar perfis diversos de inserção em múltiplos tumores.
- Continuidade Translacional: Conecta a mutagenese na fase de descoberta à validação pré-clínica, identificando genes passíveis de serem alvos terapêuticos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Distingue mutações condutoras de mutações passageiras por meio da análise estatística de sítios comuns de inserção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a geração de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes, ao fornecer alvos validados geneticamente a partir de telas in vivo.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio de triagens genéticas diretas não tendenciosas que reduzem o ruído de fundo proveniente de mutações passageiras.
- Triagem: Fornece amostras de DNA prontas para ensaio com resultados quantitativos adequados para mapeamento e sequenciamento de locais de inserção.
- Análise: Permite a identificação estatística de locais comuns de inserção para priorizar genes candidatos a câncer.
- Pesquisa Translacional: Conecta a mutagênese in vivo à validação de alvos, revelando genes com relevância terapêutica potencial.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem genética em múltiplos modelos de câncer e tipos de tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança na validação de alvos ao associar inserções de transposons ao potencial tumorigênico.
- Valor Operacional: Padroniza a detecção de inserções de transposons por meio de fluxos de trabalho otimizados de PCR mediada por ligadora.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidências funcionais in vivo para a priorização de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao distinguir genes condutores do fundo genômico.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de camundongos, biologia de transposons e técnicas de biologia molecular.
- Depende do acesso a instrumentação de PCR, eletroforese em gel e plataformas de sequenciamento.
- Necessita de protocolos padronizados para isolamento de DNA, hibridização de adaptadores e digestão enzimática entre conjuntos de amostras.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o sistema a diferentes linhagens de Cre driver ou modelos de tumores.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de rendimento tumoral suficiente e a cuidadosa prevenção de contaminação cruzada durante o processamento em múltiplas etapas.
