A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

O objetivo geral deste procedimento é produzir complexos de proteínas usando o sistema de células de insetos do vírus multi back baula. Isso é feito gerando primeiro a construção multigênica, codificando o complexo proteico de escolha. O segundo passo é fazer um vírus baula composto que contenha a construção multigênica, transformando células bacterianas e rastreando os médios traseiros corretos.

Em seguida, isole o genoma viral do baula e use-o para infectar células de insetos em pequena escala em uma placa de seis poços após o teste de produção de proteínas. O complexo proteico de escolha é expresso em maior escala e purificado. Em última análise, o complexo de proteínas purificadas é usado para descobrir sua estrutura e função e, potencialmente, para a descoberta de medicamentos.

As principais vantagens dessa técnica sobre os sistemas de ecovírus existentes são duas. Os complexos MultiPro podem ser produzidos com inéditos. Além disso, o material produzido é de qualidade muito superior porque projetamos o ecovírus para a produção ideal de proteínas.

A implicação dessa técnica vai muito além das questões biológicas básicas. Nossa plataforma multi bag tem sido usada com sucesso para produzir proteínas que são promissoras novas vacinas candidatas para uma variedade de doenças e catalisar a pesquisa do câncer, produzindo conjuntos de proteínas-chave que causam o crescimento do tumor. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão um pouco de dificuldade com os processos e a necessidade de esterilidade.

Por isso, trabalhamos muito para estabelecer procedimentos operacionais padrão para tornar a aplicação do multibanco o mais fácil possível para usuários não especializados. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas robóticas são muito mais facilmente compreendidas quando o processo é mostrado em movimento. Isso você não pode extrair apenas olhando para os protocolos que estão escritos, não importa o quão detalhados sejam.

Antes de iniciar este procedimento, é importante planejar cuidadosamente a estratégia de co-expressão. Recomenda-se que o experimento seja simulado primeiro. In silico.

Os genes precisam ser distribuídos nos plasmídeos aceptores e doadores. O que funciona melhor é agrupar subunidades que podem formar submódulos fisiológicos. Como grandes complexos têm muitas subunidades de proteínas, muitos genes precisam ser expressos simultaneamente.

O sistema multi back simplifica muito a clonagem de genes usando rotinas automatizadas para colocar genes em pequenas moléculas progenitoras de DNA que contêm uma sequência curta de DNA chamada bloqueios P, que é reconhecida pela enzima Cree recombinase. Esses progenitores são então combinados em uma reação de uma etapa, adicionando pré-recombinase, que concatena tudo o que tem um local de P de salmão defumado em um grande plasmídeo de DNA. Esta construção multigênica é posteriormente inserida no genoma do vírus multi back bula.

Se um grande número de construções for gerado, recomenda-se o uso de scripts robóticos e uma estação de trabalho de manuseio de líquidos. A estação de trabalho está equipada com um vácuo para mini preparações e limpeza de PCR, um EEL para carregamento automático de amostras de PCR. Um termociclador para PCR e etapas de incubação, um agitador para ressus, suspensão de células e blocos frios.

Para enzimas, genes de interesse são inseridos em doadores e aceitadores selecionados usando enzimas de restrição e ligase ou, alternativamente, usando métodos independentes de ligação que validam todas as construções de doadores e aceitadores, clonados por mapeamento e sequenciamento de restrição. Prossiga com as combinações difusas de doadores aceptores por recombinação CRE LAX P para gerar as construções de expressão multigênica de sua escolha. As construções multigênicas montadas são validadas por reações analíticas de PCR com conjuntos de primers especificamente projetados.

Instantâneos do processo TR assistido por robô são mostrados aqui. Eles incluem a preparação de reações de PCR em placas de vários poços, o fornecimento de DNA molde e primers, amplificação de DNAs por PCR e preparação de construções multigênicas cultivadas em cultura bacteriana por lise alcalina em placas de vários poços. Para iniciar este procedimento, integre vetores de transferência multigênica no genoma viral multibula, transformando-se em células DH 10, abrigando o genoma viral e as funcionalidades necessárias para a transposição do TN sete.

Após TN, sete células de transposição com vírus baula composto contendo os genes de interesse são selecionadas por triagem branca azulada, sete transposições resultam em perda de complementação alfa do beta galacto. Portanto, as colônias com transposição correta de TN sete permanecem brancas em APLs seletivos contendo xal. Preparar culturas bacterianas das colónias brancas e isolar a retina por lise alcalina e precipitação de etanol isopropanol.

Em seguida, células de insetos transfectadas com o genoma viral bao purificado trabalhando em um capuz estéril, alíquotas de sementes de células de insetos SF 21 da fase logarítmica em uma placa de cultura de tecidos de seis poços. A cada um, adicione o genoma viral bao purificado e um reagente de transfecção misturado em meios de cultura. Incubar as células transfectadas a 27 graus Celsius sem movimento por 48 a 60 horas.

Após 48 a 60 horas, colha o vírus inicial ou V zero removendo o meio, reabasteça com meio fresco e retorne a placa à incubadora dois a três dias depois, teste a produção de proteína. E se um marcador YFP estiver presente, teste a fluorescência para amplificação do vírus. Use V zero, o vírus inicial, para infectar 25 a 50 mililitros de células em fase logarítmica em pequenos frascos agitados de erlenmeyer agitados em uma plataforma orbital.

O agitador conta as células e divide as células a cada 24 horas até que parem de dobrar. Siga uma baixa multiplicidade de infecção ou regime MOI, as células devem dobrar pelo menos uma vez, caso contrário, repita o experimento com um volume menor de V zero adicionado. A imagem à esquerda mostra células de insetos não infectadas após a infecção pelo vírus multi back baula.

As células de insetos infectados pararam de proliferar e aumentaram de tamanho, conforme ilustrado pela imagem à direita. Após 48 a 60 horas, colher V um vírus por peletização de células. Remova e armazene a mídia que contém o vírus.

Suspender as células com meios frescos e transferi-las de volta para o erlenmeyer. Remova uma vez 10 para as seis células a cada 12 ou 24 horas por peletização e teste a produção de proteínas e o sinal da proteína marcadora se forem desejados volumes de expressão maiores. Amplifice ainda mais o vírus infectando até 400 mililitros de células em frascos agitadores de dois litros com o vírus V one.

Seguindo o regime de baixo MOI, recomendamos fortemente que o vírus V one seja armazenado como o vírus de produção usando as células de insetos infectadas pelo vírus ular ou métodos VIC para evitar modificações do vírus recombinante e preservar altos níveis de expressão. 24 horas após a parada da proliferação é observada células infectadas com pellets. Nesse estágio, as células contêm partículas virais completas pouco antes de serem liberadas na mídia.

Remova o meio, ressuspenda o pellet celular em solução de congelamento e execute o congelamento de BIIC em tubos criogênicos para produção de proteínas. Use alíquotas V um V dois ou BIC congeladas para infectar culturas de células maiores. Normalmente, 400 mililitros em frascos de dois litros aderem ao regime de baixo MOI.

Ajustar o volume do vírus usado para infecção de forma que a cultura infectada dobre pelo menos uma vez. Se uma proteína marcadora YFP estiver presente, retire uma vez 10 para as seis células em intervalos definidos, sonice e centrifugue as células e transfira para uma placa de 96 poços meça os níveis de YFP em um leitor de placa padrão de 96 poços capaz de registrar sinais fluorescentes e monitorar a evolução do sinal YFP até que um platô seja alcançado, indicando a produção máxima de proteína recombinante. Colher células nesta fase, armazenar pellets celulares a menos 20 graus Celsius para o curto prazo ou menos 80 graus Celsius para o longo prazo as células devem ser liotadas por um método adaptado às necessidades da proteína e, em seguida, do citosol e núcleos.

Proteínas nucleares fracionadas são normalmente encontradas no pellet nuclear. Enquanto as proteínas citosólicas permanecem no citosol. A purificação de proteínas é bastante simplificada pelo fracionamento.

Uma vez que muitos contaminantes podem ser removidos em uma única etapa de centrifugação. Os complexos de proteínas podem ser convenientemente purificados a partir de culturas de células iniciais em pequena escala, utilizando métodos de purificação miniaturizados, como purificação baseada em vários poços ou micropontas. Em conjunto com sistemas de cromatografia de pequeno volume, como o micro ACTA, um passo futuro será miniaturizar e integrar toda a configuração experimental em um pequeno aplicativo de mesa que faz interface com a estação de trabalho de clonagem.

Aqui é mostrado o robô em lote em microescala atualmente em desenvolvimento, que será usado para esse fim. A forte co-expressão de proteínas heterólogas é alcançada pelo sistema multi back, como mostrado aqui. As proibições de proteínas superexpressas são claramente discerníveis no extrato de células inteiras, WCE e no lisado eliminado.

Sn.A qualidade e a quantidade do material proteico produzido são muitas vezes suficientes. Permitir a determinação estruturada de complexos proteicos, como o MCC complexo de ponto de verificação mitótico mostrado neste diagrama. Freqüentemente, o rendimento dessas execuções de purificação analítica é suficiente para analisar a estrutura e a função do complexo purificado por uma variedade de meios, incluindo microscopia eletrônica.

Os procedimentos operacionais padrão que desenvolvemos permitem que usuários não especialistas apliquem nossa abordagem com facilidade e nossa tecnologia pode ser usada em muitos laboratórios interessados em grandes complexos de proteínas, muito parecido com o caso hoje para pequenas proteínas em Nikola. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o multi bag para produzir seus complexos de proteínas de interesse em quantidade e qualidade incomparáveis para seus ambiciosos objetivos de pesquisa. Trabalhar com nossos sistemas não requer condições especiais de segurança.

No entanto, lembre-se de que o vírus irá infectá-lo se você for desleixado, mesmo que não se replique em suas células. Portanto, o manuseio cuidadoso de suas condições de esteróides é uma obrigação ao realizar este procedimento. Nosso método já se tornou bastante popular em mais de 600 laboratórios em todo o mundo.

Use nossa técnica. Acreditamos que, no futuro, nosso método se tornará parte integrante dos esforços de genômica estrutural em larga escala que abordam a zona complexa humana. Isso pode ajudar a revelar a base das doenças e, a longo prazo, levar a novos e melhores medicamentos e terapias.