Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral do experimento a seguir é medir as propriedades mecânicas do glicocálice endotelial usando um microscópio de força atômica ou um FM. Isso é conseguido pela primeira cultura, uma monocamada de células endoteliais sob um fluxo fisiológico em um biorreator, a fim de construir a camada de glicocálice como uma segunda etapa. Grânulos do tamanho de mícrons são fixados a um balanço FM e usados como uma sonda para medir a força resistiva do corpo celular e do glicocálice durante o recuo. Em seguida, as curvas de indentação são ajustadas com um modelo de duas camadas para determinar o módulo de glicocálice e são obtidos resultados de espessura que mostram que o glicocálice endotelial tem um módulo de 0,7 quilo pascals e uma espessura de 380 nanômetros com base na análise de duas camadas.

Olá, sou Rick Wa.Sou presidente de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. Tem havido muita discussão nos últimos anos sobre o possível papel do glicocálice endotelial na inflamação, em particular se ele pode atuar como uma barreira protetora para evitar a adesão celular indesejada durante a inflamação. Uma das chaves para resolver as questões que cercam essa questão é a capacidade de medir as propriedades físicas, ou seja, a espessura e a rigidez dessa camada, tanto em condições normais quanto durante a resposta inflamatória.

Eu sou Graham Marsh. Sou estudante de pós-graduação no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. O grande problema em caracterizar o glicocálice endotelial é que ele é incrivelmente macio.

A abordagem que criamos é fixar um grande cordão na ponta do balanço A e A FM para que as forças medidas sejam resolúveis com o A FM.To iniciar este procedimento, construir uma câmara de fluxo como a mostrada aqui, capaz de cultivar células sob uma tensão de cisalhamento de 1,0 Pascal. Prepare a câmara de fluxo para o experimento limpando primeiro as lâminas de vidro em solução de piranha por 15 minutos. Enxaguando-os três vezes com água destilada e secando-os a 70 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, cubra as lâminas com amino propil trixi, cy lane ou apte por deposição de vapor. Adicionar um mililitro de apte a um balão que está ligado à câmara de vácuo com a amostra. Em seguida, tampe o balão e puxe um vácuo de 0,7 bar por uma hora.

Durante esse tempo, atualize o aspirador três vezes. Em seguida, corte uma nova junta da câmara de fluxo de uma folha de silicone de 0,4 milímetro de espessura usando uma ferramenta de corte SD de silhueta. O canal mede 6,4 milímetros de largura por 19 milímetros de comprimento, e o diâmetro externo é cortado em 35 milímetros para caber na antena de cultura do asilo.

Usando essas dimensões, calcule a vazão necessária para gerar uma tensão absoluta de um pascal com a equação mostrada aqui. Q representa a taxa de fluxo. Tau é o puro estresse.

Mu é a viscosidade do meio. H é a altura do canal e W é a largura da câmara de fluxo. O próximo passo é alinhar a parte superior da câmara de fluxo com a junta na placa de cultura de células e prendê-la com um anel magnético.

Conecte as portas de fluxo na placa de cultura de células a três válvulas de onda com linhas para as seringas de 30 mililitros. Em seguida, esterilize todo o conjunto lavando com álcool isopropílico por cinco minutos. Em seguida, remova o álcool e deixe-o secar ao ar no tecido.

Capuz de cultura Pré-aquecido 4% soro fetal de bezerro em McCoy médio a 37 graus Celsius. Depois de deixar secar por cinco a 10 minutos, lave o álcool restante com 30 mililitros do soro fetal pré-aquecido para bezerros. Em seguida, encha as seringas com 20 mililitros de meio de crescimento veek MCDB 1 31.

Em seguida, tampe as seringas para evitar contaminação. Ao mover o sistema para fora da coifa estéril, encaixe a tampa do reservatório de captura com a agulha que alcança o fluido para puxar o meio de volta ao reservatório a montante. Finalmente, conecte filtros estéreis de 0,2 mícron às entradas de ar nas tampas da próxima colheita da veia umbilical humana.

Células endoteliais crescidas até a confluência em um frasco T 25. Suspender novamente as células peletizadas a 100 000 células por mililitro em meio e colocar a solução numa seringa. Em seguida, injete a suspensão na câmara de fluxo através da válvula de três vias.

Deixe as células assentarem e aderirem ao substrato de vidro por duas horas. Antes de iniciar o fluxo, mova o biorreator e as células para uma incubadora onde as células possam se acomodar e aderir por duas horas. A tubulação que conecta os reservatórios a uma bomba peristáltica passa pela parte traseira da incubadora Uma vez que as células tenham aderido, ajuste a bomba peristáltica para a vazão desejada.

O meio se move entre os reservatórios, criando uma carga de pressão e um fluxo através do biorreator que produz uma tensão de cisalhamento da parede de um pascal. Deixe as células incubarem com fluxo contínuo a 37 graus Celsius por um a cinco dias até que a câmara esteja confluente. Para iniciar a preparação do cantilever, limpe uma ponta mais um cantilever FM em ácido nítrico por cinco minutos, seguido de um enxágue com água destilada.

Depois de seco, funcionalize o cantilever com apdi em uma câmara de deposição de vapor, conforme mostrado anteriormente para as lâminas de vidro. Em seguida, prepare uma solução de cinco miligramas por mililitro em peso NHS Sulf O lc, biotina na solução salina tamponada de Hank. Mergulhe os cantilevers na solução por 15 minutos.

Esta reação conjuga o CY e o óxido hidroxi final e apresenta moléculas de biotina na superfície dos cantilever. No dia anterior, comece a preparar uma solução de meio livre de biotina combinando 20 mililitros de meio de cultura vexcel contendo 20% de soro com 200 microlitros de esferas revestidas com ENC e incube por 12 horas durante a rotação. No dia do experimento.

Puxe as esferas magnéticas para o fundo do tubo com um ímã por dois minutos e transfira o sobrenadante contendo meio livre de biotina para um novo tubo. Esterilize o meio passando-o por um filtro de 0,22 micrômetro e coloque-o em um novo tubo. O próximo passo é remover a câmara de fluxo da placa de cultura de células e, em seguida, lavar as células três vezes com dois mililitros de 37 graus Celsius, meio livre de biotina.

Em seguida, adicione um micrograma de 2,4 micrômetros de diâmetro, contas revestidas de Aden descascadas. Adicione uma concentração de 10 microgramas por mililitro na placa de cultura de células e misture delicadamente. Em seguida, calibre o A FM tib prendendo-o a um cordão de alfinete e pressionando-o em uma superfície de vidro simples.

Para conseguir isso, coloque a ponta na superfície do vidro ao lado de um cordão, retraia a ponta, posicione o ápice do cantilever sobre o cordão e pressione para baixo por vários segundos. Por fim, use o cantilever calibrado para recuar as amostras. Os grânulos de 2,4 micrômetros oferecem uma área de contato maior com a superfície da célula para que as propriedades mecânicas da camada macia de glicocálice possam ser detectadas com mais facilidade.

Para realizar essa posição, o cantilever sobre uma célula próxima ao núcleo da célula, use uma abordagem suave da ponta na célula para definir a altura do cantilever aproximadamente três micrômetros acima da superfície da célula. Em seguida, recue a superfície 20 vezes a uma taxa de um micrômetro por segundo até uma força máxima de sete. Os nano newtons permitem que seis segundos de tempo decorram entre contatos sucessivos.

Calcule a espessura da camada de glicocálice usando equações relacionadas à teoria do hertz. A força de recuo F é descrita por esta equação onde delta é a profundidade de recuo. R é o raio da esfera e estar é o módulo combinado dos materiais sob tensão.

A fim de separar o módulo de elasticidade combinado em componentes celulares e glicocálices, trate a camada de glicocálice como uma película macia fina e uniforme na superfície do corpo celular e use o modelo de duas camadas de Clifford e, C.In esta equação, PQ e N são constantes empiricamente determinados a partir de ajustes de polímero. M é uma constante do modelo de polímero e Z está relacionado à espessura do filme fino ou camada de glicocálice pela equação mostrada aqui. A força medida pelo A FM medido em nano Newtons começa a aumentar após o contato com a superfície e é inicialmente dominada pelo componente da camada de glicocálice.

Uma vez que a camada de glicocálice é comprimida, o corpo celular se torna o principal componente da deformação. A linha de ajuste azul de duas camadas foi calculada ajustando quatro parâmetros livres para que correspondesse aos dados de recuo mostrados em vermelho da equação usada para determinar o módulo da célula, o glicocálice, o módulo da camada e a espessura da camada de glicocálice. As propriedades de 25 células foram compiladas no histograma mostrado aqui.

O módulo médio da camada de glicocálice foi determinado em 0,7 mais ou menos 0,5 kipa cals, e a espessura da camada de glicocálice foi determinada em 380 mais ou menos 50 nanômetros. Essa abordagem nos dá a ferramenta de que precisávamos para responder a perguntas fundamentais sobre o papel do glicocálice na regulação da adesão celular durante a inflamação. Agora podemos abordar questões sobre como as propriedades do glicocálice são alteradas durante a inflamação.

Por que meios essas mudanças são realizadas. Essa abordagem pode ser estendida de várias maneiras. Por exemplo, pode-se usá-lo para testar descrições teóricas novas e mais sofisticadas das propriedades do glicocálice.

Ou, em um nível mais prático, pode-se usar isso para testar revestimentos de superfície bioinspirados, projetados para proteger os dispositivos implantáveis da resposta imune no hospedeiro. Muito obrigado pelo seu interesse em nosso trabalho.