Name: Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios In vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a estabelecer culturas líquidas de células Calu-3 polarizadas usando sistema Transwell para estudar função epitelial respiratória. Este método avalia polarização por TEER e fluoresceína.

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Os autores agradecem a Elisabeth Blanchard, por sua assistência técnica. Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

1. Cultura Calu-3 células para uso em culturas Transwell Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Para descongelar as células de armazenamento de congelados: <ol><li> Prepare Meio Mínimo Essencial de Eagle contendo 20% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Esterilizada por filtro de média a preparada utilizando um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, e aquecido num banho de água a 37 ° C. Para ser mais reflectora do ambiente em situ das vias aéreas epitélio, o meio não é suplementado com antibióticos ou antimicóticos. </li><li> Descongelar um criotubo gelado de células Calu-3 rapidamente (&lt;1 min) num banho de água a 37 ° C. </li><li> Transferir as células descongeladas a um tubo de 50 ml estéril cónico e adicionar 30 ml de EMEM-aquecido a 20% + S. </li><li> Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. </li><li> Decantar o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as células em 5 ml de EMEM-20% + S aquecido suavemente pipetando para cima e para baixo. Semente 2-5 x 10 6 células por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços e incuba-se a 37 ° C, 7% CO 2 em ar ambiente até que as células são de 75% - 80% confluentes. Verifique diariamente; até 7 dias podem ser necessários. A cada 3-4 dias, aspirar o meio das células e substitui-lo com EMEM fresco, 20% + S. </li></ol></li><li> Para subcultura de células: <ol><li> 0,05% de tripsina quente - 0,02% de EDTA em um banho de água a 37 ° C. Aspirar o meio das células, uma vez que as células e lava-se com tripsina a 0,05% aquecida - EDTA a 0,02% para remover o excesso de meio e soro. Remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de tripsina aquecido por poço para as células. </li><li> Incubar a 37 ° C e CO 2, e 7% de monitor sob um microscópio a cada 5 min até que pelo menos 75% das células destacam do poço (s) da placa de cultura de tecidos. Isso podeter entre 5 e 30 min. </li><li> Lave as células em EMEM-20% + S para remover o excesso de tripsina. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml estéril cónico. Múltiplos poços de células a partir de uma placa de cultura de 6 poços podem ser reunidos numa única tubo estéril de 50 ml de Erlenmeyer. Adicionar 30 ml de células de EMEM a 20% +-S e de sedimento por centrifugação a 1,000-1,200 × g, sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. </li><li> Decantar o sobrenadante com cuidado e ressuspender as células em% EMEM-20 fresco + S cuidado pipetando para cima e para baixo. Usando etapas 1.2.1 1.2.3 acima através de Tripsinizar as células, as células continuarão a subcultura em placas de cultura de tecidos, tal como descrito nos passos 1.2.5 1.2.7 através quando estão entre 75 - 80% confluentes. </li><li> Subcultura a partir de um poço de uma placa de 6 poços até um T-25 centímetros balão 2, num volume final de 5 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / frasco. </li><li> Usando 5 ml de tripsina aquecido por T de 25 cm 2 balão para separar células de subcultura,a partir de um frasco de T-25 cm2 até um T-75 cm 2 balão num volume final de 10 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 1 e 5 x 10 6 células / frasco. </li><li> Utilizando 8 ml de tripsina aquecido por T de 75 cm 2 balão para separar células de subcultura, a partir de um T-75 cm 2 em 2 frasco T-75 cm 2 frascos. Para o crescimento celular óptimo, não se células de subcultura em frascos maiores do que T-75 cm 2 ou subcultura a uma proporção maior do que um frasco de pai: 3 frascos novos. </li></ol></li><li> Uma vez que as células foram subcultivadas, remover completamente e substitua meio a cada 2 a 3 dias até atingirem a confluência de 75-90%. As células podem levar até 3 semanas para chegar a confluência de 75-90%. Para a geração óptima de culturas polarizadas, células de subcultura antes que crescem para além de 90% de confluência como uma camada única. </li><li> Continue a células de subcultura até um número suficiente de células cresceram até o número desejado de sementes de inserções Transwell. Cada pastilha Transwell requer 2 × 10 5 células. Para um desempenho ideal gerando culturas polarizadas, utilize células que sofreram mais de 10 subculturas. </li></ol> 2. Crescimento polarizado Calu-3 líquido cobertas de Culturas (LCC) Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Prepare EMEM contendo FBS a 10% (EMEM-10%) e aquecido num banho de água a 37 ° C. </li><li> Prepare uma placa de 24 poços Transwell para a semeadura. Utilizando fórceps estéreis, mover inserções Transwell do interior para as linhas exteriores da placa, sem tocar na membrana de inserção. As células devem ser subcultivadas apenas em poços sobre as linhas exteriores da placa. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para cada uma a dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li><li> Separar as células T a partir de 75 cm 2 de tecido. Subcufrascos LTURE utilizando tripsina aquecido, e lavar com 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tripsinizadas, tal como descrito no passo 1.2. </li><li> Completamente ressuspender as células lavadas em 5 ml de EMEM a 10%, com cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Determinar a contagem de células viáveis ​​e total pelo método de exclusão de azul de tripano. Prossiga apenas se a 80% - 90% são viáveis. </li><li> Num tubo de 50 ml estéril cónico, diluir as células a uma concentração de 2 x 10 6 células viáveis ​​/ ml, com EMEM-10%. </li><li> Adicionar células para o compartimento apical de cada Transwell. Para poços A1 e D1, o qual será poços de controlo isentos de células, isto é, espaços em branco, adicionar 100 uL de EMEM a 10%, sem células. Para cada uma das cavidades restantes, adicionar 100 ul de ressuspensos Calu-3 células, gentilmente dobrando a pipeta contra o canal de guia interior da parede da inserção e, lentamente, libertando as células. Não toque a pipeta para a membrana de inserção. Para manter uma suspensão homogénea de células Calu-3, agite suavemente a suspensão de célulasdurante este passo de semeadura. </li><li> Incubar a placa Transwell a 37 ° C e 7% CO 2 em ar atmosférico. Coloque a placa em uma incubadora onde perturbação física será mínimo. Para melhorar a eficiência de polarização, não se acumulam chapas em cima uns dos outros. </li><li> Para manter as culturas até polarizado e pronto para uso em experimentos, substituir completamente no meio transwells, como descrito nos passos a 2,10 2,13 a seguir. Meio deve ser completamente substituído três dias depois de ter sido subcultivados em transwells, e, em seguida, em um ciclo alternado entre o quarto dia e, em seguida, após a terceira alimentação anterior, até que as células são totalmente polarizado. </li><li> Quente EMEM-10% em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente meio de inserções Transwell. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, antes de remover o meio apical de todos os poços, e tgalinha de remover o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. </li><li> Adicionar 200 uL de EMEM a 10%, para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, em seguida, aos poços semeados, dirigindo o meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione médio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. </li><li> Adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para os compartimentos basolateral. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar meio de cada um por dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li></ol> 3. Avaliação do Desenvolvimento da Resistência Calu-3 LCC Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. <ol><li> Trans-epitelial avaliar a resistência eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min depoismudanças médio, a avaliação pode ser realizada após cada mudança de meio, se desejar. Realizar medições em condições estéreis. Comece medições com o controle livre de células poços A1 e D1 (os espaços em branco) para obter medidas de base, e continuar com as medidas para cada poço. <ol><li> Sob condições estéreis, transferir o eléctrodo STX2 para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 70% de etanol em água estéril, e esterilizar 15 min. </li><li> Calibrar e testar o voltohmmeter para uso de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Retire o eletrodo a partir do etanol, o ar seco 5-10 segundos, e enxaguar o eletrodo com% EMEM-10 estéril. </li><li> Defina o modo do voltohmmeter para a definição de resistência, e ligar o rádio. </li><li> Coloque suavemente o eléctrodo numa das três portas que permitem o acesso ao compartimento basolateral de uma cultura Transwell. Eléctrodo lugar de modo que o fio mais apenas tocar levemente na parte inferior do poço e exterior permanece vertical,e o mais curto é no meio de cultura de tecido do compartimento apical, sem tocar na membrana de inserção. </li><li> Push &quot;Medida R&quot; botão, e aguarde a leitura estabilize. Repetir para as outras duas portas de cada poço e registar as medições de todos os três portas, para um total de três medições por poço. Continuar a medir a resistência de todos os poços de células. </li><li> Limpar o eléctrodo por imersão 5-10 min em etanol a 70%, enxaguando em dH2O estéril, e secagem cuidadosamente. Conservar na embalagem original. </li><li> Calcula-se a resistência de cada poço, usando a Equação 1. Ω = Ω amostra real - Equação Ω em branco, 1 onde a amostra Ω é a medição média de um poço e semeado em branco Ω é a medição média da 2 poços, A1 e D1, contendo inserções e médios, mas sem células. </li><li> Calcular a resistência por unidade de área, utilizando Equação 2. Ω real × área efectiva de membrana Equação = Ω × cm 2, 2 em que a área efectiva da membrana é de 0,33 cm 2 para inserções Transwell de 24 cavidades. </li></ol></li><li> Verificar que a polarização é completa através da realização de um ensaio secundário, medindo a difusão passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos apical e basolateral, em 1-3 culturas Transwell. Os poços utilizados para o ensaio de fluoresceína de sódio deverá ser descartado imediatamente após a conclusão do ensaio. <ol><li> Preparar tampão não fluorescente (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl, 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; filtro estéril com 0,45 uM dispositivo de filtração ). Prepare fluoresceína de sódio a 1 mg / ml em tampão não fluorescente, o filtro esterilizado, envoltório em folha de alumínio, e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Quente para o quarto de temperature antes da utilização. </li><li> Depois de completar as medições de resistência, remova cuidadosamente médio de ambos os compartimentos basolateral e apical de um a três culturas individuais Transwell. </li><li> Lavar culturas Transwell. Suavemente adicionar 600 ul à temperatura ambiente estéril PBS Dulbecco (D-PBS) para os compartimentos basolateral e 100 uL à temperatura ambiente estéril D-PBS para os compartimentos apicais. </li><li> Remova cuidadosamente D-PBS dos poços. Adicionar 600 ul de tampão não fluorescente estéril para os compartimentos basolateral. Adicionam-se 100 ul de uma estéril de fluoresceina de sódio mg / ml para os compartimentos apicais. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. CO 2 não é necessário durante a incubação. </li><li> Durante a incubação, preparar uma curva padrão de fluoresceína de sódio que varia entre 20 ng / ml e 0 ng / mL, utilizando tampão não fluorescente para diluir fluoresceína de sódio. Preparar pelo menos 8 concentrações diferentes de fluoresceína de sódio, cada um em um volume final de, pelo menos, 600 ul. Manterdiluições da curva padrão protegido da luz até que esteja pronto para medir a absorbância. </li><li> Transfira a amostra tampão não fluorescente a partir do compartimento basolateral de cada Transwell de teste para um tubo limpo separado para análise. Remover o teste transwells usado para examinar a difusão passiva de fluoresceína de sódio a partir da placa e descartar. Regressar a placa com transwells restantes para a incubadora. </li><li> Coloque 100 ul de cada solução padrão em triplicado numa placa de 96 poços de fundo plano. </li><li> Preparar três diluições de cada amostra basolateral (1:2, 1:20, e 1:50) em tampão não fluorescente, e adicionar 100 uL de cada amostra não diluída e de cada uma das diluições, em duplicado, para um de 96 poços plana placa de fundo. </li><li> Absorvância medida da amostra num leitor de placas de ELISA a 486 nm ou 490 nm. </li><li> Determinar a concentração de fluoresceina de sódio no compartimento basolateral através da comparação da absorvância das amostras contra os valores de absorvância para a fluoresceína sódica standard curva. </li></ol></li></ol> 4. Infectando Polarized Calu-3 LCC com Vírus Respiratório Medidas de Segurança: executar todos os procedimentos descritos em uma cabine de segurança biológica utilizando a técnica de cultura estéril, a um nível apropriado de segurança biológica para o vírus a ser utilizado. <ol><li> Diluir vírus em EMEM livre de soro, de modo que seria desejado inóculos em 100 ul. </li><li> Lave as células em EMEM livre de soro. Aspirar cuidadosamente meio de todos os poços, o meio de remoção apical então o meio basolateral. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, em primeiro lugar remoção do meio apical de todos os poços, e em seguida removendo o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. <ol><li> Adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, e depois a tele seeded poços, dirigindo meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione meio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. </li><li> Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro para os compartimentos basolateral. Adicionar meio de cada Transwell pela angulação da pipeta contra a parede do compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. </li><li> Aspirar cuidadosamente meio isento de soro dos poços. </li></ol></li><li> Começando com os poços não infectadas ou falsamente infectadas, adicionar as diluições de vírus apropriadas para o compartimento apical do transwells. Para poços não infectados, adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells apropriados, por falsamente infectadas poços, adicionar 100 ul de vírus livre de preparação diluída em EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells adequadas, por infecção por vírus, vírus diluído em EMEM livre de soro e adicionar 100 ul para os compartimentos apicais de transwells apropriados. </li><li>Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro de todos os compartimentos basolateral. </li><li> Incubar a 37 ° C e 7% CO 2, durante 2 horas. </li><li> Aspirar meio de poços, em primeiro lugar a partir de poços não infectados e falsamente infectadas, em seguida, a partir de poços infectados. Remover sobrenadantes apicais primeiro lugar, seguido por sobrenadantes basolateral. </li><li> Substituir meio com 200 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos apicais e 600 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos basolateral. </li></ol>

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<li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ao estabelecer Calu-3 LCC em inserções Transwell, as células não podem polarizar de todo, ou não pode polarizar completamente, tal como definido por um TEER ≥ 1,000 Ω × 2 cm e ≤ sódio a 1% de corante de fluoresceína de equilíbrio entre os compartimentos apical e basolateral. Além disso, Calu-3 células de LCC pode totalmente polarizar, mas TEER podem ser inconsistentes entre as medidas. Apesar de flutuações nas medidas de Teer Calu-3 LCC são normais do dia a dia, uma vez totalmente polarizados, oscilações dramáticas na TEER não se espera até a cultura naturalmente diminui com a idade, o que pode ser tão pouco como cinco semanas ou enquanto 12 semanas após a semeadura. A capacidade de Calu-3 LCC para polarizar depende em parte da forma como as células são mantidas e subcultivados antes da sua utilização no sistema Transwell. As células que cresceram para além de 90% de confluência como uma monocamada durante a repicagem, que foram subcultivadas mais de 10 vezes do stock congelado, ou que não sejaen fornecido com meio fresco em uma programação regular são menos propensos a polarizar completamente, e qualquer polarização provavelmente diminuirá rapidamente. Falta incompleta ou total de polarização pode também ser atribuída à variação no material e tamanho de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, e de lote para lote, em transwells variação de composição semelhante e de tamanho de poro pode também afectar a polarização. Tamanhos maiores de poro pode permitir Calu-3 a crescer através da membrana Transwell no compartimento basolateral, impedindo a cultura a partir de polarização. Uma ausência de polarização pode também ser devido ao crescimento bacteriano, indicado por meio de cultura turva, o que leva à destruição subsequente das junções apertadas entre as células Calu-3. Medições TEER variáveis ​​de Calu-3 LCC pode ser causada por perturbações mecânicas dos Calu-3 monocamadas de células LCC, as inserções, ou as placas propriamente ditas. Mudanças de médio e medições Teer deve ser realizada sem ponteiras ou electroleva de tocar nas células. Durante a realização destas operações, deve ser tomado cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos apical e basolateral, que perturbam a capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência. A capacidade do voltohmmeter para detectar a resistência de uma cultura que é, na verdade, polarizada pode também limitada pela acumulação de proteínas sobre as pontas dos eléctrodos. Esta acumulação-podem ser removidos com lixa suave, ou pode ser corrigido através da substituição do eléctrodo. Uma vez Calu-3 LCC completamente polarizar o TEER e já não está a aumentar, Calu-3 LCC está pronto para ser utilizado como um modelo in vitro para caracterizar as respostas das células hospedeiras pulmonares epiteliais de infecção respiratória. Este sistema permite uma melhor caracterização das respostas de direcção, para agentes patogénicos em comparação com monocamada de cultura de linhas celulares de pulmão, tradicionalmente usados ​​para estudar agentes patogénicos respiratórios, tais como A549 e células HEp-2, com as vantagens adicionais de Calu-3 LCC being mais rápido para desenvolver, mais fácil de obter, e menos dispendioso para gerar de primário, NHBE, polarizada diferenciada. Semelhante a NHBE, polarizada Calu-3 demonstram a formação da junção apertado, e produzir mucinas. No entanto, ao contrário NHBE, polarizados Calu-3 células não se diferenciam em camadas de células basais e células ciliadas epiteliais colunares, e poucos polarizadas Calu-3 células se desenvolvem cílios-como projeções 19. Assim, apesar de serem úteis para o exame respostas polarizadas de células epiteliais das vias aéreas respiratórias a insulto, polarizado Calu-3 LCC não é um modelo ideal para examinar o desenvolvimento das vias aéreas ou de remodelação em resposta ao insulto ou ferimento respiratório. A produção de muco pelas células em cultura in vitro podem ter impacto infectividade celular, bem como a libertação de vírus infeccioso e propagação do vírus em um modelo de polarização, e uma comparação directa da produção de muco polarizada entre Calu-3 LCC e NHBE, polarizada diferenciada não foi relatada . A549 e células HEp-2 are mais fácil do que a cultura de células Calu-3, no entanto, ao contrário de Calu-3 LCC, elas não formam as culturas polarizadas, quando cultivada em inserções Transwell, e, portanto, não são modelos ideais para a análise in vitro das respostas das células epiteliais polarizadas a infecção por vírus respiratório .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina a 0,05% - 0,02% de EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Heat-inactivam, 56 ° C, 30 min </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Armazenar a 4 ° C no escuro </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS a 10%-EMEM (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM com FBS inactivado pelo calor a 10% de soro, esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> EMEM-FBS a 20% + suplementos (% EMEM + S-20) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM para concentrações finais: FBS inactivado pelo calor, a 20%; 1X aminoácidos, 2 mM de L-glutamina, a 10 mM de HEPES; esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> Placas de 24 poços Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> Tamanho de poro 3 uM de poliéster, </td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Prepare-se para 70% utilizando dH2O estéril </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Não fluorescente tampão </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM de KCl; 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> Fluoresceína </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml em tampão não fluorescente estéril; esterilizada por filtro, proteger da luz; armazenar a 4 ° C até 6 meses </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 eletrodo </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas ELISA </td><td></td><td></td><td> Capaz de medir um 486 ou um 490 </td></tr></tbody></table>

estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais polarized calu-3 células para estudar a resposta cell host para patógenos respiratórios<em&gt; in vitro</em

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

As superfícies apicais e basolateral das células epiteliais das vias aéreas demonstram respostas direcionais para exposição patógeno in vivo. Assim, em modelos in vitro ideal para análise de respostas celulares a patogénios respiratórios polarizar, formando superfícies apical e basolateral. Um tal modelo é diferenciado normais células epiteliais brônquicas humanas (NHBE). No entanto, este sistema requer amostras de tecido pulmonar perícia, isolamento e cultura de células epiteliais do tecido e, em vez de gerar uma cultura de interface ar-líquido. Calu-3 células, derivadas de um adenocarcinoma humano brônquica, são um modelo alternativo para a análise da resposta das células das vias respiratórias epiteliais proximais ao insulto respiratório 1, os compostos farmacológicos 2-6, e 7-9 de bactérias e agentes patogénicos virais, incluindo o vírus da gripe, rinovírus e síndrome respiratória aguda grave - associada coronavírus 10-14. Recentemente, we demonstraram que as células Calu-3 são susceptíveis ao vírus respiratório sincicial (RSV) a infecção de uma forma consistente com NHBE 15,16. Aqui, detalhe o estabelecimento de um polarizado, cultura líquido coberto (LCC) da Calu-3 células, concentrando-se sobre os detalhes técnicos de cultivo e cultura Calu-3 células, mantendo as células que foram cultivadas em LCC, e nós apresentamos o Método para a realização de infecção por vírus respiratório de polarizadas Calu-3 células. Para obter consistentemente polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células devem ser cuidadosamente repicadas antes de cultivo em inserções Transwell. Calu-3 culturas em monocamada deve permanecer abaixo de confluência de 90%, devem ser subcultivadas menos de 10 vezes do stock congelado, e devem ser regularmente fornecido com meio fresco. Uma vez cultivadas em transwells, Calu-3 LCC devem ser manuseados com cuidado. Alterações irregulares de mídia e ruptura mecânica ou física das camadas de células ou placas de impactar negativamente a polarização paravárias horas ou dias. A polarização é monitorizada através da avaliação de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e é verificada através da avaliação da equilibração passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos 17,18 apical e basolateral. Uma vez que TEER planaltos em ou acima de 1000 Ω × 2 cm, Calu-3 LCC está pronto a ser usado para analisar a resposta celular a agentes patogénicos respiratórios.

Quando cultivados como líquido cobertas culturas (LCC), em sistemas de cultura Transwell, tal como ilustrado na Figura 1, as células Calu-3, polarizam desenvolvimento distintas superfícies apical e basolateral. Seguindo o método descrito aqui, a resistência eléctrica trans-epitelial (TEER) de Calu-3 LCC atinge um patamar igual ou superior a 1.000 Ω × cm 2 a 3 semanas depois da sementeira, a exemplo do que é mostrado na Figura 2. As junções formadas entre as células polarizadas prevenir equilíbrio passivo de pequenas moléculas entre os compartimentos apical e basolateral. Assim, uma modificação do ensaio de equilíbrio de sódio fluoresceína é utilizada para confirmar a polarização de Calu-3 LCC 15,17,18. À medida que o TEER de monocamadas de células Calu-3 em aumentos de LCC, a quantidade de fluoresceína que equilibra passivamente no compartimento basolateral diminui. Uma vez que o TEER é 1000 × Ω cm 2, a quantidade de fluoresceína, que se equilibra, empara o compartimento basolateral é ≤ 1%, como mostrado na Figura 3 e, portanto, Calu-3 LCC são consideradas totalmente polarizado quando o TEER é ≥ 1,000 Ω × 2 cm. A medição do pico de TEER Calu-3 LCC podem variar de experiência para experiência. No entanto, uma vez que os valores TEER plateau para qualquer dada experiência, um totalmente polarizado, uninfected Calu-3 LCC pode ser estável durante 5 a 12 semanas após a semeadura. A ausência de desenvolvimento de resistência em Transwell-cultivadas Calu-3 pode ser causada por diversos factores como descritas na Tabela 1. Uma vez que o TEER de Calu-3 planaltos LCC em ou acima de 1000 × Ω cm 2, o modelo está pronto para ser usado para examinar As respostas das células epiteliais das vias aéreas a agentes patogénicos respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV). A exposição a resultados de RSV em um declínio mais rápido na integridade cultura polarizada em comparação com uma infecção simulada, de células (Figura 4). Figura 1. Células secção transversal da representação Transwell-cultura de células. São cultivadas na superfície da membrana apical de inserção. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figura 2. Desenvolvimento de trans-epitelial de resistência eléctrica (TEER) e polarização de células Calu-3 após a semeadura em inserções Transwell. Em cada ponto de tempo, TEER é apresentada como mediana Ω x cm 2 ± SEM de 32 poços independentes de uma experiência representativa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figura 3. Passiva equi<html> bração de fluoresceína de sódio no compartimento basolateral de monocamadas de células Calu-3 é inibida como as células tornam-se polarizada. dados acumulados de quatro experiências independentes são apresentados. Cada ponto de dados representa uma medição individual. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figura 4. RSV infecção de polarização Calu-3 LCC acelera um declínio na integridade monocamada. Polarizados Calu-3 células foram infectadas com RSV-A2 a uma MOI = 1, no dia 0, e a polaridade foi monitorizada durante 8 semanas após a infecção. Um experimento representativo é mostrado. Os dados são apresentados como média resistência de 8 poços independentes por infecção ± SEM por ponto de tempo. * P &lt;0,05 entre as culturas falsamente e RSV-A2 infectados, como determinado pelo teste t de Student. maneiras &quot;&gt; <tbody><tr><td> Questão </td><td> Resolução (s) </td></tr><tr><td> A resistência não é mensurável </td><td><ul><li> Remova todas as bolhas de ar nos poços </li><li> Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes </li><li> Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada </li><li> Verificar que as células não estão em crescimento sobre o plástico bem abaixo do elemento de inserção (o que indica que as células podem ter crescido através dos poros da pastilha) </li><li> Permitir 2-3 semanas pós-sementeira para o desenvolvimento de resistência plena </li><li> Verifique a composição e tamanho de poro de pastilhas usadas, se necessário, alterar (insert poliéster recomendada, 0,3 ^ M de tamanho de poro, sem revestimentos, ver materiais para detalhes) </li><li> Verificar a qualidade do eléctrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumuladas a partir da ponta, e substituindo, se necessário </li><li> Verifique meio para o crescimento de bactérias </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Resistência desenvolve, mas polarização plena (≥ 1,000 Ω × cm 2) não é alcançada </td><td><ul><li> Permitir tempo adicional para a polarização de desenvolver (ocasionalmente pode levar até 4 semanas) </li><li> Use Calu-3 células que foram subcultivadas a partir de estoque congelada a menos de 10 vezes </li><li> Não permitir que as células Calu-3 para atingir 100% de confluência em subcultura monocamada </li><li> Consistentemente substituir médio em culturas Transwell, alternando entre o terceiro dia e depois quarto após a alimentação anterior </li><li> Apenas as células de cultura de inserções que são colocados nas linhas exteriores das placas </li><li> Use muito diferente de inserções Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Células totalmente polarizar, mas a resistência não é consistente de uma leitura para a próxima </td><td><ul><li> Não perturbar ou empilhar placas na incubadora </li><li> Não causam vibrações na cabine de segurança biológica, enquanto Transwell plates estão sendo manipulados </li><li> Remova todas as bolhas de ar nos poços </li><li> Não perturbe a camada de células com ponteiras ao mudar de mídia ou realizar leituras Teer </li><li> Usar 200 ul de meio no compartimento apical; menor volume pode resultar em leituras instáveis ​​TEER </li><li> Verifique a qualidade do eletrodo, lixar suavemente para remover proteínas acumulados a partir da ponta, e se necessário, substituir </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resolução de problemas problemas que podem surgir quando a cultura de Calu-3 células de transwells. Vários fatores contribuem para a polarização cheio de Calu-3 células em líquido cobertas de culturas, o mais provável de que são destaque na tabela.

Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a opinião dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer uma cultura coberta de líquido polarizado de três células Calu usando um sistema de cultura Transwell para configurar o sistema de cultura Transwell. Primeiro, prepare uma placa transwell movendo as inserções para as fileiras externas da placa e adicionando meio às câmaras basolaterais de cada poço. O segundo passo é preparar células de cultura monocamadas em suspensões de células únicas.Em seguida, as células suspensas são assentadas nos compartimentos apicais das inserções transwell. A etapa final é substituir completamente os meios laterais apicais e basais. Em cultura, insere em um ciclo de três e quatro dias por duas a três semanas até que as células estejam totalmente polarizadas.Em última análise, a resistência elétrica transepitelial e um ensaio de equilíbrio passivo de fluoresceína sódica são usados para demonstrar a polarização de três culturas de calu cobertas por líquido. A principal vantagem de usar esta técnica em relação ao uso de células epiteliais brônquicas humanas normais é que o Calor três é mais acessível e se desenvolve mais rapidamente em culturas polarizadas Pronto para uso Todos os procedimentos para o cultivo de calu polarizado. Três culturas cobertas com líquido ou LCC são realizadas em um gabinete de biossegurança usando técnicas de cultura estéril.Comece preparando uma placa de 24 poços trans. Para semeadura usando pinça estéril, mova as inserções transwell do interior para as fileiras externas da placa sem tocar na inserção. As células de membrana só devem ser subcultivadas em poços nas fileiras externas da placa.A 600 microlitros de EMEM contendo 10% de FBS, doravante denominado EMEM 10% para cada compartimento basolateral. Para evitar a introdução de bolhas de ar, incline a pipeta contra a parede de cada compartimento e solte lentamente o meio no poço. Em seguida, separe Colu três células de frascos de cultura de tecidos e células de subcultura, conforme descrito no texto do protocolo, ressuspenda completamente as células lavadas em cinco mililitros de EMEM 10% pipetando suavemente para cima e para baixo, determine as contagens de células viáveis e totais pelo método de exclusão trian blue e prossiga apenas se 80% a 90% forem viáveis.Em seguida, em um tubo cônico estéril de 50 mililitros, dilua as células a uma concentração de duas vezes 10 elevado às seis células viáveis por mililitro. Com EMEM 10%, adicione 100 microlitros de três células calu ressuspensas ao compartimento apical de cada transpoço, exceto os poços A um e D um. Incline suavemente a pipeta contra o canal guia interno da parede de inserção e solte lentamente as células.Não toque a pipeta na membrana de inserção. Agite suavemente a suspensão de três células CALU durante esta etapa de assentamento para manter uma suspensão homogênea de células nos poços A um e D um, que serão poços de controle livres de células ou blanks a 100 microlitros de EMEM 10% sem células. Incube a placa do poço trans a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono na atmosfera do ar em uma incubadora onde a perturbação física será mínima para melhorar a eficiência da polarização.Não empilhe as placas umas sobre as outras três dias após a subcultura e coloque três células em poços trans, substitua completamente o meio aspire suavemente as inserções do poço trans usando uma pipeta capilar conectada a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave. Remova o meio apical de todos os poços primeiro e depois remova o meio basolateral de todos os poços. Não toque nas membranas de inserção durante a aspiração do meio.Adicione 200 microlitros de EMEM 10% ao compartimento apical dos poços livres de células A um e D um. Em seguida, para os poços assentados, direcionando o meio para o compartimento apical usando o lado do inserto para guiar a ponta da pipeta. Não adicione o meio diretamente nas células e não toque na membrana de inserção.Em seguida, adicione 600 microlitros de EMEM 10% aos compartimentos laterais basais para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos laterais basais. Adicione o meio a cada um inclinando a pipeta contra a parede de cada compartimento e liberando lentamente o meio no poço. Retorne a placa transwell para a incubadora após este primeiro meio. Substituição.O meio deve ser substituído em um ciclo alternado entre o quarto e o terceiro dia após a alimentação anterior até que as células estejam totalmente polarizadas. A polarização é monitorada avaliando a resistência elétrica transepitelial ou ruptura do CALU três LCC usando um volter que foi calibrado e testado. Para iniciar este procedimento, remova o eletrodo do etanol ao ar seco por cinco a 10 segundos e enxágue o eletrodo com EMEM estéril 10%Coloque o interruptor de modo do volter na configuração de resistência e ligue a energia.Comece as medições com os poços de controle livres de células para obter as medições de linha de base e, em seguida, continue com as medições para cada um. Bem, coloque suavemente o eletrodo em uma das três portas que permitem o acesso ao compartimento basolateral da cultura transwell. Coloque o eletrodo de forma que o fio mais longo toque levemente o fundo do poço externo e permaneça na vertical.E o chumbo mais curto está no meio de cultura de tecidos do compartimento apical sem tocar na membrana de inserção, pressione o botão de medição R e aguarde a estabilização da leitura. Repita para as outras duas portas de cada poço e registre as medições de todas as três portas para um total de três medições por poço para verificar se a polarização está completa. Um ensaio secundário que mede a difusão passiva de fluoresceína sódica entre os compartimentos apical e basolateral é realizado em uma a três culturas transwell.Remova cuidadosamente o meio dos compartimentos basal lateral e apical das culturas transwell que serão testadas. Enxágue as culturas transwell adicionando suavemente 600 microlitros de DPBS estéril à temperatura ambiente aos compartimentos basolaterais e 100 microlitros de DPBS estéril à temperatura ambiente aos compartimentos apicais. Remova cuidadosamente o DPBS dos poços.Adicione 600 microlitros de tampão não fluorescente estéril aos compartimentos basolaterais, seguidos por 100 microlitros de fluoresceína sódica estéril aos compartimentos apicais. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Depois de uma hora.Transfira a amostra tampão não fluorescente do compartimento basolateral de cada transwell de teste para um tubo limpo separado. Para análise, retirar da placa os poços de ensaio utilizados para examinar a difusão passiva de fluoresceína de sódio e eliminar. Retorne a placa com os poços de transe restantes para a incubadora.Coloque 100 microlitros de cada solução padrão de fluoresceína de sódio previamente preparada em triplicado em uma placa de fundo plano de 96 poços. Preparar três diluições de cada amostra lateral basal em tampão não fluorescente. Para cada amostra, adicione 100 microlitros de uma amostra não diluída e 100 microlitros de cada diluição em duplicata em uma placa de fundo plano de 96 poços.Mediu a absorbância da amostra em um leitor de placas EISA em 486 nanômetros ou 490 nanômetros. Para iniciar este procedimento, primeiro lave as células e o EMEM livre de soro com uma pipeta capilar conectada a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave aspire suavemente o meio de todos os poços, removendo o meio apical seguido pelo meio basolateral, aspire o meio dos poços livres de células A um e D um e, em seguida, dos poços semeados. Não toque nas membranas de inserção durante a aspiração do meio.Adicione 100 microlitros de EMEM livre de soro ao compartimento apical dos poços livres de células A um e D um e, em seguida, aos poços assentados direcionando o meio para o compartimento apical. Usando a lateral do inserto para guiar a ponta da pipeta. Não adicione meio diretamente nas células e não toque na membrana de inserção.Em seguida, 600 microlitros de EMEM livre de soro para os compartimentos basolaterais. Adicione o meio a cada poço trans inclinando a pipeta contra a parede do compartimento e liberando lentamente o meio no poço Aspire suavemente o meio livre de soro dos poços. Começando com poços não infectados ou simulados infectados, adicione as seguintes diluições de vírus ao compartimento apical dos poços trans apropriados.100 microlitros de EMEM livre de soro para poços não infectados. 100 microlitros de preparação livre de vírus diluída em EMEM livre de soro para poços simulados infectados e 100 microlitros de vírus diluídos em EMEM livre de soro para vírus. Depois disso, a 600 microlitros de EMEM livre de soro para todos os compartimentos basolaterais, incubar a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono por duas horas.Após duas horas, aspire o meio dos poços primeiro dos poços não infectados e simulados e depois dos poços infectados. Remova os sobrenadantes apicais primeiro, seguidos pelos sobrenadantes laterais basais. Por fim, substitua o meio por 200 microlitros de EMEM, 10% nos compartimentos apicais e 600 microlitros de EMEM 10% nos compartimentos basolaterais seguindo o método demonstrado neste vídeo.A resistência elétrica transepitelial ou rasgo de três culturas cobertas por líquido atinge um platô igual ou superior a 1000 M por centímetro quadrado dentro de três semanas após a semeadura. Um exemplo disso é mostrado nesta figura, uma vez que as junções apertadas formadas entre as células polarizadas impedem o equilíbrio passivo de pequenas moléculas entre os compartimentos apical e basolateral. Um ensaio de equilíbrio de fluorescência de sódio modificado é usado para confirmar a polarização de culturas cobertas por três líquidos.À medida que a camada de calu três monocamadas de células e culturas líquidas aumenta, a quantidade de fluoresceína que se equilibra passivamente no compartimento basolateral diminui, dados cumulativos de quatro experimentos independentes são apresentados aqui, e cada ponto de dados representa uma medição individual. Uma vez que a lágrima é 1000 de propriedade por centímetro quadrado, a quantidade de fluoresceína que se equilibra no compartimento basolateral BA é menor ou igual a 1% Portanto, calu três culturas cobertas de líquido são consideradas totalmente polarizadas quando a camada é maior ou igual a 1000 de propriedade por centímetro quadrado. Uma vez que a camada de três culturas cobertas por líquido se estabiliza em ou acima de 1000 de propriedade por centímetro quadrado, o modelo está pronto para ser usado para examinar as respostas das células epiteliais das vias aéreas a patógenos respiratórios, incluindo vírus sincicial respiratório ou RSV, conforme mostrado.Neste exemplo, a exposição ao VSR representado em vermelho resulta em um declínio mais rápido na cultura polarizada. A integridade em comparação com uma infecção simulada de células representadas em dados azuis é apresentada como resistência mediana de oito poços independentes por infecção, mais ou menos SEM por ponto de tempo. O asterisco indica P menor que 0,05 entre duas culturas simuladas e RSVA, conforme determinado pelo teste T de Student.Não se esqueça de que, ao trabalhar com agentes infecciosos, pode ser perigoso e você deve usar EPI adequado e usar boas práticas de laboratório ao realizar esses procedimentos.

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

Descrevemos um protocolo para um modelo tridimensional de co-cultura de vias aéreas infectadas, usando CFBE41o- células, macrófagos THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, estabelecido na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma nova plataforma para testar simultaneamente a eficácia dos antibióticos, a função da barreira epitelial e marcadores inflamatórios.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Os recentes avanços nos protocolos de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidos pelo homem permitem a derivação stepwise de tipos celulares específicos de órgãos. Aqui, fornecemos etapas detalhadas para a manutenção e expansão das células basais derivadas das vias aéreas derivadas do iPSC e sua diferenciação em um epitélio mucociliary em culturas de interface ar-líquido.

Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

O epitélio nasal é o principal sítio de barreira encontrado por todos os patógenos respiratórios. Aqui, descrevemos métodos para usar células epiteliais nasais primárias cultivadas como culturas de interface ar-líquido (LPA) para caracterizar interações coronavírus-hospedeiro humano em um sistema fisiologicamente relevante.

Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

A cultura de interface ar-líquido é comumente usada para desenvolver epitélio pseudoestratificado das vias aéreas, diferenciando células epiteliais brônquicas humanas normais primárias que imitam o lado apical das vias aéreas pulmonares. Aqui, descrevemos um protocolo fácil para determinar sua qualidade monitorando suas propriedades biofísicas, como função ciliar e integridade da membrana.

Determinando a função ciliar e a impermeabilidade da membrana do epitélio pseudoestratificado das vias aéreas pulmonares

Este artigo descreve a geração de um modelo complexo de barreira das vias aéreas multicelular composto por epitélio pulmonar derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), mesênquima, células endoteliais e macrófagos em uma cultura de interface ar-líquido.

Co-cultura de células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e imunes derivadas de iPSC para modelar a integridade da barreira das vias aéreas na saúde e doença pulmonar

Aprenda a estabelecer culturas líquidas de células Calu-3 polarizadas usando sistema Transwell para estudar função epitelial respiratória. Este método avalia polarização por TEER e fluoresceína.

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios In vitro (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios

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