Name: O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprenda a usar quimiostatos para controlar o crescimento celular em biologia de sistemas microbiana. Este método permite investigações precisas sobre regulação do crescimento e evolução adaptativa.

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Este trabalho foi apoiado pelo arranque fundos da Universidade de Nova Iorque. Agradecemos Maitreya Dunham e Matt Brauer, que inicialmente desenvolveu o uso de biorreatores Sixfors como quimiostatos.

O princípio da cultura contínua usando um quimiostato pode ser realizado em uma variedade de implementações. Em todos os quimióstatos é essencial ter um) métodos para manter a esterilidade de todos os componentes, 2) uma cultura bem misturada, 3) arejamento adequado do vaso de cultura e 4) um meio confiável de adição e remoção de meios de cultura. Aqui, descrevemos a utilização de um bioreactor de Sixfors (Infors Inc) como um quimiostato utilizando métodos que podem ser prontamente adaptados para configurações alternativas. 1. Montagem das embarcações chemostat <ol><li> Ligue os Sixfors usando o interruptor principal. </li><li> Lave bem o recipiente chemostat, montagem agitador, e tubos ligados com deionizada (DI) de água. Confira toda a tubulação e o-rings e substituir quaisquer peças desgastadas procurando. </li><li> Certifique-se a base de apoio veio de accionamento está virada para cima no recipiente de vidro e que a parte superior do veio de accionamento é encaixado no seu alojamento no conjunto agitador. Defina o stirremontagem r-se no reactor de vidro assegurando a parte inferior do veio de accionamento está encaixado no suporte de eixo rígido. Use o grampo para fixar o conjunto do agitador para o recipiente de vidro. </li><li> Encher o vaso com cerca de 300 ml de água DI. </li><li> Retire as tampas de um oxigênio dissolvido (OD 2) sonda e verificar o nível do eletrólito, desapertando a carcaça inferior e certificando-se de que a caixa do fundo está cheio até a metade com solução eletrolítica. Rescrew o revestimento inferior e inserir na porta do navio chemostat. Aperte até dedo apertado. </li><li> Dê uma sonda de pH e removê-lo de seu buffer de armazenamento (3 M KCl). Retire a tampa da sonda de pH e anexar ao fermentador 1. Usando a tela de controle Sixfors, navegue até o menu de parâmetros de fermentação e selecione &quot;calibrar pH&quot;. Coloque a sonda de pH em um buffer padrão pH 7 e registre a leitura como alta Read. Repita com tampão pH 4 e registre a leitura como Low Read. Retire a sonda de pH do fermentador, lavar com água DI e introduzir a sonda into porto no navio chemostat. Aperte até dedo apertado. </li><li> Colocar o recipiente chemostat no rack. Nota sobre a embarcação que fermentador (1-6) a sonda de pH foi conectada e calibrado. Coloque a tampa da sonda de pH na sonda de pH. Usando folha de cobrir bem a parte superior da sonda DO 2. </li><li> Dobrar a folha ao longo das extremidades do tubo ligado ao recipiente de quimiostato. </li><li> Repita os passos de 1,2-1,8 para todas as embarcações. </li><li> Esterilizar por autoclavagem dos vasos lhes durante 15 minutos num ciclo de líquidos. </li></ol> 2. Preparação da mídia <ol><li> Estabelecer a faixa-limite de concentração de um nutriente por uma crescente cultura de lotes em diferentes concentrações de nutrientes. O nutriente é limitante na gama em que a densidade celular final é uma função linear da concentração de nutrientes inicial (Figura 4). Selecione uma concentração de nutrientes bem dentro da faixa de limitação. Exemplos de composição de mídia padrão para estudos com Saccharomyces cerevisiae estão disponíveis em 7-11. </li><li> Autoclave um garrafão vazio que é tapado com uma rolha de borracha que contém uma entrada de ar e meios de saída após a primeira assegurando que a extremidade do tubo de media está coberta em folha. </li><li> Em um recipiente separado preparar 10 L de meios de comunicação. </li><li> Coloque uma xícara de 500 ml de filtro para um frasco de 100 ml de mídia. Retire o filtro de algodão com uma pinça esterilizados em etanol e anexar imediatamente à porta filtração no garrafão mídia. </li><li> Prenda o garrafão de mídia a uma fonte de vácuo e filtro de esterilizar mídia, adicionando-o ao copo do filtro. </li><li> Quando filtração dos meios de comunicação é completa, fechar a porta de filtração com uma braçadeira de metal. </li></ol> 3. Calibrar fazer 2 Sondas e Configurando chemostat <ol><li> Depois de os vasos em quimiostato foram autoclavados e deixou-se arrefecer o lugar do navio no seu revestimento de calor correspondente. Ligue o sensor de temperatura, sonda de pH, e fazer 2 sonda. Deixe onavio sentar-se com o poder por pelo menos 6 horas para permitir que os fazer 2 sondas de polarizar. </li><li> Coloque a extremidade de cada tubo de efluentes em um receptáculo de coleta separado. Conecte o suprimento de ar através de um filtro autoclavado e ativar o fluxo de ar. A água em cada navio deverá sair dos tubos de efluentes, o que indica que todos os selos são devidamente formado. </li><li> Ajustar a altura do tubo efluente de acordo com o volume de trabalho desejado (por exemplo, 300 ml). Usamos uma régua que está marcado com a colocação de tubos calibrados para diferentes volumes de trabalho. </li><li> Conecte o garrafão de mídia para o navio chemostat. Use etanol, a fim de manter o tubo termina como estéril quanto possível. Passe a tubulação da bomba através da bomba e pinça aberta. Pressionar manualmente a bomba até que a mídia começa a fluir para dentro do vaso chemostat. Solte a tubulação da bomba, a mídia deve fluir livremente para dentro do vaso chemostat. Quando a mídia atinge o tubo de efluentes, recoloque a tubulação à bomba e pinça. </li><li> Comece running o programa básico com impulsor conjunto a 400 rpm e a temperatura fixada em 30 ° C. </li><li> Para calibrar fazer 2 sondas, desligue o suprimento de ar e mudar para o gás nitrogênio. Espere pelo menos uma hora e registro de valor medida como &quot;baixo de leitura&quot;. Volte para o fornecimento de ar (ou seja, contendo concentração de oxigênio ambiente), espere pelo menos uma hora e medição registro como &quot;alta de leitura&quot;. </li><li> Iniciar a gravação de dados usando o software Iris. </li></ol> 4. Inoculação <ol><li> Usar 70% de etanol para esterilizar a parte superior do vaso de cultura. </li><li> Remover o parafuso na parte superior do vaso e pipeta de 1 ml de uma cultura durante a noite para dentro do vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. </li><li> Indique o tempo de inoculação em Iris. </li><li> Espere cerca de 24 horas para que as culturas para atingir fase estacionária adiantada. À medida que a cultura cresce, oxigênio dissolvido e pH diminuirá. No caso dos meios de limitação de glucose, oxigénio dissolvido voltará a ~ 100% em pha estacionáriasi. Por outras limitações nutricionais oxigénio dissolvido permanecerá &lt;100% na fase estacionária. </li></ol> 5. Iniciando Bombas e Atingir estado estacionário <ol><li> A taxa de diluição é calculada dividindo o caudal (quanto mídia flui para dentro do vaso por hora) através do volume de cultura. Por exemplo, usando um volume de 300 ml, uma taxa de diluição de 0,1 significa que 30 ml de meio é adicionada à cultura a cada hora. Uma vez que o sistema se encontra sob pressão positiva o mesmo volume é removido a partir do vaso de assegurar que a cultura é continuamente diluído. Uma gama de taxas de diluição (D) pode ser usado, que não excedam a taxa máxima de crescimento (μ max) das células, acima do qual as células serão lavadas para fora do chemostat. </li><li> Escolha as configurações de bomba, que especificam o número de segundos a bomba é ligado e desligado, para estabelecer a vazão desejada. A bomba fornece meios de comunicação, a uma taxa de ~ 0,11 ml / seg. </li><li> Definir um programa usando o Sixfors interface que especifica o tempo da bomba, a temperatura ea velocidade do rotor. Inicie o programa. </li><li> Esvazie os recipientes de coleta de líquido e registrar o tempo. </li><li> Depois de pelo menos duas horas, utilizar uma proveta para medir a quantidade de meios de comunicação tenha sido removido a partir do vaso. Isto será igual ao volume que foi adicionado ao recipiente de quimiostato. Calcular a taxa de diluição (D = V efluentes / V Cultura / tempo). Ajuste as configurações da bomba se a taxa de diluição calculada não coincide com taxa de diluição desejada. </li><li> No estado estacionário, a densidade celular no quimiostato não muda ao longo do tempo. Isto pode ser medido sem perturbar a cultura através da amostragem do fluxo de saída. Nós operacionalmente definir atingir o estado estacionário como medições da densidade de células idênticas que são separadas por pelo menos uma duplicação da população. Alcançando estado estacionário levará aproximadamente oito gerações de cultura após o início da diluição da cultura. No estado de equilíbrio, as células crescem exponencialmente (i.e. taxa de crescimento constante ao longo do tempo), em condições limitadas em nutrientes. O tempo de duplicação da população (tempo de geração) é ln (2) / D. </li><li> Continuar a medir periodicamente efluentes para a duração da experiência para assegurar que uma taxa de diluição é mantida constante. </li></ol> 6. Aplicação 1: estudar as células a crescer a taxas diferentes em condições de estado estacionário <ol><li> No estado estacionário no quimiostato, a taxa de crescimento da população de células é igual à taxa de diluição. Ao alterar sistematicamente a taxa de diluição é possível cultivar células em taxas diferentes. Isso permite que o estudo sistemático de parâmetros fisiológicos que variam de acordo com a taxa de crescimento, incluindo o volume da célula, o estágio do ciclo celular e resistência ao estresse. Além disso, os perfis de estado estacionário de ARNm globais, proteína e níveis de metabolito pode ser ensaiada em células em crescimento em taxas diferentes. Há duas maneiras de adquirir amostras: </li><li> Pequenas amostras podem ser passivamente obretidos pela colocação da extremidade do tubo efluente em um tubo de 1,5 ml ou 15 ml. Uma amostra de 1-5 ml pode ser obtido em poucos minutos (dependendo da velocidade de fluxo). Muitos parâmetros fisiológicos pode ser medido a partir dessas amostras. </li><li> Expressão de genes, ou de metabolito análises exigem maiores amostras que devem ser obtidos mais rapidamente possível. Coloque a extremidade do tubo efluente em um tubo cónico de 15 ml. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurrar para baixo suavemente. A ~ 10 ml de amostra vai rapidamente preencher o seu tubo. Tenha em atenção que o volume no vaso de quimiostato mudou. Se várias amostras consecutivas são tomadas pode ser necessário para reduzir o fluxo para manter uma taxa de diluição constante. </li></ol> 7. Aplicação 2: Medição precisa das diferenças de taxas de crescimento entre os genótipos em ambientes controlados usando ensaios de competição baseados em citometria de fluxo <ol><li> Quimióstatos pode ser utilizado para quantificar com precisão o efeito da concentração de nutrientessobre as diferenças nas taxas de crescimento (ou seja, de aptidão) entre diferentes origens genéticas. Por estirpes de co-cultura marcados com diferentes proteínas fluorescentes a taxa de alteração na abundância relativa durante o crescimento exponencial é determinada. A realização deste ensaio, em diferentes taxas de diluição (D) permite o estudo dos efeitos de concentração de nutrientes (s) sobre as diferenças de aptidão. </li><li> Estabelecer culturas de estado estacionário das duas linhagens nos vasos quimiostato separadas com taxas de diluição idênticos e um volume de 300 ml. </li><li> Passivamente amostra 1 ml de cada navio. Gire as células, ressuspender em tampão fosfato (PBS) e colocar a 4 ° C. Estas amostras contêm amostras de células homogêneas, que são controles para a análise de citometria de fluxo subseqüente. </li><li> Coloque o tubo de efluentes de um navio em um cilindro graduado autoclavado. Solte o parafuso que prende a ponta de metal do tubo de efluentes e empurre para baixo para expelir as células do chemostat. Quandoo volume atinge 150 ml, devolver o metal final do tubo efluente para a sua posição original (300 ml). Repetir com o segundo vaso, utilizando uma proveta graduada diferente. </li><li> Use etanol a 70% para manter a esterilidade durante a remoção do parafuso na parte superior do vaso de quimiostato. Coloque funil na abertura e despejar 150 ml de outra cultura no vaso quimiostato. Volte a apertar o parafuso. Repetir com o segundo vaso, usando o segundo funil. Cada vaso quimiostato agora contém uma mistura das duas estirpes. </li><li> Obter uma amostra de 1 ml de cada navio utilizando amostragem passiva cada 2-6 horas. Gire as células, ressuspender em PBS e armazenar a 4 ° C. Continue a tomar amostras para a gravação de 2-3 dias com cuidado o tempo que cada amostra foi colhida. </li><li> No fim do experimento, sonicado e diluir as amostras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Utilizando citometria de fluxo, medir a proporção das duas estirpes em cada amostra. Como ambas as tensões estão crescendo exponencialmente, a diferença da taxa de crescimento relativo édeterminada por regressão linear de ln (strain1/strain2) contra o tempo (medido em gerações). O declive da regressão é proporcional à diferença na taxa de crescimento (isto é, a vantagem de fitness) de uma estirpe em relação à outra. </li><li> Como a cultura mista pode levar algum tempo para atingir um novo estado de equilíbrio, momentos precoce pode caber mal à regressão. Esta questão é melhor resolvido, permitindo 2-3 gerações a decorrer antes de iniciar a amostragem ou removendo pontos iniciais, que são valores atípicos claras. Por outro lado, uma vez que uma cepa tem suplantado o outro os dados não são mais úteis e esses pontos devem ser excluídos. </li></ol> 8. Aplicação 3: Evolução Experimental <ol><li> Evolução Experimental realizado em quimiostatos seleciona para mutantes que são aumentados em fitness no ambiente limitado em nutrientes. Seleção geralmente é realizada ao longo de centenas de gerações. </li><li> Estabelecer uma cultura chemostat estado estacionário utilizando uma cepagenótipo do conhecido (e seqüência do genoma de preferência conhecida) e um nutriente-limitação definida. </li><li> Para manter um &quot;registro fóssil&quot; da população adaptação passiva provar chemostat cada 2-3 dias e armazenar a amostra em 15% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Monitorar o reservatório mídia e reabastecer com meios frescos, se necessário. </li><li> Manter a cultura exponencialmente crescente de várias centenas de gerações. </li><li> Após a conclusão da placa de selecção de uma amostra de células em placas de agar sólido. Após as células se transformaram em colônias, pegar uma amostra imparcial de colônias usando palitos de dente e inocular clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 ml de mídia. Permitir amostras clonais para crescer durante a noite, adicionar 100 ml de 30% de glicerol e armazenar em -80 ° C. </li><li> Caracterizar clones por seqüenciamento do genoma inteiro e realizando ensaios fenotípicos, incluindo a avaliação de aptidão física, utilizando uma estirpe de referência comum fluorescente etiquetado, conforme descrito na Aplicação 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Quimióstatos permitir o cultivo dos microrganismos em condições de estado estacionário de crescimento controlado. As células crescem continuamente a uma velocidade constante, resultando em um ambiente externo invariante. Isto está em contraste com os métodos de cultura em lotes em que o ambiente externo está em constante mudança e a taxa de crescimento das células é determinado pela interacção complexa de ambiente e genótipo. Assim, uma importante vantagem da cultura de micróbios em quimióstatos mais culturas de lote é ...

O crescimento das células é regulada por redes complexas de interagir factores genéticos e ambientais 1,2. O regulamento multifatorial do crescimento celular exige uma abordagem em nível de sistema para seu estudo. No entanto, o estudo rigoroso do crescimento celular regulamentada é desafiado pela dificuldade de controlar experimentalmente a velocidade com que as células crescem. Além disso, até mesmo nas experiências mais simples condições extracelulares são freqüentemente dinâmico e complexo como as células alteram continuamente o seu ambiente à medida que proliferam. Uma solução para estes problemas é fornecido pelo quimiostato: um método de cultura de células que permite o controlo das taxas de crescimento experimental de células em ambientes definidos, invariante e controladas. O método de cultura contínua usando um quimiostato foi descrito de forma independente por Monod 3 e Novick &amp; Szilard 4 em 1950. Como originalmente concebida, as células são cultivadas em um volume fixo de mídia que é connuamente diluída pela adição de novas mídias e remoção simultânea de mídias antigas e células (Figura 1). Acoplado equações diferenciais ordinárias (Figura 2) descrevem a taxa de variação da densidade de células (x) e a concentração de um nutriente limitante do crescimento (s) no recipiente de quimiostato. Importante, este sistema de equações prevê uma única (não-zero) estável no estado estacionário (Figura 3), com a implicação notável que, no estado estacionário, a taxa de crescimento específico das células (ou seja, a constante da taxa de crescimento exponencial) é igual à taxa em que a cultura é diluída (D). Através da variação da taxa de diluição é possível estabelecer populações de estado estacionário de células em diferentes taxas de crescimento e sob diferentes condições de limitação de nutrientes. O controle experimental da taxa de crescimento usando quimiostatos foi fundamental para o desenvolvimento de uma compreensão de como as mudanças fisiologia celularcom taxas de crescimento de 5,6. No entanto, este antigo pilar de métodos microbiológicos tornou-se cada vez mais obscuro durante a explosão na investigação em biologia molecular, durante o final do século XX. Hoje, renovou o interesse no controlo do crescimento de ambos os micróbios e organismos multicelulares e o advento de métodos genoma escala para análise de sistemas de nível renovou motivação para a utilização de quimióstatos. Aqui, descrevemos três aplicações que capitalizar sobre o controle preciso das taxas de crescimento das células e para o ambiente externo que são exclusivamente possível usando quimiostatos. Em primeiro lugar, descreve-se o uso de quimióstatos para investigar a forma como a abundância de milhares de biomoléculas - como transcritos e metabolitos - são coordenadamente regulada com a taxa de crescimento. Em segundo lugar, nós descrevemos como quimiostatos pode ser usada para obter estimativas precisas das diferenças de taxas de crescimento entre os diferentes genótipos em ambientes com limitação de nutrientes, utilizando experimentos de competição. Em terceiro lugar, nós descrevemos como quimiostatos podeser usado para estudar evolução adaptativa de células que crescem em ambientes pobres em nutrientes constantes. Estes exemplos exemplificar as formas em que quimiostatos estão permitindo investigações em sistemas de nível de regulação do crescimento celular, gênica por interações ambientais e evolução adaptativa.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Recursos Técnicos Apropriados, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Garrafa de Vidro 9.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Para Recipiente de Mídia e Mangueira</td></tr><tr><td>Pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Para Recipiente de Mídia e Rolha de Mangueira</td></tr><tr><td>, Tamanho 12, Neoprene Verde</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>Para Recipiente de Mídia e</td></tr><tr><td>Mangueira Conector Reto</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>Para Recipiente de Mídia e Mangueira</td></tr><tr><td>Geral Laços de propósito 4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>Para Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira</td></tr><tr><td>, Borracha de Silicone</td><td>Peças Pequenas</td><td>B000FMWTDE</td><td>Para Vaso de Mídia e Tubo de Mangueira</td></tr><tr><td>, Silicone, 3/8 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>Para Recipiente de Mídia e Tubo de Mangueira</td></tr><tr><td>, Silicone, 7/32 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>Para Vaso de Mídia e Mangueira</td></tr><tr><td>Tubulação, Aço Inoxidável, 3/16 in OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Para Vaso de Mídia e Tubulação de Mangueira</td></tr><tr><td>, Aço Inoxidável, 3/8 in OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Para Recipiente de Mídia e</td></tr><tr><td>Conectores de Gancho</td> de Mangueira <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>Para Vaso de Mídia e</td></tr><tr><td>Braçadeira de Catraca</td> de Mangueira <td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Para Vaso de Mídia e Luer de Mangueira</td></tr><tr><td>, Fêmea</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td><td>Para Vaso de Mídia e Mangueira</td></tr><tr><td>Luer, Macho</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td>Para Vaso de Mídia e Mangueira</td></tr><tr><td>Filtro Millipore Aervent MTGR05010 62 mm, 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>Para Vasos de Mídia e Mangueiras</td></tr><tr><td>Filtros PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>para vaso de mídia e mangueira</td></tr><tr><td>Tubo de fluxo de leitura direta para ar</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Para configuração de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Tubo de fluxo de leitura direta para nitrogênio</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>Para configuração de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Proporcionador de gás Multitube Quadros</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>Para configuração</td></tr> <tr><td>de gás nitrogênioRegulador, Airgas analítico de dois estágios</td><td></td><td>Y12-N145D580</td><td>para configuração de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Adaptador de mangueira,</td><td>Airgas</td> de aço inoxidável <td>Y99-26450</td> para mangueira de <td>configuração de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Adaptador macho</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>para configuração de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Norprene Tubing</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>para instalação de gás nitrogênio</td></tr><tr><td>Base de tripé</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Para</td></tr><tr><td>Cartuchos de Válvula</td> de Configuração de Gás Nitrogênio <td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Para Configuração de Gás Nitrogênio</td></tr><tr><td>Carboy 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Para Preparação de Mídia</td></tr><tr><td>Filtros de Topo de Garrafa de Vácuo Estéril Steritop, 1.000 ml, membrana PES; para tamanho de gargalo de 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Para Preparação de</td></tr><tr><td>Mídia Garrafa de 100 ml, tamanho</td> <td>do gargalo de 45 mmFisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>Para Preparação de Mídia</td></tr><tr><td>cloreto de cálcio&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>sulfato de magnésio&middot; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Reagentes de</td></tr><tr><td>mídia fosfato de potássio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Media Reagentes</td></tr><tr><td>sulfato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Media Reagentes</td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Reagentes de mídia</td></tr><tr><td>ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>sulfato de cobre&middot; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>iodeto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>cloreto férrico&middot; 6H2O</td><td>Reagentes de Mídia</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td></tr><tr><td>sulfato de manganês&middot; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Reagentes de</td></tr><tr><td>Mídia molibdato de sódio&middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>sulfato de zinco&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Reagentes de</td></tr><tr><td>Mídia biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Reagentes de</td></tr><tr><td>Mídia pantotenato de cálcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr> ácido <tr><td>fólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>inositol (também conhecido como mio-inositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>niacina (também conhecido como ácido nicotínico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>ácido p-aminobenzóico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>piridoxina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>riboflavina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>tiamina HCl</td><td>Reagentes</td> de <td>Mídia</td><td>Fisher Scientific BP892-100</td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>Aldrich U0750</td><td>Reagentes</td></tr> de <tr><td>Mídia Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Reagentes de Mídia</td></tr></tbody></table>

o uso de quimiostatos em microbial biologia de sistemas

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Células regular sua taxa de crescimento em resposta a sinais do mundo externo. À medida que a célula cresça, diversos processos celulares deve ser coordenado, incluindo a síntese de macromoléculas, o metabolismo e, em última instância, o compromisso com o ciclo de divisão celular. O quimiostato, um método de controlar a taxa de crescimento experimental de células, proporciona um meio poderoso de estudar sistematicamente como os impactos a taxa de crescimento de processos celulares, incluindo a expressão de genes - e metabolismo - e as redes reguladoras que controlam a taxa de crescimento celular. Quando mantido por centenas de gerações quimióstatos podem ser usadas para estudar a evolução adaptativa de micróbios em condições ambientais que limitam o crescimento das células. Descreve-se o princípio de cultivos contínuos, demonstrar seu funcionamento e dar exemplos de suas diversas aplicações. Após um período de desuso após a sua introdução em meados do século XX, a convergência das metodologias genoma escala com uma renovada emteresse na regulação do crescimento celular e as bases moleculares da evolução adaptativa está estimulando um renascimento no uso de quimiostatos na pesquisa biológica.

Uma grande vantagem do quimióstatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células experimentalmente ao variar a taxa de diluição. Na brotação levedura, Saccharomyces cerevisiae, a morfologia de uma célula é informativo da fase do ciclo de divisão celular. As populações com taxas de crescimento superiores contêm uma maior proporção de células em divisão activa tal como determinado através da medição da fracção de células não gemuladas (Figura 5A). Análises de expressão do mRNA global em c...

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Os objetivos gerais da seguinte apresentação são descrever o princípio do quimiostato, demonstrar seu funcionamento e fornecer exemplos de aplicações que utilizam quimiostatos. Isso é alcançado primeiramente montando o vaso do quimiostato, inoculando-o e, em seguida, adicionando continuamente meio fresco enquanto se remove meio e células usados a uma taxa constante. Modelos matemáticos descrevem a variação na densidade celular e na concentração de um nutriente limitante do crescimento dentro de cada quimiostato.O uso dessas equações permite a previsão de um único estado estacionário estável não nulo, no qual as concentrações de células e nutrientes são constantes, e a taxa específica de crescimento das células é igual à taxa com que as células são removidas. Ao combinar o controle preciso do crescimento celular e do ambiente interno dos quimiosstats com outras tecnologias, tornam-se acessíveis resultados que permitem investigações em nível de sistemas sobre a regulação do crescimento celular, alterações genéticas e evolução adaptativa. A principal vantagem desse método de cultivo celular em comparação com outras técnicas é que a taxa de crescimento é controlada e o ambiente externo das células permanece constante.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia celular e evolução, como qual é a base molecular da regulação do crescimento celular e da evolução adaptativa em ambientes definidos. A demonstração visual deste método é essencial, pois o estabelecimento e a manutenção de culturas em quimiotato são difíceis devido ao grande número de etapas e componentes envolvidos. Inicie este procedimento ligando primeiro o sistema seis quatro usando o interruptor principal.Em seguida, enxágue cuidadosamente o vaso do hemostato, o conjunto de agitação e as tubulações acopladas com água desionizada. Verifique todas as tubulações e anéis de vedação e substitua qualquer peça com aparência desgastada. Após a montagem do conjunto de agitação e do eixo de acionamento, preencha o vaso com 300 mililitros de água DI.Verifique o nível do eletrólito da sonda de oxigênio dissolvido, garantindo que a carcaça inferior esteja preenchida até a metade com solução eletrolítica. Em seguida, calibre a sonda de pH. Após a calibração, desconecte a sonda do fermentador.Lave com água deionizada e insira-o no orifício do vaso hemostático. Parafuse até ficar firme ao toque. Com as sondas conectadas, coloque o vaso hemostático no suporte, certificando-se de anotar no vaso com qual fermentador a sonda de pH foi calibrada. Por fim, prepare as sondas e as tubulações para a autoclavação colocando a tampa na sonda de pH e cobrindo a sonda de oxigênio dissolvido e todas as extremidades livres das tubulações com papel alumínio próprio para autoclave.Um carro vazio tampado com uma rolha de borracha contendo uma entrada de ar e uma saída de meio. Certifique-se de que a extremidade da tubulação de meio esteja coberta com papel alumínio. Conecte um copo de filtração de 500 mililitros a uma garrafa de meio de 100 mililitros.Remova o filtro de algodão do filtro com pin&ccedil;as, esterilize com etanol e fixe imediatamente &agrave; porta de filtra&ccedil;&atilde;o no carro de meio. Conecte o carro de meio a uma fonte de v&aacute;cuo e realize a filtra&ccedil;&atilde;o. Esterilize 10 litros de meio rec&eacute;m-preparado adicionando-o ao copo do filtro.Quando a filtração do meio estiver completa, feche a porta de filtração com um grampo metálico. Após as vidrarias de hemostato terem sido autoclavadas e deixadas esfriar, coloque o frasco na respectiva jaqueta térmica. Conecte o sensor de temperatura, o eletrodo de pH e o eletrodo de oxigênio dissolvido.Deixe o vaso em repouso com a energia ligada por pelo menos seis horas para permitir a polarização dos sensores de oxigênio dissolvido. Em seguida, conecte o carbo do meio ao vaso hemostático. Utilize etanol para manter as extremidades dos tubos o mais estéreis possível.Em seguida, passe a mangueira da bomba através da bomba e abra o clipe. Depois, coloque a extremidade de cada tubo de efluente em um recipiente coletor separado. Conecte a fonte de ar por meio de um filtro autoclavável e ligue o fluxo de ar.A água em cada músculo deve sair pelos tubos de efluente, o que indica que todas as vedações foram formadas corretamente. Ajuste a altura do tubo de efluente ao volume de trabalho desejado de 300 mililitros. Pressione manualmente a bomba até que o meio comece a fluir para o vaso hemostático.Em seguida, solte o tubo da bomba. Quando o meio atingir o tubo de efluente, reconecte o tubo à bomba e prenda com o meio previamente purgado. Inicie a execução do programa básico com o impulsor ajustado em 400 RPM e a temperatura definida em 30 graus Celsius.Em seguida, calibre os sensores de oxigênio dissolvido desligando o suprimento de ar e trocando para gás nitrogênio. Aguarde pelo menos uma hora e registre o valor medido como leitura baixa. Retorne ao suprimento de ar contendo uma concentração ambiente de oxigênio e aguarde pelo menos mais uma hora.Registre esta medição como o valor alto de leitura. Neste momento, inicie o registro de dados usando o software iris antes da inoculação. Esterilize a parte superior do vaso de cultura com etanol 70%.Em seguida, abra a porta do vaso usando uma chave de fenda e pipete um mililitro de uma cultura de crescimento noturno para dentro do vaso, substituindo o parafuso ao finalizar. Quando as culturas atingirem a fase estacionária inicial, inicie as bombas e estabeleça uma taxa de fluxo desejada. Especificando o número de segundos em que a bomba permanece ligada e desligada, ajuste a taxa de fluxo e o volume da cultura.Determine a taxa de diluição. Usando a interface six fours, defina um programa que especifique o tempo da bomba, a temperatura e a velocidade do agitador. Em seguida, inicie o programa após pelo menos duas horas.Registre o tempo e utilize um cilindro graduado para medir a quantidade de meio removido do vaso. A quantidade removida será igual ao volume adicionado ao vaso com hemostato e pode ser usada para calcular a taxa de diluição, coletar o fluxo de saída e utilizá-lo para medir a densidade celular. O crescimento em estado estacionário é alcançado quando a densidade celular não muda ao longo do tempo.Uma vez atingido o estado estacionário, colete amostras pequenas retirando-as do tubo de efluente ao longo de alguns minutos, permitindo que o líquido escoe passivamente para um tubo de coleta. A análise de expressão gênica e de metabólitos exige amostras maiores. Essas podem ser obtidas rapidamente soltando o parafuso, segurando a extremidade metálica do tubo de efluente e abaixando lentamente o tubo.Quando um grande volume é removido, a taxa de fluxo deve ser reduzida para manter a mesma taxa de diluição. Primeiro, estabeleça culturas em estado estacionário de duas linhagens de levedura com taxas de diluição e volumes idênticos. Retire manualmente um mililitro de cada recipiente para ser usado como controle em análises subsequentes de citometria de fluxo. Centrifugue as células por um minuto a 6.000 RPM, re-suspenda-as em um mililitro de PBS e armazene o tubo a quatro graus Celsius.Em seguida, coloque o tubo de efluente de um vaso por vez em um cilindro graduado para autoclave. Solte o parafuso que prende o tubo de efluente e empurre suavemente para baixo a fim de expelir 150 mililitros de células do quimiostato, retornando a extremidade metálica do tubo de efluente à sua posição original. Ao finalizar, após a esterilização da área, abra a porta do vaso na parte superior do vaso do quimiostato.Coloque um funil estéril na abertura e adicione 150 mililitros da outra cultura. Em seguida, feche a porta e repita com o segundo vaso. Cada vaso contém agora uma mistura 50 50 das duas linhagens, podendo adquirir amostras a cada duas a seis horas durante dois a três dias.Armazene as amostras em PBS e analise as proporções de linhagens em cada amostra utilizando citometria de fluxo. Após estabelecer um cultivo de quimiostato em estado estacionário usando uma linhagem de genótipo conhecido com uma limitação nutricional definida, mantenha o cultivo não perturbado por várias centenas de gerações, repõe o reservatório de meio com meio fresco conforme necessário. Mantenha um registro fóssil da população em adaptação por meio de amostragem passiva do efluente a cada dois a três dias.Armazene a amostra em glicerol 15% a menos 80 graus Celsius após a conclusão da seleção, plante uma amostra de células em placas de ágar sólido. Após o crescimento das células em colônias, selecione uma amostra imparcial de colônias utilizando palitos de dente e inóculos clones em poços individuais de uma placa de 96 poços contendo 100 microlitros de meio. Deixe as amostras clonais crescerem durante a noite.Em seguida, adicione 100 microlitros de glicerol a 30% a cada poço e armazene a -80 graus Celsius até o uso na análise genômica. Uma grande vantagem dos chemostatos é a capacidade de controlar a taxa de crescimento das células. A porcentagem de células de levedura, que estão brotando, mostrada aqui no eixo Y, é uma boa representação de sua taxa de crescimento.Como visto aqui. Esse percentual aumenta de maneira quase linear com a elevação da taxa de diluição. Taxas de diluição mais rápidas resultam em taxas de crescimento mais rápidas, o que pode levar a aumentos sistemáticos na expressão gênica, representados aqui por um aumento na abundância de mRNA do UTR dois.No entanto, diminuições sistemáticas na expressão gênica também podem ocorrer com o aumento da taxa de crescimento, como no caso do ASM um. A aptidão relativa de diferentes genótipos pode ser determinada realizando ensaios de competição em quimiostatos utilizando células marcadas com fluorescência e análise por citometria de fluxo. O resultado apresentado aqui é representativo, no qual um mutante foi colocado em competição contra uma linhagem selvagem marcada com fluorescência. Neste exemplo, a linhagem mutante apresenta uma vantagem de 40% na taxa de crescimento por geração.A análise de sequenciamento de genoma completo pode ser utilizada para identificar mutações adquiridas em células com maior aptidão, após seleção de longo prazo em quimiostatos. Por exemplo, a análise de experimentos independentes de evolução adaptativa em condições de limitação de nitrogênio identificou diferentes alelos de variação no número de cópias no locus gap, que codifica a permease de aminoácidos gerais. Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massas, citometria de fluxo e sequenciamento de nova geração, podem ser utilizados para responder perguntas semelhantes sobre a regulação em nível de sistema do crescimento celular e da evolução adaptativa.Após o desenvolvimento desta técnica, abriram-se caminhos para pesquisadores nas áreas de microbiologia a biologia celular estudarem como a fisiologia celular e os processos moleculares são afetados pela variação na taxa de crescimento celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como configurar e manter culturas quimostáticas, bem como dos diferentes modos nos quais as amostras são necessárias para diversas aplicações.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.

Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Apresentamos um protocolo para o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), que permite o cultivo de populações bacterianas sob condições constantes de baixo teor de nutrientes (até centenas de concentrações nanomolares) ou flutuações temporais de nutrientes em uma escala de tempo minuciosa.

Um dispositivo milifluido contínuo para cultura para o estudo de Escherichia coli sob condições nutritivas baixas e flutuantes

Aprenda a usar quimiostatos para controlar o crescimento celular em biologia de sistemas microbiana. Este método permite investigações precisas sobre regulação do crescimento e evolução adaptativa.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

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