Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar medições de oscilação forçada da mecânica respiratória em camundongos usando o evento flex, um ventilador de pistão comercial controlado por computador. Isso será feito por meio da avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metilcolina inalatória. O primeiro passo é preparar os reagentes necessários, o equipamento e o sujeito.

Em seguida, o sujeito é conectado ao ventilador para medidas de ventilação mecânica e mecânica respiratória. Usando um script predefinido, uma coleção de medições automatizadas altamente controladas é feita na linha de base e após o desafio com metilcolina. A análise dos resultados pode mostrar hiperresponsividade das vias aéreas, conforme observado pelas maiores respostas máximas de resistência e elastina em camundongos expostos ao cloro em comparação com indivíduos controle.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela fornece uma ferramenta precisa para medir a função pulmonar de maneira abrangente, detalhada e translacional. Isso é feito por meio da análise de sinais de pressão e volume adquiridos em reação a formas de onda de fluxo de ar oscilatório predefinidas aplicadas na abertura das vias aéreas do sujeito. Além disso, muitos fatores que influenciam a resposta fisiológica podem ser controlados e padronizados.

Usando este método, ligue o sistema Flex event FX e inicie o software. O protocolo atual se aplica a qualquer uma das duas gerações de eventos flex suportadas pelo flexi. Use sete softwares na primeira sessão de experimentação ou a qualquer momento antes dela Abra o módulo de definição e planejamento do estudo para predefinir a estrutura do estudo.

Clique no botão criar um novo estudo e siga o assistente para criar um estudo. Esboçar o protocolo e definir os grupos experimentais e os sujeitos a serem estudados. Inicie uma sessão de experimentação abrindo o módulo de sessão de experimentação e seguindo a sequência de inicialização.

Para estudo e seleção de modelos. Atribua um assunto ao local de medição e confirme seu peso. Prossiga com a calibração do sistema seguindo as etapas descritas no software operacional.

Vem um prompt para conectar a cânula a ser usada ao tubo Y para calibração. Continue com a calibração da cânula seguindo as etapas do assistente de calibração e verifique se os valores de calibração obtidos estão dentro da faixa especificada. Se necessário, repita o processo de calibração, a menos que esteja pronto, cancele as instruções para iniciar a ventilação e a gravação de dados.

Estes podem ser iniciados posteriormente. Anestesiar o sujeito usando doses apropriadas de agentes anestésicos. Verifique se o sujeito atingiu um nível cirúrgico de anestesia.

O sujeito não deve mostrar nenhuma reação a um beliscão no dedo do pé e sua respiração deve ser regular e não difícil. Posicione o animal em decúbito dorsal com uma fonte de calor para manter a temperatura corporal adequada. Uma lâmpada de 60 watts colocada a 45 centímetros do mouse é adequada.

Em seguida, limpe a área da garganta com álcool para expor a traqueia. Faça uma incisão e separe suavemente a glândula submaxilar e a camada muscular que a cobre. Levante suavemente a traqueia usando um par de micro pinças.

Em seguida, passe uma sutura por baixo. Corte entre os dois anéis de cartilagem mais próximos da laringe. Isso faz uma pequena incisão na traqueia sem seccioná-la.

Insira a cânula calibrada na incisão e avance-a suavemente através de cinco anéis traqueais. Neste exemplo, uma cânula de metal de calibre 18 de 1,2 centímetro está em operação. É fundamental prender a cânula usando a sutura.

O acessório deve formar uma vedação hermética ao redor da cânula. Aproxime o animal canulado do ventilador. Inicie a ventilação mecânica selecionando um perfil de ventilação predefinido ou personalizado na área de ventilação.

Agora conecte o animal ao ventilador através do tubo em Y. Alinhe cuidadosamente o animal ao ventilador e certifique-se de que a cânula traqueal esteja no mesmo nível do ventilador. Isso evita uma possível cânula, oclusão ou torção traqueal no software.

Execute uma perturbação de insuflação profunda clicando duas vezes no nome da perturbação para verificar a inserção e fixação da cânula. A menos que haja um vazamento, o sistema manterá uma pressão de 30 centímetros de água por um período de três segundos sem deslocamento excessivo de volume. Os traços de volume e pressão registrados devem ser lisos, sem sinais de deslocamento ou deformação.

Caso contrário, pode haver uma cânula, obstrução ou extravio neste ponto. Transdutores de sinais vitais para monitoramento da frequência cardíaca e da temperatura corporal podem ser conectados, se necessário. A gravação de dados desses sinais pode ser iniciada a qualquer momento, manual ou automaticamente por meio de um script.

Medições ou comandos para ativação de nebulizadores, marcadores de eventos e assim por diante podem ser automatizados usando scripts predefinidos ou personalizados para um processo experimental altamente controlado e repetível. Seis famílias de perturbações que dão origem a uma série de parâmetros podem ser usadas para descrever a mecânica do sistema respiratório em questão no início e após um determinado desafio. Quando estiver pronto para começar a fazer medições, é importante primeiro executar a perturbação de insuflação profunda para recrutar áreas pulmonares fechadas e padronizar o histórico de volume pulmonar.

Em seguida, verificar a ausência de esforços inspiratórios espontâneos executando uma medição de teste. Observe os traços do sinal de pressão na visualização do conjunto de dados selecionado. Com curvas fotovoltaicas stepwise.

Os platôs de pressão devem ser bem definidos, sem deflexões para baixo. Uma oscilação descendente na pressão indicaria um esforço inspiratório do animal. Agora inicie o roteiro para a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metilcolina inalada clicando duas vezes em seu título.

Neste exemplo, o script faz uma sequência de medições de linha de base em triplicado. Em seguida, há um prompt para carregar o nebulizador com solução salina. Ou, neste exemplo, uma solução de metilcolina carrega aproximadamente 100 microlitros de solução no nebulizador.

A nebulização começará automaticamente assim que as informações forem inseridas no software. Logo após o término da nebulização, uma sequência de medições espaçadas é iniciada por aproximadamente três minutos. Em seguida, um prompt para executar.

Outro desafio é fornecido e a sequência de medições pode ser repetida entre os desafios. Secar o interior do suporte do nebulizador com um cotonete pode ajudar a evitar que gotículas ou condensação se acumulem na linha inspiratória. À medida que os dados são coletados, o software calcula os parâmetros associados à perturbação e fornece um coeficiente de determinação com base no ajuste dos dados ao modelo.

Posteriormente, o experimento pode ser acessado por meio do módulo de revisão e relatório do software para exportar ou analisar dados posteriormente. No final do experimento, pare a ventilação e retire o sujeito. Uma vez destacado rapidamente, eutanasiar o animal com uma overdose de pentobarbital sódico, então uma lavagem broncoalveolar pode ser realizada ou os pulmões podem ser isolados para análise posterior.

Antes de passar para o próximo assunto, enxágue e seque o adaptador do nebulizador y tubo e cânula. Mude para o próximo assunto no software operacional e confirme seu peso. Em seguida, prossiga com as etapas de calibração sugeridas antes de continuar com o experimento.

No final do dia, enxágue e seque o equipamento. Lembre-se, antes de fechar a sessão experimental, de limpar também a válvula expiratória do sistema de acordo com as instruções do fabricante, a fim de manter o desempenho do seu sistema. Os exemplos a seguir representam uma seleção de resultados típicos de experimentos com camundongos ingênuos e expostos ao cloro, resultados equivalentes de aj ingênuo.

Os camundongos foram obtidos no início e após a constrição broncológica induzida por metilcolina usando qualquer uma das duas gerações de eventos flexíveis suportadas pelo flexi wear seven. Como as medições de FOT de banda larga permitem uma partição da resposta pulmonar em parâmetros das vias aéreas e do tecido parenquimatoso, elas fornecem um meio para identificar as regiões pulmonares afetadas. Por exemplo, camundongos AJ virgens mostraram um aumento da resistência basal quando a pressão expiratória final foi aumentada de três para nove centímetros de água.

A mudança na pressão expiratória final resultou em uma diminuição na resistência das vias aéreas consistente com os efeitos broncodilatadores de um maior volume pulmonar e maior pressão de insuflação, e um aumento no amortecimento tecidual, um parâmetro intimamente relacionado à resistência tecidual que reflete a viscoelasticidade tecidual e possivelmente a resistência das pequenas vias aéreas. Sabe-se que este último aumenta com o aumento do volume pulmonar. Este protocolo é frequentemente usado para avaliar a capacidade de resposta das vias aéreas à metilcolina inalada após a exposição ao gás cloro.

Os camundongos B.SEA exibiram hiperresponsividade das vias aéreas em comparação com os controles expostos ao ar. No presente exemplo, camundongos expostos ao gás cloro apresentaram maiores respostas máximas em todos os parâmetros FOT. Esses camundongos também mostraram um deslocamento estatisticamente significativo para a esquerda da curva de resposta à concentração ou hipersensibilidade à metilcolina inalada, que é exemplificada por uma redução da concentração de metilcolina necessária para causar uma duplicação na resistência e na elastina.

Além do FOT, o sistema de eventos flexíveis pode registrar outras medições, como curvas de volume de pressão. A porção superior do membro de deflação é ajustada à equação de Salazar Knolls, e os parâmetros associados são calculados pelo software. Para ter sucesso com esta técnica, é importante prestar atenção a cada etapa de particular importância são a calibração do sistema, a resistência da cânula endotraqueal, o posicionamento do animal e a padronização dos volumes pulmonares.

Se essas etapas forem seguidas com precisão, este método fornecerá uma caracterização precisa das propriedades mecânicas do pulmão do camundongo.