Name: Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Aprenda a técnica de oscilações forçadas para avaliar a mecânica respiratória em camundongos usando o sistema flexiVent. Este método permite medições precisas da função pulmonar e da resposta à metacolina.

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TKMcG é apoiado por uma bolsa de estudo da Sociedade Torácica canadense. CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES Todos os autores participaram da concepção do trabalho. Além disso, TKMcG iniciou o projeto, coletados resultados experimentais, contribuiu para a redação do manuscrito e sua análise crítica. AR coletados e analisados ​​os resultados experimentais, elaborou o manuscrito e contribuíram para a sua revisão crítica. LF coletadas resultados experimentais e contribuiu para a revisão crítica do manuscrito. TFS e JGM contribuiu para a revisão crítica do manuscrito.

Os procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de Cuidados McGill University Institutional Animal, em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care (CCAC). 1. Passos Preparatórios <ol><li> Soluções: <ol><li> Metacolina: Prepara-se uma solução estoque a 50 mg / ml e as diluições em série (1:1) com base nas concentrações a serem testadas 5. Permitir que a solução atinja a temperatura ambiente antes de nebulização de 5. </li><li> Agentes anestésicos: regimes diferentes foram relatados na literatura em várias linhagens de camundongos (Tabela 1) Nota:. Regime 1 foi utilizado ao abrigo do presente protocolo. </li></ol></li><li> Equipamento: O presente protocolo aplica-se a qualquer uma das duas gerações flexiVent suportadas pelo software flexiWare 7. As funções de software estão agrupados em três módulos: Estudo de Definição e Planejamento, Experimentação Session e Review &amp; Reporting. <ol><li> Ligue o sistema (apenas flexiVent FX) e / ou iniciar o software. </li><li> Na primeira sessão de experimentação ou em qualquer momento, antes disso, abra a definição do estudo e do módulo de Planejamento de predefinir a estrutura estudo. </li><li> Clique no botão Criar um novo estudo e siga o assistente para criar um estudo, delinear o protocolo e definir os grupos experimentais e os assuntos a serem estudados. </li><li> Iniciar uma sessão de experimentação, abrindo o módulo Sessão Experimentação e seguindo a sequência de arranque para estudo e seleção de modelo. </li><li> Atribuir um assunto para o local da medição e confirmar o seu peso. </li><li> Prosseguir com a calibração do sistema, seguindo as etapas descritas no software operativo. Você será solicitado em um ponto para fixar a cânula a ser utilizado (passo 1.3.3) para o Y-tubulação para a calibração. </li><li> Passo crítico. REPEAt passo 1.2.6, se os valores de calibração obtidos estão fora do intervalo aceitável. (Consulte o flexiVent FX ou manual de usuário flexiWare 7 para os limites aceitáveis ​​do módulo específico de valores de calibração). </li><li> Cancelar instruções para iniciar a ventilação e gravação de dados, a menos pronto para começar o experimento. Estes podem ser iniciadas em um momento posterior. </li></ol></li><li> Assuntos: <ol><li> Anestesiar o assunto com doses adequadas de agentes anestésicos (Tabela 1). </li><li> Verifique se o assunto chegou a um nível de anestesia cirúrgica. O assunto deve mostrar nenhuma reação a uma pitada do dedo do pé e sua respiração deve ser regular e não trabalhou. </li><li> Realizar uma traqueotomia e canulação da traquéia. <ol><li> Colocar o animal em suas costas e fornecer uma fonte de calor (por exemplo, temperatura cobertor de aquecimento controlado ou uma lâmpada com uma lâmpada de 60 watt situado a cerca de 45 cm do mouse para evitar o aquecimento excessivo). </li><li> Limpo ªe a área da garganta com álcool e expor a traqueia, fazendo uma incisão na pele e separar cuidadosamente a glândula submandibular e a camada muscular cobrindo-o. </li><li> Suavemente levantar a traqueia usando um par de fórceps e micro-sutura passe por baixo. </li><li> Corte entre dois anéis de cartilagem mais próxima da laringe para fazer uma pequena incisão na traqueia sem corte ele. </li><li> Inserir a cânula previamente calibrado na incisão e avançar o suavemente para dentro da traqueia do comprimento de aproximadamente cinco anéis Nota:. As presentes experiências foram realizadas utilizando um 1,2 cm de comprimento de metal cânula de calibre 18. </li><li> Passo crítico. Segurar a cânula no local usando o fio de sutura. O acessório deverá formar uma vedação hermética em torno da cânula. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ventilação Mecânica <ol><li> Traga o animal perto do ventilador. </li><li> Iniciar a ventilação mecânica, selecionando um predefinidoou um perfil personalizado ventilação na janela de encaixe de ventilação. </li><li> Ligue o animal ao ventilador através da tubagem de Y-. </li><li> Passo crítico. Alinhar o animal ao ventilador e garantir que a cânula traqueal é, ao mesmo nível que o ventilador para evitar uma possível torção ou oclusão cânula traqueal. </li><li> Passo crítico. Executar uma perturbação profunda Inflação clicando duas vezes sobre o nome perturbação para verificar a inserção da cânula e do apego. Na ausência de um vazamento, o sistema deve ser capaz de manter uma pressão de 30 cmH 2 O sobre a 3 segundo período, sem deslocamento de volume excessivo (Figura 1). O volume registrado e traços de pressão também deve ser lisa, sem sinais de deslocamento ou deformação pois estes podem indicar uma obstrução de cânula ou extravio. </li><li> Se necessário, ligue transdutores de sinais vitais para a frequência cardíaca e controlo da temperatura corporal. Gravação de dados pode ser iniciada either manualmente ou automaticamente através de um script. </li></ol> 3. Medidas da função pulmonar Medidas ou comandos (por exemplo, a ativação de nebulização, marcadores de eventos) pode ser automatizado usando scripts pré-definidos ou personalizados para um processo experimental altamente controlado e repetível (Figura 2). Seis famílias de perturbações que dão origem a uma série de parâmetros podem ser utilizados para descrever o mecanismo do sistema respiratório sujeitos no início do estudo e após um dado desafio (Tabela 2). <ol><li> Passo crítico. Quando estiver pronto para começar a tomar medidas, executar uma inflação profunda para recrutar áreas pulmonares fechadas e padronizar história do volume pulmonar. </li><li> Passo crítico. Verificar a ausência de esforços inspiratórios espontâneos, executando um teste de medição (por exemplo, PVs-P ou PVs-V). Observar os traços de sinal de pressão na vista Dataset selecionados. Com curvas PV passo a passo,planaltos de pressão deve ser bem definido, sem desvios para baixo. Um movimento para baixo da pressão poderia indicar um esforço de inspiração do animal (Figura 3). </li><li> Inicie o script selecionado clicando duas vezes em seu título. Scripts usados ​​no presente estudo geralmente incluídos para medições: <ul><li> Uma seqüência de medições de referência em triplicado. </li><li> A activação do nebulizador para a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada Nota:. Quando solicitado pelo sistema, carregar aproximadamente 100 ul de solução salina ou de uma solução de metacolina no nebulizador. Nebulização vai iniciar e parar automaticamente. </li><li> Uma sequência de medições espaçadas (cada 10-15 seg) durante um período de cerca de 3 minutos após a activação do nebulizador. </li><li> Um aviso para executar um outro desafio e repetir uma sequência de medições Nota:. Secagem do interior do monte nebulizador com um cotonete em bdesafios ntre pode ajudar a prevenir ou condensação de gotículas edifício-up na linha inspiratória. </li></ul></li><li> No fim do experimento, parar a ventilação e retirar o objecto. </li><li> Alternar para o próximo assunto no software operacional e confirmar o seu peso. </li><li> Passo crítico. Lavar e secar nebulizador, adaptador, Y-tubulação, e cânula entre os sujeitos. </li><li> Repita os passos 3.6 a 1.2.6. </li><li> No final do dia, fim da sessão experimental. Recorde enxaguar e secar nebulizador, adaptador, Y-tubos e cânula e para limpar o sistema de válvula de expiração antes de deixar o laboratório, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 4. Análise de Dados O software calcula automaticamente e exibe os parâmetros associados com uma perturbação. Ele também fornece um coeficiente de determinação (COD), o que reflecte o encaixe do modelo matemático com os dados. Cada conjunto de dados com um insuCOD fficient é rotulado como excluídos pelo software. Revisão de sessões experimentais, os dados re-análise e criação de cenários de exportação são feitos no módulo de Análise e Relatórios do software. <ol><li> Abra o módulo de Análise e Relatórios e criar um cenário de exportação, tendo o cuidado de incluir apenas os conjuntos de dados que têm um COD suficiente. </li><li> Exportar como parâmetros necessários, curva de pressão ou fluxo-volume, sinais de conjunto de dados brutos ou informações sujeitas a um aplicativo de planilha (ver Tabela 3). </li><li> Média de medições de linha de base para cada um dos parâmetros e de trama de todas as medições como uma função do tempo (ver Figura 4). Em seguida, pode escolher para calcular a área sob a curva, analisar o perfil geral das curvas ou realizar uma análise estatística. </li><li> Para expressar os resultados da responsividade das vias aéreas como uma função da concentração de metacolina, determinar para cada sujeito, e da condição do parâmetro experimental ou de algumponto (eg pico) ou um tempo específico após cada metacolina. Calcular médias de grupo e relatórios ou resultados enredo para cada condição experimental (Tabela 4, Figura 5). </li><li> Pode também considerar o cálculo da concentração que produz uma duplicação de um determinado valor de referência do parâmetro (PC 200; Figura 5C), aplicando-se uma normalização (% da linha de base, por exemplo) ou a realização de uma análise estatística. </li></ol>

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AR, LF, TFS são empregados por SCIREQ científicos respiratória Inc. TFS também possui estoque. Livre acesso a este artigo é patrocinado pela SCIREQ Scientific respiratória Equipment, Inc.

O estudo contínuo da disfunção das vias aéreas, uma vez que refere-se a asma e outras doenças pulmonares permanece fundamental para a compreensão dos mecanismos subjacentes da doença e para o desenvolvimento de opções de tratamento. A utilização de ratos modelo para a doença das vias aéreas tem sido essencial na obtenção de entendimento para estes mecanismos de doença. Ao considerar a disfunção das vias aéreas avaliar em um assunto tão pequeno como um rato, ter ferramentas confiáveis ​​e precisos para medir a função pulmonar é crítica. Além disso, ter ferramentas capazes de fornecer conhecimentos sobre a localização da disfunção das vias aéreas ou efeito terapêutico é inestimável. A técnica TOF combina todos estes atributos e proporciona uma abordagem poderosa, integrativa e translacionais para avaliar as alterações fisiológicas. Para ter sucesso com este tipo de medição em ratinhos, deve ser dada especial atenção aos poucos passos, a saber, a calibração do sistema, a resistência do ca endotraquealnnula, do tipo de nebulizador (bem como as suas configurações de funcionamento) o posicionamento do animal e a normalização da história do volume pulmonar. Além disso, é imperativo, para obter conjuntos de dados válidos, que o sistema respiratório do objecto permanece passivo durante as medições. Isto pode ser conseguido pela administração de um agente paralisante muscular, trabalhando num plano de anestesia profunda ou abafando o sujeito para induzir apneia (ver Tabela 1). Os investigadores podem começar por dominar o sistema e seu software operacional, se desejar, com cargas de ensaio, ao adquirir as habilidades necessárias para medições em camundongos. Seria então lógico para gerar resultados reproduzíveis em animais ingênuos antes de passar para modelos de doenças ou ratos tratados. Uma vez que uma proporção importante de modelos de doenças respiratórias em pesquisa envolvem exposição dos animais aos agentes, tais como alérgenos, toxinas, poluentes, fumaça de cigarro ou gases, a variabilidade nos resultados obtidos com os MEDIÇÃOt técnica descrita neste artigo poderia, portanto, ser influenciada pelo processo de exposição utilizado. Padronização dos processos experimentais fundamentais (por exemplo, usando a exposição controlada por computador e sistemas de medição de 6, 13, 14) poderia ter um impacto significativo na redução da variabilidade. Os exemplos apresentados neste artigo representam uma seleção de resultados típicos de ingênuos e cloro experimentos ratos expostos ao destacar os pontos fortes, bem como as limitações da técnica. Como pode ser visto, por exemplo, na Figura 6, a técnica é capaz de gerar medidas de função pulmonar reprodutíveis. Enquanto os valores de resistência de base semelhantes foram relatados entre linhagens de camundongos, as diferenças de elastância foram no entanto observadas 15. Mudanças substanciais também são esperados entre a criança e camundongos adultos 16. Quanto aos outros em avaliação fisiológica vivo, resultados de alta precisão, tais como those gerado pelo FOT, vem com uma concessão quanto ao estado natural dos indivíduos. Este princípio, que é conhecido como princípio da incerteza de fenotipagem 1, aplica-se ao presente protocolo, no sentido de que as medições devem ser feitas em anestesiados, traqueostomizados (ou oralmente entubado) e ventilação mecânica assuntos. Outra limitação da técnica é observável na Figura 5D-5F em que os dados não estão disponíveis para as concentrações mais elevadas para o grupo cloro-exposto porque o ajuste do modelo de fase constante para os dados é pobre acima dos níveis moderados de broncoconstrição. No entanto, os animais gravemente bronchoconstricted podia ser avaliada através da análise ZRS directamente 15, ou usando um software de terceiros pós-análise para ajustar modelos matemáticos mais complexos, por exemplo, tendo em conta a heterogeneidade da função mecânica 17. Excluídos conjuntos de dados também pode ser observado se as vias aéreas do animal não são suficientemente passive ou se a resistência da cânula é muito alta. Como uma regra geral, a resistência da cânula não deve exceder a resistência do animal no início do estudo. Trabalhando com uma cânula de diâmetro interno maior e / ou mais curto comprimento vai ajudar a reduzir a resistência da cânula. Finalmente, o presente demonstração de medições TOF em ratinhos pode ser percebido como uma metodologia demorada e, por conseguinte, menos eficiente ou menos aplicável a estudos longitudinais em comparação com técnicas menos invasivas. No entanto, o último está associado com uma grande dose de incerteza quanto à base dos seus resultados e são vistos por muitos como sendo um falho. Medidas invasivas repetidas são possíveis em animais por via oral entubado, embora tecnicamente mais desafiadora 17. A partir dos exemplos apresentados, os resultados demonstraram a equivalência das duas gerações do sistema flexiVent a produzir medições de mecânica respiratória, assim como da via aérea hyperreactividade e hipersensibilidade à metacolina inalada seguindo cloro-exposição em camundongos. Quando usado para caracterizar ou compreender as mudanças fisiológicos ou modelos de doenças, o aspecto detalhadas de medida relacionada com a técnica pode contribuir para prolongar o estado atual do conhecimento.

Caracterização adequada das propriedades mecânicas dos pulmões em pequenos animais tornou-se essencial uma vez que a germinação de modelos murinos na ciência respiratória. Quando realizada por meio da técnica de oscilações forçadas (TOF), uma técnica também usada em seres humanos, essas medidas fornecem uma abordagem poderosa, integrativa e de translação para estudar alterações fisiológicas significativas. FOT medições são tipicamente obtidos através da análise de sinais de pressão e de volume adquiridos em reacção a um predefinido, pequena amplitude de oscilação da forma de onda do fluxo de ar (também referida como perturbação ou sinal de entrada), aplicado na abertura das vias aéreas do sujeito 1. Na sua forma mais simples, uma perturbação TOF seria uma única forma de onda sinusoidal com uma frequência bem definida. Perturbações mais complexas tipicamente consistem de uma superposição de uma seleção de específico (mutuamente prime) formas de onda de freqüência que cobre um amplo espectro. A decomposição do multi-frequênciaos sinais de entrada e saída em seus constituintes, utilizando a transformada de Fourier permite o cálculo da impedância de entrada do sistema respiratório (ZRS), ou seja, a função de transferência entre os sinais de entrada e saída, em cada frequência incluído na perturbação 2. Portanto, FOT permite a avaliação simultânea da mecânica respiratória em uma faixa de freqüências em uma única manobra 2. Modelos matemáticos avançados de montagem (por exemplo, o modelo de fase constante 3) para os dados de impedância, em seguida, permitir a separação da resposta em vias aéreas (central e periférico) e pulmão parâmetros dependentes do tecido do parênquima 1, 3. Porque muitos fatores que influenciam a resposta fisiológica (por exemplo, freqüência respiratória, volume corrente, volume pulmonar, das vias aéreas superiores, os esforços de respiração espontânea, o tempo das medições) são controlados e padronizados pelo sistema de medição e procedimentos experimentais, a técnica é um capcapaz de gerar medidas precisas e reprodutíveis, desde que seja realizada correctamente. O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada e cronológica do procedimento necessário para executar tais medições em camundongos. O protocolo consiste em quatro partes: etapas preparatórias (reagentes, equipamentos e matérias), ventilação mecânica, medidas de função pulmonar e análise de dados. Exemplos de resultados representativos da mecânica do sistema respiratório gerado usando um ventilador pistão controlado por computador (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Quebec, Canadá) são fornecidos. Estes foram obtidos a partir de ratinhos ingénuos, bem como a partir de um modelo orientado de estresse oxidativo de danos nas vias aéreas caracterizadas por inflamação das vias aéreas, danos em células epiteliais e aumento da capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada na forma de aerossol 4. Embora este protocolo é frequentemente utilizado para avaliar a capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada, estende-se a outros resultados e various patologias, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), enfisema, fibrose pulmonar, lesão do pulmão, bem como em modelos de ratinhos transgénicos de patologias semelhantes à doença humana. Os resultados da pesquisa utilizando esta ferramenta pode contribuir para uma melhor caracterização e entendimento das mudanças fisiológicas ou de modelos de doenças, bem como a expansão para novas áreas de pesquisa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTES&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acetil-&amp;#946;-metilcolina cloreto </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>Metacolina</td></tr><tr><td>Pinça Micro-Adson, serrilhada 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Moria MC31, curva serrilhada</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris - corte resistente, reta 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola - lâminas de 2,5 mm, retas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba não estéril (18g x &amp;frac12;")</td><td>Brico Medical Supplies Inc.</td><td>BN1805</td><td>Canula endotraqueal</td></tr><tr><td>Fio de seda 5-0 não estéril</td><td>Seraflex</td><td>IDI58000</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Starstedt</td><td>SS-4001</td><td></td></tr><tr><td>Seringas TB de 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro de 200 &amp;mu;l</td><td>Biosphere</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPAMENTOS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiVent&lt;/em&gt; FX</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Nevoeirizador Aerogen Aeroneb</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

A técnica de oscilações forçadas (TOF) é uma poderosa ferramenta de integração e de translação permitir a avaliação experimental da função pulmonar em ratos em uma detalhada forma abrangente, preciso e reprodutível. Ele fornece medições da mecânica do sistema respiratório através da análise de sinais de pressão e do volume adquirido em reação ao pré-definida, pequena amplitude, oscilatório fluxo de onda, que são tipicamente aplicados na abertura das vias aéreas do sujeito. O presente protocolo detalhes os passos necessários para executar adequadamente as medidas de oscilações forçadas em ratos usando um ventilador pistão controlado por computador (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Quebec, Canadá). A descrição é dividido em quatro partes: etapas preparatórias, ventilação mecânica, medidas de função pulmonar e análise de dados. Ele também inclui detalhes de como avaliar a capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos anestesiados, uma aplicação comum deste technique que também se estende a outros resultados e várias patologias pulmonares. As medições obtidas em ratinhos ingénuos, bem como a partir de um modelo orientado de estresse oxidativo de danos nas vias aéreas são apresentados para ilustrar a forma como esta ferramenta pode contribuir para uma melhor compreensão e caracterização de alterações fisiológicas estudadas ou modelos de doença, bem como a aplicações em novas áreas de investigação.

Sistema respiratório medições mecânica. Tabela 4 mostra os resultados típicos da naive A / J mice obtidos na linha de base e após a broncoconstrição induzida por metacolina (12,5 mg / ml), utilizando qualquer uma das duas gerações flexiVent suportadas pelo software flexiWare 7. Mecânica do sistema respiratório, ou seja, em condições tórax fechado, foram avaliados por uma alternância de perturbações da frequência de famílias individuais e em banda larga de oscilações forçadas de forma espaçadas (SnapShot-150, Quick Prime-3, respectivamente). Uma vez que a ventilação é interrompida durante as medições, a rápida Prime-3, que abrange uma faixa de freqüência semelhante ao do Primeiro-8, mas tem uma duração mais curta (3 vs 8 sec), foi selecionado a fim de encurtar o período de apnéia, minimizar o efeito de a perturbação dos gases sanguíneos e proporcionar uma melhor resolução da resposta. Os parâmetros associados com cada perturbação foram calculados automaticalmente pelo software operacional. Os resultados mostram que as duas gerações do sistema flexiVent produzido medidas equivalentes da mecânica respiratória. Sítio de resposta do pulmão. Distinguir o site de resposta do pulmão permite ao investigador identificar regiões mais afetadas, bem como para identificar possíveis pontos de intervenção farmacológica 6. Por exemplo, sem tratamento prévio A / J ratinhos mostram um aumento da resistência de linha de base quando a pressão expiratória final contra o qual são feitas as medições é aumentada de 3 a 9 cm H 2 O (Figura 6A, instantâneo-150). No presente exemplo, o uso de medições de banda larga (TOF rápida Prime-3) fornecidos detalhes para esclarecer a base para a alteração na resistência: A alteração na pressão expiratória final resultou numa diminuição da resistência das vias aéreas (R N) consistente com a efeitos broncodilatadores de volume pulmonar superior e da imprensa inflação maiorure (Figura 6D), e um aumento do tecido de amortecimento (G, A Figura 6E), um parâmetro estreitamente relacionada com a resistência do tecido, que reflete a viscoelasticidade do tecido e, possivelmente, a resistência das vias aéreas pequenas 7. Este último é conhecido por aumentar com o aumento do volume do pulmão. Hiperresponsividade das vias aéreas. Após exposição ao gás cloro, a capacidade de resposta das vias aéreas a metacolina inalada aumenta em comparação com a exposição de ar em ratos Balb / c, como resultado de dano nas vias aéreas 4 (Figura 2). O cloro é conhecida por induzir o estresse oxidativo, levando à destruição das células estruturais das vias aéreas, em especial as células epiteliais, e induzir o recrutamento de células inflamatórias. Tal como representado na Figura 5, as alterações em todos os parâmetros que descrevem a mecânica do sistema respiratório pode ser observado na resposta a desafios crescentes de metacolina. Em comparação com os ratos expostos ao ar, os ratos expostos a cloraçãogás ne apresentarem maiores respostas máximas em todos os parâmetros da TOF (Figura 5A, 5B, 5D-5F), bem como um deslocamento para a esquerda estatisticamente significativa da curva de concentração-resposta exemplificado por uma diminuição da concentração de metacolina necessária para provocar uma duplicação da resistência e elastância (PC 200; Figura 5C). Esses resultados ilustram, respectivamente, a hiper-responsividade das vias respiratórias e hipersensibilidade a metacolina inalada, após exposição ao gás de cloro. Outras medições. Além TOF, o sistema flexiVent também pode ser usado para recolher outros tipos de função pulmonar ou 8-10 11 medições cardiovasculares. Figura 7 mostra uma curva representativa gradual, pressão orientada pressão-volume em naive A / J ratinhos sob condições basais . A porção superior do membro deflação da curva é ajustada à equação Knowles Salazar-12 </<html> sup&gt; e os parâmetros são calculados automaticamente pelo software. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="Tabela 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 1. Exemplos de regimes anestésicos utilizados em camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar a tabela</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="Tabela 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> Tabela 2. Perturbações utilizados para medições da função pulmonar em camundongos. * Extensão necessário ao sistema. O assunto também precisa estar em uma câmara fechada pletismógrafo durante as medições.escorrido &quot;&gt; Clique aqui para ver maior mesa. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="Tabela 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 3. Exemplo de parâmetros exportados a partir da freqüência de perturbação famílias de oscilações forçadas individuais e em banda larga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ampliar a tabela</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="Tabela 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabela 4. Comparação do sistema. Comparação dos parâmetros mecânicos de pulmão coletadas utilizando as duas gerações do sistema flexiVent operados por software flexiWare 7. Os resultados foram obtidos em ratinhos naive A / J (n = 5 /<html> grupo) no início do estudo e após broncoespasmo induzido pela metacolina (HCM 12,5 mg / ml). * Os grupos foram comparados usando uma ANOVA de duas vias para medidas repetidas eo log 10 das respostas individuais para homogeneidade das variâncias (GraphPad Prism, versão 5.03, GraphPad Software, San Diego, EUA). <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> Figura 1. Capturas de uma inflação do pulmão profundo. O painel superior mostra o volume deslocado pelo pistão do ventilador (traço vermelho) e o volume entregue ao sujeito (cinza de rastreio). O painel inferior mostra o aumento da pressão do cilindro para uma pressão ajustada, de 30 cm H 2 O, durante um período de 3 segundos, e mantido constante durante o mesmo período de tempo. 172/50172fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Exemplo de um roteiro típico usado para avaliar a mecânica do sistema respiratório no início. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Esforços inspiratórios espontânea durante a execução de uma curva de pressão-volume gradual. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> Figura 4. Tempo de-curso seguinte resposta de metacolina desafios inalados aumentando. Resultados são expressos como a média (± desvio padrão) de um grupo de 5 naive espontaneamente hiperresponsivas A / J mice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> Figura 5. Mudanças na mecânica do sistema respiratório seguintes desafios crescentes de metacolina em cloro e ar expostos camundongos Balb / c. Valor de pico foi identificado para cada parâmetro em cada assunto e condição experimental. Médias de grupo foram então calculada (média ± desvio padrão, n = 4-6). Diferenças entre os grupos foram avaliados por análise de variância usando o log 10 das respostas individuais para homogeneidade das variâncias. A concentração de metacolina, produzindo uma duplicação da linha de base (PC 200) foi obtida ajustando uma polinomial de segunda ordem de curvas de dose-resposta individuais e interpolação da curva ajustada. Os pontos de dados estão em falta no D, E e F nos ratos cloro expostasnas duas maiores concentrações de metacolina, devido à insuficiente altos coeficientes de determinação refletindo um ajuste ruim do modelo matemático com os dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> Figura 6. Particionamento da resposta respiratória em vias aéreas e mecânica de tecido pulmonar. Traço Experimental de um ingênuo A / J ratos ilustrando único (2,5 Hz) e banda larga (1-20.5Hz) freqüência de oscilação forçada medições da mecânica respiratória em triplicado em dois pressões expiratórias finais diferentes (3 e 9 cmH 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> </a&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="Figura 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> Figura 7. Curva pressão-volume em ingênuos A / J camundongos em condições basais. Curvas de pressão-volume foram gerados usando uma perturbação pressão orientada passo a passo (PVs-P) para garantir que cada rato pulmões foram inflados com a mesma pressão, independentemente de sua condição. Salazar-Knowles parâmetros da equação extraídos de curvas pressão-volume individuais também foram calculados e relatados em um formato de tabela. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão (n = 6).

O presente protocolo fornece uma descrição passo-a-passo detalhado dos procedimentos necessários para a execução de medidas de mecânica do sistema respiratório, bem como a avaliação da capacidade de resposta das vias aéreas à metacolina inalada em ratos utilizando a técnica de oscilações forçadas (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar medições de oscilação forçada da mecânica respiratória em camundongos utilizando o flex event, um ventilador com pistão controlado por computador e disponível comercialmente. Isso será realizado por meio da avaliação da resposta das vias aéreas à metilcolina inalada. O primeiro passo é preparar os reagentes necessários, o equipamento e o animal experimental.Em seguida, o sujeito é conectado ao ventilador para ventilação mecânica e medições da mecânica respiratória. Utilizando um script predefinido, é realizada uma série de medições automatizadas altamente controladas na linha de base e após o desafio com metilcolina. A análise dos resultados pode mostrar hiperrresponsividade das vias aéreas, observada pelas maiores respostas máximas de resistência e elastina em camundongos expostos ao cloro em comparação com os sujeitos controle.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela fornece uma ferramenta precisa para medir a função pulmonar de maneira abrangente, detalhada e translacional. Isso é alcançado por meio da análise de sinais de pressão e volume adquiridos em resposta a formas de onda de fluxo de ar oscilatório pré-definidas aplicadas na abertura das vias aéreas do sujeito. Além disso, muitos fatores que influenciam a resposta fisiológica podem ser controlados e padronizados.Utilizando este método, ligue o sistema Flex event FX e inicie o software. O presente protocolo aplica-se a qualquer uma das duas gerações do flex event suportadas pelo flexi. Use o software seven na primeira sessão de experimentação ou a qualquer momento antes disso. Abra o módulo de definição e planejamento do estudo para predefinir a estrutura do estudo.Clique no botão para criar um novo estudo e siga o assistente para criar o estudo. Esboce o protocolo e defina os grupos experimentais e os sujeitos a serem estudados. Inicie uma sessão de experimentação abrindo o módulo de sessão de experimentação e seguindo a sequência de inicialização.Para estudo e seleção de modelo. Atribua um sujeito ao local de medição e confirme seu peso. Prossiga com a calibração do sistema seguindo as etapas descritas no software operacional.É exibido um aviso para conectar a cânula a ser utilizada ao tubo em Y para calibração. Prossiga com a calibração da cânula seguindo os passos do assistente de calibração e verifique se os valores obtidos estão dentro da faixa especificada. Se necessário, repita o processo de calibração; caso contrário, cancele os avisos para iniciar a ventilação e o registro de dados.Estes podem ser iniciados em um momento posterior. Anestesiar o sujeito utilizando doses apropriadas de agentes anestésicos. Verificar que o sujeito atingiu um nível cirúrgico de anestesia.O animal não deve apresentar nenhuma reação ao aperto no dedo do pé e sua respiração deve ser regular e não ofegante. Posicione o animal em decúbito dorsal com uma fonte de calor para manter a temperatura corporal adequada. Uma lâmpada de 60 watts colocada a 45 centímetros do camundongo é suficiente.Em seguida, limpe a região da garganta com álcool para expor a traqueia. Faça uma incisão e separe suavemente a glândula submandibular e a camada muscular que a recobre. Levante suavemente a traqueia utilizando um par de pinças microcirúrgicas.Em seguida, passe uma sutura por baixo dela. Corte entre os dois anéis de cartilagem mais próximos da laringe. Isso faz uma pequena incisão na traqueia sem seccioná-la.Insira a cânula calibrada na incisão e avance-a suavemente por cinco anéis traqueais. Neste exemplo, está sendo utilizada uma cânula metálica 18 de 1,2 centímetro. É essencial fixar a cânula utilizando o fio cirúrgico.O adaptador deve formar um selo hermético ao redor da cânula. Aproxime o animal cânulado do ventilador. Inicie a ventilação mecânica selecionando um perfil de ventilação predefinido ou personalizado no painel de ventilação.Agora conecte o animal ao ventilador por meio do tubo em Y. Alinhe cuidadosamente o animal com o ventilador e certifique-se de que a cânula traqueal esteja no mesmo nível do ventilador. Isso evita possíveis obstruções da cânula ou torção da traqueia no software.Execute uma perturbação com insuflação profunda clicando duas vezes no nome da perturbação para verificar a inserção e fixação da cânula. A menos que haja vazamento, o sistema manterá uma pressão de 30 centímetros de água durante um período de três segundos sem deslocamento excessivo de volume. Os traçados de volume e pressão registrados devem ser suaves, sem sinais de deslocamento ou deformação.Caso contrário, pode haver uma cânula, obstrução ou má colocação neste ponto. Transdutores de sinais vitais para monitoramento da frequência cardíaca e da temperatura corporal podem ser conectados, se necessário. O registro dos dados desses sinais pode ser iniciado a qualquer momento, manualmente ou automaticamente por meio de um script.Medições ou comandos para ativação do nebulizador, marcadores de eventos e outros podem ser automatizados usando scripts predefinidos ou personalizados para um processo experimental altamente controlado e repetível. Seis famílias de perturbações, que geram uma série de parâmetros, podem ser utilizadas para descrever a mecânica do sistema respiratório do sujeito no estado basal e após um determinado desafio. Ao iniciar as medições, é importante primeiro executar a perturbação da inflação profunda para recrutar áreas pulmonares fechadas e padronizar a história do volume pulmonar.Em seguida, verifique a ausência de esforços inspiratórios espontâneos realizando uma medição de teste. Observe os traçados do sinal de pressão na visualização do conjunto de dados selecionado. Com curvas PV em etapas.Os platôs de pressão devem ser bem definidos, sem deflexões descendentes. Uma queda na pressão indicaria um esforço inspiratório do animal. Agora, inicie o script para a avaliação da resposta das vias aéreas à metilcolina inalada clicando duas vezes em seu título.Neste exemplo, o script realiza uma sequência de medições basais em triplicata. Em seguida, aparece um aviso para carregar o nebulizador com solução salina. Ou, neste exemplo, uma solução de metilcolina: carregue aproximadamente 100 microlitros da solução no nebulizador.A nebulização começará automaticamente assim que as informações forem inseridas no software. Logo após o término da nebulização, uma sequência de medições próximas é iniciada por aproximadamente três minutos. Em seguida, uma solicitação para realizar.Outro desafio é apresentado e a sequência de medições pode ser repetida entre os desafios. Secar o interior do suporte do nebulizador com um cotonete pode ajudar a prevenir o acúmulo de gotículas ou condensação na linha inspiratória. À medida que os dados são coletados, o software calcula parâmetros associados à perturbação e fornece um coeficiente de determinação com base no ajuste dos dados ao modelo.Posteriormente, o experimento pode ser acessado por meio do módulo de revisão e relatórios do software para exportar ou analisar mais dados. Ao final do experimento, interrompa a ventilação e desconecte o sujeito. Assim que desconectado, eutanize rapidamente o animal com uma overdose de pentobarbital de sódio, após o que pode ser realizada uma lavagem broncoalveolar ou os pulmões podem ser isolados para análises adicionais.Antes de passar ao próximo indivíduo, enxágue e seque o adaptador do nebulizador, a tubulação em Y e a cânula. No software operacional, mude para o próximo indivíduo e confirme seu peso. Em seguida, prossiga com os passos de calibração sugeridos antes de continuar o experimento.No final do dia, enxágue e seque o equipamento. Lembre-se de, antes de encerrar a sessão experimental, limpar também a válvula expiratória do sistema de acordo com as instruções do fabricante para manter o desempenho do seu sistema. Os seguintes exemplos representam uma seleção de resultados típicos de experimentos com camundongos ingênuos e expostos ao cloro, resultados equivalentes de camundongos ingênuos aj.Os camundongos foram obtidos no momento basal e após a broncoconstrição induzida por metilcolina, utilizando qualquer uma das duas gerações de eventos flex compatíveis com o flexi wear sete. Como as medições de FOT de larga banda permitem a separação da resposta pulmonar em parâmetros de vias aéreas e tecido parenquimatoso, elas fornecem um meio para identificar as regiões pulmonares afetadas. Por exemplo, camundongos AJ ingênuos apresentaram um aumento da resistência basal quando a pressão final expiratória foi aumentada de três para nove centímetros de água.A alteração na pressão expiratória final resultou em uma diminuição da resistência das vias aéreas, compatível com os efeitos broncodilatadores de um maior volume pulmonar e da maior pressão de insuflação, e em um aumento no amortecimento tecidual, um parâmetro intimamente relacionado à resistência tecidual que reflete a viscoelasticidade do tecido e possivelmente a resistência das vias aéreas pequenas. Sabe-se que este último parâmetro aumenta com o aumento do volume pulmonar. Este protocolo é frequentemente utilizado para avaliar a resposta das vias aéreas à metilcolina inalada após exposição ao gás cloro.Camundongos B.SEA exibiram hiperreatividade das vias aéreas em comparação com os controles expostos ao ar. No exemplo apresentado, camundongos expostos ao gás cloro exibiram respostas máximas maiores em todos os parâmetros de FOT. Esses camundongos também mostraram um deslocamento estatisticamente significativo para a esquerda da curva de resposta à concentração, ou hipersensibilidade à metilcolina inalada, exemplificado pela redução da concentração de metilcolina necessária para causar um dobramento na resistência e na elastina.Além da TFO, o sistema de eventos de flexibilidade pode registrar outras medições, como curvas de pressão-volume. O segmento superior do ramo de desinsuflação é ajustado à equação de Salazar Knolls, e os parâmetros associados são calculados pelo software. Para obter sucesso com esta técnica, é importante prestar atenção a cada etapa, sendo particularmente relevantes a calibração do sistema, a resistência da cânula endotraqueal, o posicionamento do animal e a padronização dos volumes pulmonares.Se essas etapas forem seguidas com precisão, este método fornecerá uma caracterização precisa das propriedades mecânicas do pulmão de camundongo.

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Research

JoVE Journal

Biology

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