Name: Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas ( Apis mellifera L.) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a condicionar abelhas Apis mellifera a estímulos táteis e analisar padrões de movimento antenal usando captura de movimento 2D. Este método permite estudar aprendizado tátil e processamento sensorial em insetos.

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Agradecemos Joachim Erber por nos apresentar o paradigma de aprendizagem tátil em abelhas. Este trabalho foi apoiado pelo Cluster de Excelência 277 CITEC, financiado no âmbito da Iniciativa de Excelência alemão.

1. Preparando as abelhas <ol><li> Forrageiras néctar ou pólen são capturados no campo a partir de um alimentador de sacarose ou diretamente a partir da entrada colméia ao retornar de uma viagem de forrageamento. Cada única abelha é capturado dentro de um frasco de vidro, que é fechada com um tampão de espuma e levado imediatamente para o laboratório para posterior manipulação. </li><li> No laboratório, as abelhas capturados são brevemente arrefecida no frigorífico a 4 ° C até se mostrar os primeiros sinais de imobilidade. </li><li> Cada abelha única imobilizada é montado em um pequeno tubo de metal com fita adesiva entre a cabeça e no tórax e sobre o abdómen. Cuidados devem ser tomados para que a tromba e antenas são livremente móvel. </li><li> Pinte os olhos compostos e ocelos da abelha fixo com tinta branca (por exemplo, livre de solvente Tipp-Ex) para ocluir visão. </li><li> Adicionar uma pequena gota de cera derretida por trás da cabeça da abelha para corrigi-lo para a fita entre a cabeça eo tórax para evitar movimentos da cabeça durante as gravações. </li><li> Marcar cada abelha com um número único na fita para facilitar a identificação e colocar o tubo com a abelha fixo em uma atmosfera húmida para evitar a desidratação. </li><li> Alimentar cada abelha único durante 5 segundos, com gotículas de uma solução de sacarose a 30% apresentaram uma seringa e que todas as abelhas recuperar durante 30 min antes de iniciar o protocolo de condicionamento táctil. </li></ol> 2. Condicionado tátil <ol><li> Antes de condicionamento, cada abelha individual tem de ser testado para a resposta da extensão da probóscide (PER) a um estímulo de 30% de sacarose aplicada às antenas. Deste modo, a ponta do nariz tem de atravessar uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. Descartar todas as abelhas que não respondem com um PER para o estímulo de sacarose. </li><li> Para o condicionamento táctil utilizar um cubo de metal (por exemplo, 3 x 5 mm) com uma superfície lisa ou um padrão gravado, por exemplo, horizontal ou ranhuras verticais que formam uma grade com comprimento de onda de 150 um, como o estímulo condicionado (CS). Fou o estímulo não condicionado (EUA) utilizar uma solução de sacarose a 30% (açúcar doméstico, diluído em água). </li><li> O cubo de latão (CS) é colocado sobre um suporte de um micromanipulador (por exemplo, Märzhäuser MM33) para garantir o posicionamento exacto durante o processo de condicionamento. Os EUA é apresentada ao abelha com uma seringa cheia com uma solução de sacarose a 30%. </li><li> O procedimento de condicionamento consiste em cinco pares de estímulo táctil (CS) e uma solução de sacarose (EUA), com um intervalo inter-ensaio (ITI) de 5 min. Colocar uma única abelha em frente do micromanipulador com o estímulo táctil montado (CS). Posicionar o CS lentamente, de tal modo que a superfície do estímulo táctil é paralela à cabeça da abelha (Figura 1 A e B). A distância entre o animal e o objeto tátil deve estar no intervalo de o raio da antena de trabalho da abelha testado, isto é, a abelha deve ser capaz de verificar o estímulo táctil numa posição confortável wantenas tanto de ordem i. No exemplo mostrado na Figura 1, a distância era de 3 mm. Deixe a abelha digitalizar o estímulo tátil (CS) por 5 seg. Após o primeiro 3 seg, apresentar uma gotícula da sacarose a 30% (EUA) com uma solução de uma seringa sob a tromba. Utilize a ponta da seringa para levantar suavemente as tromba. Estimulação de sacarose sob a tromba vai provocar o incondicionado PER 15. Permitir que a abelha a lamber a recompensa de sacarose. Usar um cronometro com um sinal de alarme para manter os intervalos exactos de tempo durante o condicionamento. </li><li> O PER condicionado é usada como uma medida para o sucesso da aprendizagem de uma abelha. Após os sorteios primeiro recompensados, as abelhas começam a responder a CS apresentação por extensão de seus probóscides, indicando que eles esperam a recompensa futura. A tromba totalmente estendida observados a qualquer momento durante a janela de tempo de 3 segundos de apresentação do estímulo tátil e antes da apresentação de sacarose é classificada como uma resposta positiva. Nenhuma resposta é contado negativo. O occurrence do PER tem de ser observado pelo experimentador. O percentual de abelhas que mostram o PER durante a apresentação CS é traçado para cada tentativa. </li></ol> 3. Gravações cinemáticas <ol><li> Movimentos antenais de uma única abelha aproveitado são gravados com uma câmera de vídeo digital com uma lente macro adequado (por exemplo Basler A602f-2 equipado com TechSpec VZM 200, operado a 50 fps através de uma conexão de fio de fogo). A câmara é posicionada acima do animal numa vista de cima para baixo (Figura 1 A). Na Figura 1, a resolução espacial das gravações é de 0,02 mm / pixel. </li><li> Calibrar a câmera gravando imagens únicas de um tabuleiro de xadrez 10 mm x 10 com uma aresta de comprimento 1 mm diferentes orientações no âmbito do objectivo da câmara. A calibração pode ser feita com a caixa de ferramentas da câmara de calibração Matlab 16. </li><li> Coloque uma única abelha fixa abaixo da lente da câmera. Apresentar o estímulo táctil, fixada a um micromanipulador, Para o animal. Proceder do mesmo modo como descrito para o condicionamento táctil, e gravar o movimento da antena enquanto a abelha é digitalizar o objeto. É importante que o intervalo de trabalho completo e antenal do estímulo táctil são visíveis. As escolhas de padrões de estímulo testado e números de ensaios dependem do projeto experimental. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> O cálculo da imagem de fundo é feito em Matlab. Primeiro, o valor médio tons de cinza ao longo do tempo tem que ser calculado para cada pixel. Objetos estáticos, como a cabeça fixa da abelha e do estímulo tátil, irá constituir o fundo da imagem. Os objectos em movimento, como a duas antenas, não irá fazer parte do fundo. </li><li> Cada quadro do vídeo gravado deve ser carregada sequencialmente, e a diferença entre a imagem actual e a imagem de fundo tem de ser calculada. O resultado desta subtração enfatiza as partes da imagem que está se movendo de um quadro para outro. Ideally, as antenas da abelha são as únicas áreas de valores diferentes de zero (Figura 1C). </li><li> Para processamento adicional, as duas maiores áreas com valores diferentes de zero de pixel são assumidos como sendo as antenas. Para ambas as antenas de uma máscara binária deve ser gerado para cada pixel contendo um valor de 1, se o pixel pertence à antena e 0 valor de outra forma. Esta máscara serve como uma base para a localização das pontas antenais mais tarde. Para ganhar uma máscara preliminar para a totalidade da imagem do cinzento-valor de cada pixel da imagem de diferença é comparada com um limiar pré-definido. Desde que cuidar de ruído ainda este limiar é escolhido para ser bastante baixa. A máscara de preliminar, então ainda tem dois tipos de erros: em primeiro lugar, devido a regiões da imagem de ruído pequenas ainda fazem parte da máscara. Em segundo lugar, as superfícies que pertencem à antena pode não ser necessariamente totalmente ligado. A última ocorre principalmente quando o fundo tem aproximadamente a mesma que a luminescência da antena. Para eliminar esses artefatos, padrãooperação de processamento de imagem morfológica são aplicadas, ou seja, uma combinação de imagem erosão e dilatação, contando com as funções padrão do Matlab imerode e imdilate respectivamente (ver 17 pp 158-205 para mais explicações). Após o processo de suavização das hipóteses antenas estão ainda contidos no interior da mesma máscara. Assim, como um próximo passo a máscara binária é agrupado para áreas disjuntas usando o padrão Matlab função bwlabel (veja 17 pp 40-48 para mais detalhes sobre o algoritmo de segmentação de imagem). </li><li> O número de pixels por cluster é contado e os dois maiores grupos são selecionados. O centro de gravidade é calculada para distinguir entre a antena do lado esquerdo e direito (Figura 1D). </li><li> A ponta da antena para cada antena pode ser definida como o pixel de um agrupamento com o valor mais elevado na direcção proximal para distal (ver Figura 1D). </li></ol>

<ol><li>Page, R. E., Scheiner, R., Erber, J., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+evolution+of+division+of+labor+and+foraging+specialization+in+a+social+insect+%28Apis+mellifera++L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development and evolution of division of labor and foraging specialization in a social insect (Apis mellifera L.).</a> Curr. Top. Dev. Biol. 74, 253-286 (2006).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Preparação das abelhas: Coleta e fixação das abelhas deve ser feito rapidamente, a fim de manter o nível de estresse do baixo animal. O stress tem um efeito sobre a capacidade de resposta PER-e, portanto, pode ter um efeito indirecto sobre o desempenho da aprendizagem em abelhas 19, 20. O nível de tensão pode ser reduzida ao colocar os frascos de vidro com as abelhas directamente em gelo imediatamente após a colheita para imobilizá-los rapidamente. Tem que ser tido em conta que as abelhas pre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Forrageiras pólen, Apis mellifera L. </td><td></td><td></td><td> Colméias privadas </td></tr><tr><td> Frascos de vidro (22 x 45 mm) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> X655.1 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de bronze, 10 x 30 mm </td><td></td><td></td><td> Auto-produzido </td></tr><tr><td> Cubo de latão, 3 x 5 mm </td><td></td><td></td><td> Auto-produzido </td></tr><tr><td> Tipp-Ex (sem solventes) </td><td> Tipp-Ex GmbH &amp; Co KG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de sacarose (30%) </td><td></td><td></td><td> Suger casa diluído em água </td></tr><tr><td> Etanol (70%) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 9065,3 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Seringa (1 ml) e agulha (0,6 x 25) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 59,1 </td><td></td></tr><tr><td> Cronômetro </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> L423.1 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Märzhäuser MM33 </td><td> 00-42-101-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera de vídeo digital </td><td> Basler A602f-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lente macro para a câmera </td><td> TechSpec VZM 200 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matlab R2009b </td><td> The MathWorks </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

condicionado tátil e análise do movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; apis mellifera</em&gt; l.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são insetos eussociais e bem conhecidos por sua complexa divisão do trabalho e capacidade de aprendizagem associativa 1, 2. As abelhas operárias passar a primeira metade de sua vida dentro da colméia escuro, onde estão as larvas de enfermagem ou a construção dos favos hexagonal regular de alimentos (por exemplo, pólen ou néctar) e prole 3. As antenas são extraordinários antenas multissensoriais e desempenham um papel fundamental em diversas funções táteis mediadas 4, incluindo a construção colméia 5 e 6 de reconhecimento de padrões. Mais tarde na vida, cada única abelha deixa a colméia para procurar alimentos. Em seguida, uma abelha tem que aprender a discriminar fontes de alimento rentáveis, memorizar a sua localização, e comunicar a seus companheiros de ninho 7. As abelhas utilizam diferentes sinais florais como cores ou odores 7, 8, mas também pistas tácteis da superfície pétala 9 para formar memórias multissensoriais da fonte de alimentação. Em laboratório conditions, as abelhas podem ser treinadas em um paradigma de aprendizagem apetitiva discriminar características do objeto tátil, como bordas ou sulcos com suas antenas 10, 11, 12, 13. Este paradigma da aprendizagem é estreitamente relacionado com o condicionamento clássico olfactory extensão da resposta tromba (PER) em abelhas encapsuladas 14. A vantagem do modelo de aprendizagem tátil no laboratório é a possibilidade de combinar as experiências comportamentais na aprendizagem com várias medições fisiológicas, incluindo a análise do padrão de movimento da antena.

No experimento seguinte estudou como o aprendizado afeta o comportamento tátil amostragem antenais de abelhas. Para isso, é monitorado o movimento da ponta da antena de abelhas naive e condicionado antes e durante a apresentação de um estímulo táctil. Em primeiro lugar, o movimento espontâneo antenal de um grupo de forrageadoras pólen (N = 42) foi registado durante 1 min. Metade das abelhas (N = 21) foi, em seguida, condicionado por emparelhamento cinco vezes um estímulo táctil com uma recom...

Neste protocolo, mostramos como condição aproveitado abelhas aos estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de multa escala padrão de amostragem antenal.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Os objetivos gerais deste procedimento são mostrar como condicionar as abelhas a estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de escala fina e 10 padrões de amostragem. No início, o procedimento requer a captura de abelhas voando livremente na frente de sua colmeia. O segundo passo é aproveitar as abelhas em tubos de metal e ocluir seus olhos com tinta branca.Em seguida, as abelhas são treinadas para estímulos táteis usando o procedimento clássico de condicionamento. A etapa final é registrar o movimento de uma antena da abelha condicionada com uma câmera de vídeo digital. Em última análise, a captura de movimento 2D no MATLAB é usada para analisar mudanças no comportamento do movimento de uma antena em abelhas após paradigmas de aprendizado tátil associativo e não associativo.Este método pode ser usado para estudar a discriminação tátil e a percepção em várias espécies alteráveis. Ele pode diferenciar mudanças devido ao aprendizado tátil não associativo de mudanças que ocorrem a partir do aprendizado associativo, como durante o condicionamento. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as abelhas precisam ser manuseadas com muito cuidado e o momento do procedimento de condicionamento tátil é crítico.O método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da detecção de toque ativo. Ele usa um comportamento reflexo natural como um comportamento de relato, permitindo-nos dizer se o animal pode ou não discriminar entre dois estímulos táteis. Para começar, colete abelhas diretamente da entrada da colmeia.Capture cada abelha em um frasco de vidro fechado com um tampão de espuma e leve-o imediatamente ao laboratório para posterior manuseio no laboratório. Resumidamente, resfrie as abelhas em uma geladeira de quatro graus Celsius até que comecem a mostrar sinais de imobilidade. Primeiro, imobilize cada abelha em um tubo de metal.Coloque fita adesiva ao redor da cabeça e do tórax e sobre o abdômen. Confirme se o probo e uma antena são livremente móveis para obstruir a visão da abelha. Pinte os olhos compostos e o selli com tinta branca.Coloque uma pequena gota de cera derretida entre a cabeça e a fita para evitar que a cabeça se mova. Durante as gravações. Para facilitar a identificação, marque a fita de cada abelha com um número e coloque o tubo em uma atmosfera úmida para evitar a desidratação.Por fim, use uma seringa cheia de solução de sacarose a 30% para alimentar cada abelha por cinco segundos e deixe-as se recuperar por 30 minutos. Antes de iniciar o protocolo de condicionamento tátil, antes do condicionamento, teste cada B para a resposta de extensão psis ou PER. Para fazer isso, aplique um estímulo de sacarose a 30% nas antenas para uma resposta correta.A ponta do psis tem que cruzar uma linha virtual entre as mandíbulas abertas. Apenas abelhas com PER correto são usadas para o estudo. Para o condicionamento tátil, estruturas de superfície metálica são usadas como estímulo condicionado ou cs.Sua superfície pode ser lisa ou ranhurada para criar uma textura diferente. O estímulo incondicionado ou US é uma solução de sacarose a 30%. Coloque o cubo de latão em um suporte em um micro manipulador.Isso permitirá o posicionamento exato durante o procedimento de condicionamento. Uma vez que o estímulo tátil tenha sido montado, coloque uma abelha na frente do micro manipulador. Em seguida, posicione lentamente os Cs de forma que a superfície do estímulo tátil fique paralela à cabeça da abelha.A abelha deve ser capaz de escanear o estímulo tátil em uma posição confortável com uma antena. Para iniciar o procedimento de condicionamento, permita que o cordão escaneie o estímulo tátil por cinco segundos. Após os primeiros três segundos, use uma seringa para apresentar uma gota da solução de sacarose a 30% sob os probos.Use a ponta da seringa para levantar suavemente o probus. Essa estimulação deve provocar o PER não condicionado. Permita que a abelha lamba a sacarose.Recompensa por um segundo. Prossiga com o procedimento de condicionamento até que a abelha receba cinco emparelhamentos. Após os primeiros emparelhamentos recompensados, as abelhas devem começar a responder à apresentação do CS por extensão de seu psis, indicando que esperam a próxima recompensa.Uma psis totalmente estendida observada a qualquer momento durante os primeiros três segundos de apresentação do estímulo tátil antes da apresentação da sacarose é pontuada como uma resposta positiva. Finalmente, uma curva de aprendizado é gerada para um grupo de abelhas. Para isso, a porcentagem de abelhas que apresentam o PER durante a apresentação do CS é plotada para cada ensaio.Após o condicionamento, uma câmera de vídeo digital com uma lente macro adequada é usada para registrar os movimentos da antena. Aqui usamos uma câmera basler a 602 F, equipada com uma lente VZM 200 de especificação técnica operada a 50 quadros por segundo por meio de uma conexão de fio de fogo, ajustamos a câmera de forma que a abelha aproveitada e o estímulo tátil sejam visíveis. Em seguida, calibre a câmera tirando fotos únicas de um tabuleiro de xadrez calibrado de diferentes orientações.Use um software especializado com uma ferramenta de calibração de câmera para analisar as imagens. Uma vez calibrado, coloque um único B fixo abaixo da lente da câmera e apresente o estímulo tátil. Como mostrado anteriormente.Registre o movimento de vedação enquanto a abelha está escaneando o objeto. Uma vez que os dados tenham sido coletados, o MATLAB é usado para definir o fundo da imagem primeiro, calcular o valor médio da escala de cinza ao longo do tempo para cada pixel. Objetos estáticos como a cabeça fixa da abelha e o estímulo tátil constituirão o fundo da imagem subtraindo o fundo da imagem de cada quadro das partes móveis do vídeo.Idealmente, as antenas da abelha são isoladas como as únicas áreas de valores diferentes de zero para processamento posterior. As duas maiores áreas com valores de pixel diferentes de zero são consideradas as antenas an. Uma máscara é criada para localizar as pontas da antena e para toda a imagem para reduzir a quantidade de erro.Uma combinação de ferramentas de erosão e dilatação de imagem é aplicada uma vez que essas técnicas tenham reduzido o nível de ruído. Uma função de máscara binária é usada para agrupar as áreas desconexas. O centro de gravidade é calculado para os dois maiores desses aglomerados, a fim de distinguir entre a antena esquerda e a direita.Aqui, eles são rotulados em vermelho e verde. Finalmente, a ponta da antena para cada antena pode ser definida como o pixel em um cluster com o maior valor na direção proximal para distal, é criado um histograma bidimensional que mostra a distribuição espacial da ponta mostrada. Aqui está a curva de aprendizado do condicionamento tátil de PER no forjador de pólen.A porcentagem de respostas positivas após o primeiro emparelhamento foi significativamente maior quando comparada ao comportamento espontâneo, e a curva de aprendizado mostra saturação após a terceira recompensa. Neste exemplo, o movimento da ponta anal tanto no grupo condicionado quanto no ingênuo foi registrado por um minuto na presença ou ausência do estímulo tátil observado. Aqui estão os movimentos espontâneos de um túnel antes da apresentação do estímulo.O absa mostra a posição lateral da ponta do túnel, enquanto a ordenada mostra a posição distal. A escala de cores indica a porcentagem de tempo que a ponta anin passou em um determinado local. Amarelo indica locais muito frequentes locais vermelhos, menos frequentes e pretos estão fora de alcance.Esses dados mostram que tanto o grupo quanto o grupo condicionado mudaram seu padrão de movimento antal na presença de um estímulo tátil em comparação com seu comportamento espontâneo. Observe que a região amarela retangular perto da superfície do estímulo indica que a ponta do calcanhar da formiga passou muito tempo amostrando a superfície. As abelhas do grupo condicionado passaram significativamente mais tempo com a ponta da antena na área do estímulo do que as abelhas ingênuas.Após este procedimento, métodos eletrofisiológicos e farmacológicos podem ser encontrados para responder a perguntas adicionais como: qual é a base neurofisiológica para o comportamento de toque ativo em abelhas após seu desenvolvimento? Essa técnica de condicionamento tátil abriu caminho para pesquisadores no campo da detecção ativa do toque explorarem vários aspectos da discriminação de estímulos táteis, mas também da aprendizagem tátil e da memória em Alpha Pots. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a busca tátil ativa e a amostragem de movimentos e insetos.Observe que a análise de movimento pode ser expandida para análise tridimensional se pelo menos uma câmera adicional for adicionada em sincronia à primeira.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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