Name: Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: Aprenda métodos bioquímicos e microscópicos para analisar reservas lipídicas em Caenorhabditis elegans usando coloração com vermelho do Nilo. Essas técnicas permitem quantificar triglicerídeos e fosfolipídeos com precisão.

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Gostaríamos de agradecer a Michael Kacergis de assistência técnica e Wu Lianfeng para discussões e leitura do manuscrito. Este trabalho foi suportado por um prêmio de desenvolvimento de carreira do NIH / NIDDK (K08DK087941 a AAS), uma NIH / NIDDK treinamento de subvenção (5T32DK007028 a ECP), a Fundação Médica Ellison Scholar Award em Nova Envelhecimento (para AAS), e do H Charles . capa da criança Fundação Prêmio Pesquisa em Saúde (para AAS).

1. Preparação de Rectangular Amp / Tet (A / T) placas de ágar LB e placas NGM IPTG RNAi A placas / t deve ser preparado 1-4 semanas antes da utilização e armazenada no escuro a 4 ° C. <ol><li> Para 1 litro de meio adicionar 1 L de água desionizada, 32 g de agar LB, 1,5 ml de NaOH 2 M, e 2 g de agar Bacto. Autoclave 40 min no ciclo de líquidos. Depois de arrefecer até 60 ° C, adicionar 3 ml de tetraciclina e 0,5 ml de ampicilina. Verter 45 ml de meio em cada prato. </li></ol> Preparar placas de 96 poços de RNAi 3 dias até 2 semanas antes. <ol start="2"><li> Para despejar 25 placas de 96 poços de RNAi, preparar 1 litro de meio de crescimento de nemátodos (NGM): 1 L de água desionizada, 3 g de NaCl, 17 g de agarose, e 2,5 g bactopeptona. Ciclo líquido autoclave a 121 ° C durante 40 min, com uma barra de agitação. Deixar arrefecer, agitando-se num conjunto de placa quente a 60 ° C. </li><li> Quando arrefecer até 60 ° C, adicionar os seguintes soluções de reserva: 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg de colesterol / ml, 25 ml de 1 M de KH 2 </sub&gt; PO 4 (pH 6,0), 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml 200 mg / ml de carbenicilina, e 5 ml de 1 M de IPTG (ver tabela Materiais para receitas). </li><li> Pipetar 150 ul de RNAi media em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços utilizando um pipetador multicanal electrónico. Evite bolhas de ar. Mantenha a mídia em um recipiente de aço inoxidável estéril imerso em um banho de água 60 ° C, enquanto a distribuição. </li><li> Mantenha RNAi nível placas até agarose solidificar. As placas podem ser derramado até 2 semanas antes e armazenado a 4 ° C. </li></ol> Dia 1 2. Selo Placas Biblioteca congelados para retangular Amp / Tet (A / T) placas de ágar LB <ol><li> Aquecer as placas A / T para a temperatura ambiente, mantendo-os no escuro. </li><li> Transferência placas de 96 poços de biblioteca de RNAi de -80 ° C para secar gelo. Abrir a placa de alumínio, selada perto de um queimador de Bunsen. </li><li> Esterilizar um replicador de 96 pinos por imersão pinos em série (10 segundos cada) de lixívia a 10%, H2O desionizada, e E 70%Toh seguido por passagem através de pinos de uma chama. Repita EtOH e passo chama. </li><li> Aplicar replicador de estoque de glicerol congelado de 96 poços RNAi, certificando-se de cada pino de contacto com a superfície de cada poço. </li><li> Selo em uma placa / T, desenhando um círculo pequeno com cada pino sem superfície de agar prejudicial. </li><li> Placas de vedação reutilizáveis ​​e biblioteca retorno a -80 ° C. Incubar as placas estampadas A / T a 37 ° C durante a noite para o crescimento bacteriano. </li></ol> Dia 2 3. Crescer Clones RNAi bacterianas Pernoite em Poço Profundo Blocos <ol><li> Remover as placas A / T de 37 ° C e confirmar o crescimento bacteriano. </li><li> Encher cada poço de um bloco de 96 poços profundos poços com 1,5 ml de LB com 200 ug / ml de carbenicilina. </li><li> Esterilizar 96-pin replicador (ver passo 2.3). </li><li> Aplicar replicador para o topo da placa A / T, tornando pinos certeza fazer contacto com cada clone bacteriano RNAi. Levante replicador e pinos de mergulhar no bloco de poço profundo. Redemoinho, e, lentamente, remover, fazendo certain não contaminar poços adjacentes. </li><li> Selar bloco com respirar fácil filme. Incubar durante a noite a 37 ° C com agitação (950 rpm em MT Infors Microtiteron II agitador, preferido, ou 250 rpm com 25 mm de jogar incubadora com agitação). </li></ol> Dia 3 4. Clones bacterianos semente de RNAi em placas de 96 poços NGM RNAi <ol><li> Remover as placas de 96 poços de RNAi de 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente. </li><li> Remover profundo bem-blocos e centrifugar 10 min a 4.000 x g. </li><li> Rapidamente inverter blocos em pia para drenar mídia, e carimbar invertido em toalha de papel para eliminar o excesso de mídia. </li><li> Dentro de uma câmara de fluxo laminar, adicionar 40 ul de meio LB com 200 ug / ml de carbenicilina a cada poço e de vedação com uma película esterilizada. </li><li> Voltar à temperatura ambiente blocos agitador bacteriana durante 10 minutos para re-suspender pellets, ou manualmente ressuspender pelotas por pipetagem cuidadosa. </li><li> Na capela de fluxo laminar, remova filme estéril e bactérias transferência do fundo-blocos bem em placas de 96 poços de RNAi. Adicionar 40 uL de bactérias ressuspensos às linhas &quot;A&quot; e &quot;H&quot;, e 35 ul de todas as outras linhas. Mais líquido é adicionado aos poços de bordo da placa de RNAi de 96 poços para evitar ressecamento e rachaduras da agarose. </li><li> Deixe as placas para secar descobertos na capa de 4-6 horas, inspecionando regularmente para secura. Bactérias seca aparecer claro, não nublado. Cubra, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> 5. Prepare uma População Synchronous de Worms Duas placas de 10 cm cheios com muitos vermes grávidas são utilizados para a preparação de ovos para cada 6 placas de 96 poços de RNAi. Certifique-se de vermes não são sedentos por pelo menos duas gerações (7 dias). <ol><li> Prepara-se uma população de L1 síncrona como previamente descrito 20. Para 20 ml de solução de lixívia, usar 4 lixívia ml, 1 ml de NaOH (10 M), 5 ml de H2O desionizada e 10 ml de tampão M9. </li><li> Sincronizar vermes durante a noite em 10 ml de uma M9 15 ml estériltubo de polipropileno, com rotação a 20 ° C. </li></ol> Dia 4 6. Adicionar Worms para Placas de RNAi <ol><li> Centrifugar preps de ovo a 3000 xg durante 1 min. Aspirar o sobrenadante, ficar longe da pelota de L1 filhotes. Ressuspender em 5 ml de tampão M9 com 0,0005% de Triton X-100. A adição de uma pequena quantidade de detergente evita vermes se colem ao pipeta e não tem efeito sobre a coloração de gordura. </li><li> Contar os vermes ao microscópio. Se necessário, ajustar a concentração de 10-15 vermes por microlitro. </li><li> Na câmara de fluxo laminar, para cada placa de 96 poços a serem semeadas, adicionar 75 ul de vermes ressuspensos em cada poço de uma linha de um bloco de ensaio raso poços. Utilizando uma pipeta multicanal manual, adicionar 50-75 vermes em 5 ul a cada poço das placas de 96 poços de RNAi. </li><li> Permitir que as placas a secar a capa de 30 a 60 min. Quando seca, sob um microscópio, vermes deve aparecer para estar cheio, não se debatendo. </li><li> Vermes crescer em placas de RNAia 20 ° C para ~ hr 64. </li></ol> Dia 7 7. Corrigir e Mancha Worms em Vermelho do Nilo <ol><li> Remover as placas da incubadora de RNAi. Observar com um microscópio e registro de fome ou debulha (molhado) poços a serem excluídos de uma análise mais aprofundada, pois estas condições afetam a massa de gordura. </li><li> Utilizando um pipetador de repetição electrónico, adicionar 150 ul de PBS com 0,01% de Triton X-100 a cada poço de uma placa de RNAi. Com uma mistura de multi-canal pipetador manual, e o líquido de transferência de vermes para a correspondente linha de uma placa de PCR de 96 poços profundos. Evitar a interrupção do ágar. Repetir para um total de 300 ul de vermes em PBS por poço. </li><li> Quando as placas quatro foram transferidos, centrifugar as placas a 500 rpm durante 1 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante utilizando um aspirador de vácuo 96 pinos, deixando ~ líquido de 25 ul e verme pellet no fundo do poço. </li><li> Adicionar 150 ul de 40% de isopropanol a cada poço para fixar os animais. Certifique-se de que a pipeta está em uma velocidade suficientemente elevada para misturar vermepellet com 40% de isopropanol. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Placas centrífuga descoberto a 500 rpm por 1 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante utilizando um aspirador de 96 pinos ou manualmente, deixando apenas 25 ul de 40% isopropanol + verme pellet no fundo do poço. </li><li> A cada cavidade, adicionar 150 ul de solução de coloração de vermelho do Nilo preparada imediatamente antes da sua utilização: 6 ul de solução-mãe do Nilo vermelho de 0,5 mg / ml em acetona, por 1 ml de 40% de isopropanol. </li><li> Placa de vedação com os não-estéril filme adesivo e da mancha no escuro durante pelo menos 2 hr. </li></ol> 8. Lavagem e Imagem Worms em um microscópio de alta capacidade <ol><li> Centrifugar a 500 rpm durante 1 minuto e aspirar todo mas 25 ul de corante vermelho de Nilo. </li><li> Adicionar 150 ul de PBS com 0,01% de Triton X-100 a cada poço e são armazenadas no escuro durante pelo menos 30 min. </li><li> Centrifugar a 500 rpm durante 1 min. </li><li> Utilizando um pipetador de 12 canais, animais aspirado a partir do fundo de cada poço com 2 x 7 rápido ulacidentes vasculares cerebrais e dispensar numa lâmina de vidro de 96 poços de Teflon-impresso. Cuidadosamente, sem necessidade de remover os vermes, remover 9,5 ul de PBS a partir de cada cavidade de corrediça. Se a sua lâmina de vidro não se encaixa diretamente em sua montaria microscópio, um suporte de slides personalizada alumínio usinado deve ser usado para montar vermes. </li><li> Lâmina de cobertura inferior lentamente em slides de 96 poços. Essa etapa pode levar um pouco de prática para evitar bolhas ou atravessar de vermes em outros poços. Cantos seguras com tack adesivo. </li><li> Slides de imagem na campo claro e fluorescência com um filtro de GFP / FITC definido em um microscópio automatizado. Os photobleaches sinal de lipídios facilmente assim que deve ser trabalhada de forma sistemática em todos os poços, e não manualmente, como fotodegradação vai levar a diferenças artificiais entre os poços. Para mais detalhes sobre a análise, consulte Resultados representativos e Discussão. </li></ol> 9. Determinação de lipídeos bioquímica extração em fase sólida (SPE) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (CG / MS) <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Para validação dos níveis de lípidos com base na fluorescência vermelha do Nilo, cromatografia gasosa seguida de análise por espectrometria de massa (GC / MS) pode ser realizada em ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) derivados de triacilgliceróis (TAG) e fosfolípidos (PL) de pelotas verme. Etapas que envolvem produtos orgânicos deve ser realizado sob uma coifa. Cuidados devem ser tomados para que os lipídios são mantidos sob nitrogênio protegido da luz durante o armazenamento prolongado ou etapas de incubação como eles são muito vulneráveis ​​à oxidação. Pelotas verme de 2,500-5,000 animais síncronos são usados ​​como entrada, preparada exactamente como descrito acima, excepto que os animais são cultivadas em placas de 10 cm de RNAi. <ol><li> Lavar 2,500-5,000 vermes de cada placa de 10 cm com 10 ml de tampão M9 em um tubo de polipropileno de 15 ml. Pellet vermes a 500 xg, durante um minuto, e lavar pellet novamente com 10 ml de tampão M9. Animais de pelotas a 500 x g. Aspirar deixando 250 ul de volume total, e, ou congelamento em azoto líquido e armazenam-se a -80 ° C sob atmosfera de azoto for posterior processamento ou prosseguir diretamente. </li><li> O worm pellet pode ser levado diretamente para a etapa 9,3 se a massa de triglicérides deve ser normalizado a massa fosfolipídio 8,13,21. No entanto, se o investigador deseja normalização do teor de proteínas ou de conteúdo de ADN, o vírus deve ser sedimento sonicado em maior intensidade num sonicador de banho durante 10 minutos, 30 segundos ligado, 30 segundos desligado, a 4 ° C. Se a normalização da proteína ou ADN é desejada, remover uma alíquota de 5 ul e determinar a concentração de proteína total utilizando um reagente de Bradford ou de conteúdo de ADN total ou semelhante, após a purificação em coluna, utilizando um espectrofotómetro de UV. </li><li> Adicionar 1,5 ml de vermes 02:01 clorofórmio: metanol num tubo de vidro de borossilicato com rosca. Toda a transferência de solventes orgânicos deve ser feito usando pipetas de vidro. </li><li> Utilizando uma pipeta de 50 uL wiretrol, adicionar 25 fosfolípido padrão nM em 50 uL, e de 16,7 nM padrão de triglicéridos em 50 ul. Ambos os padrões deve ser dissolvido em 2:1 clorofórmio: metanol, tapado hermeticamente,e armazenada sob atmosfera de azoto ao abrigo da luz em um congelador -80 ° C para evitar a oxidação. </li><li> Cap com tampa de compostos fenólicos e vortex. Extrair durante 1 h à RT, vórtice cada 15 min. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Transferir a fase inferior orgânica sem carcaças para um tubo de cultura de borossilicato. </li><li> Adicionar 0,3 ml de NaCl 0,9%, vortex e centrifuga-se a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Transferir a camada inferior orgânica para um tubo de cultura fresca de borosilicato, tendo cuidado para não transferir sobre qualquer da fase aquosa. </li><li> Fase orgânica seca sob azoto. Para iniciar a extracção em fase sólida (SPE) ressuspender lípido seco em 1 ml de clorofórmio. Alternativamente, para a separação e análise detalhada de diferentes classes lipidicas, incluindo as classes de fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, diacilgliceróis, triacilgliceróis, ácidos gordos e ésteres de colesterol, a cromatografia em camada fina como pioneiro o laboratório em Watts C. elegans 22 podem ser usados ​​no lugar de SPE. Lipídios também pode be separados por HPLC e as fracções analisadas por GCMS. Sofisticados métodos de todo-lipidome perfil pelo liquid-chromatography/MS (LCMS) também pode ser usado 23-26. </li><li> Montar coluna de sílica SPE em colector SPE. Pré-equilibrar coluna com 3 ml de clorofórmio. Permita que o solvente flua por gravidade. </li><li> Carregar amostra lipídico numa coluna SPE, recolhendo fluxo através de um tubo roscado de borossilicato como parte da primeira fracção (fracção TAG). Lipídios mais neutras virão através deste ml um primeiro fluxo através. Adiciona-se 3 ml de clorofórmio para eluir completamente fração TAG, recolhendo fluxo através do tubo fração TAG. </li><li> Retire e tampar o tubo de coleta de primeira, e substituir por um tubo de coleta limpo. Eluir glicoesfingolípidos com 5 ml de acetona: metanol 9:1. Nós normalmente não analisar a composição de ácidos gordos desta fracção, no entanto, ela pode conter informações valiosas e podem ser guardadas para a preparação de ésteres metílicos e bases sphingoid livres para análise adicional utilizandoprocedimentos especializados distintos daqueles para TAG e PL como previamente descrito 27. </li><li> Substitua tubo de coleta de glicosfingolípidos com um tubo de coleta de segunda rosca borosilicato. Eluir os fosfolípidos com 3 ml de metanol (fracção PL). </li><li> As fracções podem ser armazenadas a -80 ° C neste ponto tampado firmemente sob atmosfera de azoto. Seco purificado lípidos, sob azoto. Para aumentar a velocidade de secagem, a um bloco de aquecimento a 33 ° C. Nunca armazenar lipidos na forma seca, uma vez que são particularmente susceptíveis à oxidação, no estado seco. </li><li> Ressuspender as fracções lipídicas secas em 2 ml de 2% de H 2 SO 4 em metanol por agitação em vórtex e incubar tapado hermeticamente durante a noite num banho de água a 55 ° C para criar FAMEs. Cuidados devem ser tomados para obter absolutamente nenhuma água na reação fama como isso irá inibir a derivação de lipídios. Nós descobrimos que a derivatização mais eficiente por incubação durante a noite e a literatura sugere oxidação lipídica menos ocorre a temperaturas mais baixas during preparação FAME 28. Um método alternativo e mais rápida é a utilização de 2 ml de 2,5% de H 2 SO 4 em metanol e derivatizar durante uma hora a 70 ou 80 ° C 21,22,29. </li><li> Na manhã seguinte, retire do banho, e deixe esfriar. Adicionar 1,5 ml de H 2 O (para extinguir a reacção) e, em seguida, 0,3 ml de hexano (para extrair os FAMEs) para cada fracção de TAG e PL. Agita-se vigorosamente e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Muito cuidado remover só a camada superior hexano utilizando uma pipeta padrão ou pipeta Pasteur. Dispensar no tubo do amostrador automático. Certifique-se de não incluir qualquer metanol acidificado como isso vai destruir a coluna de GC e MSD. </li><li> Cap e amostras de carga para GC / MS. A amostra é transferida em hexano, para um frasco de micro-pastilha Agilent tampado com uma tampa de rosca de PTFE-silicone-PTFE. Ele é transferido para o 6890/5973N modelo GCMS Agilent equipado com um Supelcowax-10 (24079) 30 metros, 250 micron coluna capilar de sílica fundida. Um microlitro é injectado intoa entrada splitless regulada para 250 ° C e 13,33 PSI Ultrapure hélio é utilizado um gás transportador. A corrida protocolo é o seguinte em uma constante de 1 ml por min: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Instrução </td><td> Temperatura meta </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Segure 2 min </td><td> 150 ° C </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rampa de 10 ° C por min </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Segure 4 min </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rampa de 5 ° C por min </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Segure 3 min </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Rampa de 10 ° C por min </td><td> 270 ° C </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Segure 5 min </td><td> 270 ° C </td></tr></tbody></table> Um atraso de 3 min o solvente é utilizado na MSD para minimizar o desgaste do filAment. Em seguida, as massas entre 50 e 550 Daltons são detectados com o conjunto MS quadruplicar a 150 ° C e a fonte de ms fixada em 230 ° C, com uma temperatura térmico auxiliar de 270 ° C.

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar.

O protocolo apresentado permite a rápida triagem, escala grande de níveis de lipídios em C. elegans, que podem ser facilmente adaptados para telas de alto rendimento. Ao contrário dos métodos anteriormente utilizados, os quais envolvem uma etapa de fixação prolongado em paraformaldeído seguido de vários ciclos de congelamento-descongelamento 8,10, o nosso protocolo requer uma fixação simples de 3 min em isopropanol. Descobrimos que, através da coloração C. elegans em isopropanol a 40%, transformam-se livremente permeável à Nilo vermelho, sem a utilização de passos adicionais de congelação-descongelação ou fixação. Além disso, como vermelho do Nilo selectivamente fluoresce em compartimentos hidrofóbicos no espectro verde 18,19,31, nenhuma descoloração é necessário. No total, os animais podem ser tomadas a partir de placas de RNAi para animais de imagens manchadas e pronto para em pouco mais de 2,5 horas. Este método pode ser realizado de forma relativamente barata e com alta reprodutibilidade. O método não depende da capacidade de C. elegans para absorção ou concentradoo corante, e, portanto, não tem as mesmas limitações que a alimentação à base de métodos que utilizam corantes vitais. Dada a reprodutibilidade e precisão das medições, o método é adequado para o rastreio de um grande número de genes inativações por RNAi. Se a quantificação dos níveis lipídicos é desejado baseado fixador coloração vermelho Nilo, recomendamos o uso de 4-6 biológica repetições, com os controles apropriados e teste estatístico aplicado. É provável que muitos genes inativações levando a pequenos animais (devido a clones RNAi causando atraso no desenvolvimento ou preso) iria sair de uma tela para os reguladores de gordura, independentemente de qualquer conexão com o metabolismo da gordura. Enquanto o programa de análise de imagem que utilizado para vermes contas de diferentes tamanhos através da normalização da intensidade de fluorescência para a área de sem-fim, os investigadores individuais também podem querer considerar comparando os níveis de coloração de gordura de animais de pequeno porte para animais de tipo selvagem de uma fase de desenvolvimento semelhante. Nocaso de pequenos animais ou developmentally preso com baixa massa aparente de gordura, sugerimos que nenhuma modalidade única é suficiente para demonstrar o metabolismo lipídico alterado. Várias experiências de seguimento, incluindo SPE-GCMS, poderia ser obrigada a verificar a função de lípido-regulação destes genes. Para conhecida regulador metabólico FASN-1, SPE-GCMS análise em comparação com developmentally combinados N2 animais L2 controle era necessário para confirmar o fenótipo baixo aparente gordura encontrada quando comparados com animais controle de adultos. Embora a coloração vermelha do Nilo gordura indicados os níveis de gordura mais baixos relativamente ao controlo adulto RNAi, quando comparado a fase L2, emparelhados animais de controlo de RNAi, nenhuma diferença foi observada aparente. Por conseguinte, a utilização de um segundo método, isto é, a quantificação bioquímica da proporção TAG / PL foi necessário determinar que FASN-1 é uma verdadeira regulador de massa de gordura, como FASN-1 RNAi é bioquimicamente distinguíveis das fases L2 animais de controlo correspondentes de RNAi. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora apresente imagens e de processamento de uma plataforma de alto rendimento, um microscópio convencional de pé pode ser facilmente utilizado para capturar imagens de vermes montadas em almofadas de agarose em 20 ou tamanho convencional Teflon-impresso 8-12 bem lâminas de microscópio . A única limitação é que, como a fluorescência verde de gotículas lipídicas coradas com photobleaches Nilo vermelhas rapidamente, sistemáticas, condições de exposição uniformes precisam ser usados ​​para assegurar a comparabilidade entre as imagens. Nós descobrimos que um microscópio totalmente automatizada com condições de aquisição de imagem uniforme funciona melhor para este efeito. Uma das grandes vantagens deste protocolo é que depois de imagens coletadas podem ser salvos para o futuro re-análise. As mesmas imagens pode ser usado para determinar o tamanho do corpo para além de teor de gordura. Além disso, como programas computacionais se tornam mais avançados, há a perspectiva de análise só lagarta, gerando resultados estatisticamente significativosa partir de um único poço. Assim, o nosso método que utiliza microscopia de alto rendimento tem algumas vantagens sobre os métodos de tela publicados que usam um Biosort Copas quantificar sinais fluorescentes 32,33. No entanto, as metodologias são, definitivamente, de cortesia. Determinação, bioquímico preciso do teor de lipídios por SPE e GC / MS confirma o Nilo coloração vermelha das grandes lojas de gordura no C. elegans. Embora a quantificação absoluta alcançada a partir fixador coloração vermelho Nilo e determinação bioquímica lipídica muitas vezes não correspondem perfeitamente, ambos os métodos produzem altamente reprodutíveis, resultados estatisticamente significativos que concordam qualitativamente. Além disso, este método pode ser adaptado para satisfazer as necessidades específicas dos investigadores individuais que podem necessitar de uma análise mais aprofundada das classes separadas de glicoesfingolípidos, fosfolípidos, ou os triglicéridos presentes em várias amostras. Deve notar-se que outros grupos têm utilizado a tecnologia tha outrosn SPE para separar classes de lípidos antes de GC / MS 22. Cromatografia de camada fina (TLC) e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) tem vantagens sobre SPE em que eles podem ser capazes de melhor separar distintos lípidos neutros (por exemplo, TAG, diacilgliceróis, ácidos gordos livres e ésteres de colesterol), a partir de lípidos polares (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina) e glicol-esfingolípidos. Nós escolhemos SPE, porque exige um mínimo de matéria-prima (2,500-5,000 vermes), enfatiza as grandes lojas de energia a longo prazo, tags, que compõem a maior parte da fração lipídica neutra 4, e é rápida, sem necessidade de equipamentos especializados ou placas. Deve sublinhar-se que com base em misturas padrão, SPE separa completamente TAGs de PLs, e é altamente reprodutível e fiável (ver Figura 5A). Enquanto quantificação e análise de ésteres metílicos de ácidos gordos requer um GC / MS, este equipamento é geralmente disponível, e se não for localmente, as amostras podemser gerados como acima e armazenado a -80 ° C sob atmosfera de azoto até a análise por um colaborador ou comercial GC / MS de serviço é providenciado. A saída GCMS contém dados de alta resolução em cada ácido gordo para cada espécie de lípidos. Isto permite a determinação das diferenças específicas entre as amostras comparadas. Como um exemplo, o investigador pode determinar se os níveis de certos ácidos gordos foram alteradas em abundância significativamente mais do que outros em daf-2, 3 ou lpd-FASN-1 RNAi versus o controlo vectorial. Esta ferramenta extremamente poderosa pode, portanto, fornecer informações detalhadas sobre quais as espécies de lipídios são alterados em abundância com qualquer manipulação experimental. Para nossa análise, na maioria das vezes normalizar massa TAG a massa PL. Enquanto a proteína ou ADN podem também ser usados ​​para normalizar massa lipídica após determinação de uma alíquota do sedimento sonicado verme, descobrimos que esses métodos são sujeitos a introduced erro humano durante todos os passos de pipetagem e de recuperação da amostra a partir de cada uma das extracções. É por esta razão que escolhemos ao invés de usar a massa PL como nosso fator de normalização. Padrões não naturais introduzidas no início do protocolo (tritridecanoin para TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) para PL) são transportados através de todos os passos de extracção de fase sólida e preparação FAME, e garantir a recuperação quantitativa e representante de ambos TAG e frações PL. A mesma garantia não pode ser feito se os investigadores usam proteínas ou DNA para normalizar massa TAG. Acreditamos ser a PL bitola mais robusta através da qual a comparação dos níveis de TAG através de amostras, tal como tem sido mostrado previamente que só é minuciosamente PL alteradas pelo mesmo estímulo efectuar deslocamentos de massa de grandes nos níveis de TAG, inanição prolongada ou aumentada, por exemplo de exercício 34 - 36. PL são pensados ​​para desempenhar um papel estrutural, assegurar a fluidez da membrana celular e integrity e papéis de sinalização e não como armazenamento de energia 37-39. Em nossas mãos, a relação TAG / PL mais se aproxima daquilo que é obtido por fixador baseada coloração lipídico com Nilo vermelho, e concorda com o encontrado por outros grupos 21. Uma estratégia alternativa é utilizada pelo laboratório de Watts, em que a percentagem de lípidos TAG é calculada contra lipídios totais 9,22,29. O uso de não nativas tipos de TAG e padrão PL assegura que nenhuma ácidos gordos nativos serão incluídos no cálculo de normalização. A escolha do comprimento de cadeia é puramente baseado na necessidade de estes padrões para não interferir com os espectros de massa dos ácidos gordos nativos. Encontraram-se que os ácidos gordos de 13:00 e 17:00 para servir melhor esta finalidade. É possível, tendo em conta as diferentes propriedades químicas dos ácidos gordos de cadeia mais curta, que os nossos padrões não naturais de ácido gordo não pode ser representativo de recuperação de todos os ácidos gordos de cadeia de comprimento ou cadeias com different índices de saturação. Assim, é possível que durante a SPE ou GCMS podemos ver as diferenças na eficiência de purificação ou detecção de lípidos entre diferentes comprimentos de cadeia. Com base neste e a ionização de ácidos gordos diferentes nas GCMS, não é possível fazer uma afirmação sobre a abundância absoluta de qualquer ácido gordo determinado. Portanto, nós só comparar entre amostras dentro de uma única experiência abundâncias de qualquer dado ácido graxo. Caso se queira absolutamente quantificar um ácido gordo, um modo isto pode ser conseguido seria executar uma amostra, preparada conforme acima fortificada com uma quantidade conhecida de uma forma estável isotopicamente marcado versão C 13 do referido ácido gordo ou similar, de modo que pudesse ser distinguidas com base na massa do ião progenitor no MSD, por exemplo. Tendo em conta que estamos apenas comparando as quantidades relativas de classes de lípidos ou qualquer ácido gordo, dada a TAG 13:00 e 17:00 normas PL servem este objectivo de forma adequada, com um mínimo de custos, aassegurar a recuperação adequada e representativa de cada classe de lipídios. Até este ponto, há uma falta de consenso quanto à interpretação de certos resultados obtidos por diferentes metodologias, e em que as metodologias predominantes deve ser. Em geral deve notar-se que nenhum método de isolamento é idealmente adequado para estudar o metabolismo da gordura em C. elegans. No entanto, através da utilização de rastreio múltiplo e modalidades de validação, pode-se alcançar a confiança em dados obtidos com genes reguladores de lípidos. Assim, pretendemos para o nosso protocolo para servir como uma referência para o trabalho futuro no campo da C. elegans pesquisa gordura.

Conservação de vias metabólicas entre seres humanos e Caenorhabditis elegans nematóides torna um organismo modelo poderosa para o estudo da obesidade. Enquanto C. elegans não tem adipócitos dedicados ao armazenamento de gordura, como em mamíferos, eles loja de triglicéridos em gotículas lipídicas 1 e possuem muitos dos mesmos reguladores de armazenamento de gordura eo uso de energia 2,3. Para ensaiar os níveis de gordura no C. elegans, vários métodos têm sido propostos com diferentes níveis de facilidade e sucesso. O uso comum de uma vez fluorescentes, corantes vitais 4-7 foi recentemente posta em causa, e estes reagentes mostrou-se manchando um compartimento separado a partir do depósito de armazenamento principal gordura de C. elegans 1,8-11. Fixador baseados não fluorescentes corantes, como o Sudão preto e óleo-vermelho-O, enquanto bem sucedido em destaque gotículas lipídicas no verme 12-14, não têm um leque tão grande dinâmica para a quantificação de fluorescênciacento corantes 8,13,15. Além disso, os actuais métodos de fixação para corantes fluorescentes ambos e não-fluorescente são demorados e envolvem múltiplos passos de congelamento e descongelamento e / ou o uso de produtos químicos tóxicos, 1,9,10. A utilização de análogos específicos de lípidos marcados com BODIPY tem sido relatado para realçar gotículas lipídicas quando administradas aos vermes vivos com curto prazo de rotulagem 15. No entanto, isto depende da absorção do corante, pelo que é enviesada por C. elegans manuseamento e metabolismo de BODIPY análogos de ácido gordo. Uma alternativa estabelecida para lípido de coloração-corantes é livre de etiqueta, espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) ou estimulada Raman (SRS) de microscopia, que tiram partido das propriedades características de vibração de moléculas lipídicas de visualizar as reservas de gordura 10,16, 17. No entanto, o equipamento especializado caro é necessário para este método, e taxa de transferência é baixa na melhor das hipóteses. Para atender a uma necessidade para aná, rápida escalávelsis de lojas de lipídios neutros em C. elegans pesquisa metabólica, apresentamos um romance, método altamente reprodutível de fixador baseada em coloração de lipídios Nilo vermelho. Propriedades espectrais e físico-químicas do corante lipofílico Nilo vermelho induzir uma mudança de amarelo-ouro-espectral no seu pico de emissão de excitação, permitindo que a fluorescência no espectro de emissão verde apenas quando em um ambiente rico em gordura, mas não em ambientes mais polares 18 de 19. Assim gotículas lipídicas pode ser detectado por coloração simples através da utilização de uma proteína fluorescente verde (GFP), do filtro de microscopia de fluorescência. A facilidade e acessibilidade desta técnica faz com que seja ideal para telas de alto rendimento. Nós também demonstrar uma emparelhado método rigoroso, para dosagem bioquímica de triglicerídeos e fosfolipídios utilizando a extração em fase sólida e cromatografia gasosa e espectrometria de massa. Medição de lípidos Biochemical correlaciona-se com vermelho do Nilo com base determinação microscópica de C. elegans fat em massa, e deve ser usada como uma confirmação dos resultados da determinação feitos com lípidos microscópica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 96-pin replicador </td><td> Nunc </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> Agar LB </td><td> EUA Biologicals </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas mecânicos </td><td> Biohit M Linha </td><td> M10, M100, M300 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetador eletrônico </td><td> Biohit Linha E </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P0662 </td><td> pH 6,0 esterilizada por autoclavagem </td></tr><tr><td> 1 M MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Esterilizados por Aut.oclaving </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> C2661 </td><td> Esterilizado em autoclave </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> Colesterol 5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> C8667 </td><td> Em etanol a 100% </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de carbenicilina </td><td> EUA Biologicals </td><td> C1100 </td><td> Esterilizado por filtração 0,2 μ </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> EUA Biologicals </td><td> I8500 </td><td> Esterilizado por filtração 0,2 μ </td></tr><tr><td> 100 mg / ml de ampicilina </td><td></td><td></td><td> Esterilizado por filtração 0,2 μ </td></tr><tr><td> 5 mg / ml de tetraciclina </td><td></td><td></td><td> Em etanol a 100% </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de 96 poços de CT </td><td> BD-Falcem </td><td> 353072 </td><td> Para 96 ​​poços RNAi </td></tr><tr><td> Placas retangulares A / T </td><td> Thermo Scientific </td><td> 242811 </td><td> Para carimbar RNAi </td></tr><tr><td> Mídia LB </td><td> EUA Biologicals </td><td> L1530 </td><td> Preparado de acordo com as instruções do fabricante </td></tr><tr><td> 96 poços poço profundo Blocos de Ensaio </td><td> Corning </td><td> Costar 3960 </td><td> Bloco retangular ensaio fundo em V- </td></tr><tr><td> De 96 cavidades rasas bloco de ensaio bem </td><td> Corning </td><td> Costar 3956 </td><td> Bloco de ensaio rodada fundo em V- </td></tr><tr><td> Filme de vedação estéril </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> Sealing Film alumínio </td><td> Corning </td><td> Costar 6570 </td><td> Thermowell fita de vedação para placas de 96 poços </td></tr><tr><td> M9 Tampão </td><td> Espero ver et al. 20 </td&gt; <td></td><td> Veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> Nilo vermelho </td><td> Invitrogen </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Pescador </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pin aspirador </td><td> VP Científico </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96 poços de Microscopia Teflon Slides Mascarados </td><td> Thermo Scientific </td><td> Personalizado </td><td> Pode também encomendar Trevigen de 96 poços Cometslide </td></tr><tr><td> 96 poços de Ouro-Seal Coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> Personalizado </td><td> Também pode usar segundo de 96 poços Cometslide </td></tr><tr><td> Deep-bem placa PCR </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> Não estéril película adesiva </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> Alto Throughput Microscópio </td><td> Leica </td><td> DM6000 totalmente automatizado com palco Antes de 96 poços </td><td> Com Chroma 49002 conjunto de filtros GFP e objetiva 2x </td></tr><tr><td> Sonicador de banho </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Pescador </td><td> Optima F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> Padrão Phospholipid </td><td> Lipídios Avanti Polar </td><td> 830456P </td><td> 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) </td></tr><tr><td> Padrão de triglicéridos </td><td> NuChek Prep </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol Pipetar 50 ul </td><td> Pescador </td><td> 21-176-3A </td><td> Drummond scientfic </td></tr><tr><td>Acetona </td><td> Sigma </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Pescador </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> Hexano </td><td> Pescador </td><td> Optima H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> Coluna de sílica SPE </td><td> Thermo Scientific </td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI, com 100 leitos de resina mg </td></tr><tr><td> Manifold Cromatografia em Fase Sólida </td><td> Sigma </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24 DL </td></tr><tr><td> Borosilicato Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-678-27F </td><td> 10 ml tamanho </td></tr><tr><td> Borosilicato Pasteur Pipetas </td><td> Pescador </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato tubos de cultura </td><td> Pescador </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> Rosca tubos de borossilicato </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8 ml de capacidade </td></tr><tr><td> Caps fenólicos para tubos de cultura </td><td> Pescador </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS Amostrador Automático Vials </td><td> Agilent </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> Tampas para frascos Autosampler </td><td> Agilent </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> Agilent </td><td> 6890 GC / MSD 5973 </td><td> Equipado com uma coluna Supelcowax-10 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nematode Growth Media (NGM): para 25 placas de 96 poços de RNAi, preparar 1 L de NGM: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Água deionizada </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> 17 g </td></tr><tr><td> Bacto peptona </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Ciclo líquido autoclave 121 ° C durante 40 min, com uma barra de agitação. Deixa-se arrefecer a 60 ° C agitando-se num conjunto de placa quente a 60 ° C. Em seguida, adicione o seguinte: </td></tr><tr><td> 1 M MgSO4 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 5 mg de colesterol / ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 (pH 6,0) </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl2 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de carbenicilina </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Distribuir o meio em placas de 96 poços de RNAi. Armazenar a 4 ° C até à utilização, até 2 semanas. </td></tr></tbody></table> Retangulares Ampicilina / Tetraciclina placas de ágar LB (A / T): para 20 placas A / T, preparar 1 L de mídia: <table border="1"><tbody><tr><td&gt; Reagente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Água deionizada </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> Agar LB (EUA Biologicals) </td><td> 32 g </td></tr><tr><td> NaOH 2 M </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> 2,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Ciclo líquido autoclave 121 ° C durante 40 min, com uma barra de agitação. Deixa-se arrefecer a 60 ° C agitando-se num conjunto de placa quente a 60 ° C. Em seguida, adicione o seguinte: </td></tr><tr><td> Tetraciclina </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml de ampicilina </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pipetar 45 ml em cada placa. Armazenar no escuro a 4 ° C até à sua utilização, até 4 semanas. </td></tr></tbody></table> Meio LB crescimento bacteriano: para 4 L, suficiente para crescer e ressuspender 25 blocos de 96 poços Mix 62 g de pó LB (biológica EUAals), 4 L de água destilada e 4,8 ml de NaOH 2 M. Autoclavar em 1 L ou 0,5 L alíquotas, ciclo líquido, 40 min. Podem ser armazenadas até 1 ano, em frascos hermeticamente fechados, à temperatura ambiente. Descarte se nublado. 100 mg / ml de ampicilina Diluir 5 g de ampicilina em pó e água desionizada até um volume total de 50 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar em aliquotas de 1 mL e congelar a -20 ° C até utilização. 5 mg / ml de tetraciclina Adicionar 1,25 g de pó de tetraciclina e 250 ml de etanol a 100%. Misture bem até estar completamente dissolvido e armazenar a -20 ° C em um recipiente à prova de luz. 200 mg / ml de carbenicilina Misturar 10 g de pó de carbenicilina e água desionizada até um volume total de 50 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar em aliquotas de 1 mL e congelar a -20 ° C até utilização. 5 mg / mlColesterol Adicionar 1,25 g de colesterol e 250 ml de etanol a 100%. Misturar bem e armazenar a 4 ° C durante até 6 meses. 1 M MgSO4 Dissolver 120,37 g MgSO4 em 800 ml de água desionizada. Levar o volume final para 1 L. Autoclave ciclo de líquido 40 minutos e armazenar à temperatura ambiente. 1 M de CaCl2 Dissolver 110,98 g de CaCl2 em 800 ml de água desionizada. Levar o volume final para 1 L. Autoclave ciclo de líquido 40 minutos e armazenar à temperatura ambiente. 1 M KH 2 PO 4, pH 6,0 Dissolver 136,09 g KH 2 PO 4 em 800 ml de água desionizada. pH para 6,0 e perfazer o volume final para 1 L. Autoclave ciclo líquido 40 min e armazenar a temperatura ambiente. M9 Buffer: para uma L-rou quetinely fazer 8-10 lotes L Dissolveu-se 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 em 900 ml. Levar o volume final para 1 L. Alíquota em 100-500 ml garrafas e autoclave 40 min no ciclo líquido e armazenar à temperatura ambiente. 10 N NaOH Dissolver 400 g de NaOH em 800 ml de água desionizada, deixar arrefecer e levar a um volume final de 1 L. loja em tubos de 50 ml à temperatura ambiente. 1 M IPTG Adicionar IPTG 23,81 g de água desionizada e perfazer o volume total de 100 ml. Filtrar esterilizar 0,2 μ, dispensar em aliquotas de 1 mL e congelar a -20 ° C até utilização. Preparação da solução de ovo Bleach / NaOH: 20 ml suficiente para uma preparação de ovos Adicionar 4 ml de lixívia, 1 ml de NaOH 10 N, 5 ml de H 2 O, e 10 mlTampão M9 para um tubo de polipropileno de 50 ml. Fazer imediatamente antes da utilização. Nilo solução de vermelho Adicionar 50 ml de acetona 100% a 25 mg de pó vermelho do Nilo. Misture bem e guarde em temperatura ambiente em recipiente à prova de luz parafilmed. Pode ser armazenado durante meses desta maneira. Nilo solução de coloração vermelho: para 500 ml, suficientes para a coloração de 30 x placas de 96 poços Adicionar 3 ml de solução de vermelho do Nilo de 500 ml de 40% v / v de isopropanol. Guarde-o em temperatura ambiente em embrulhado em papel alumínio garrafa de vidro. Preparar imediatamente antes da utilização. Padrão Phospholipid Pesar 7,6 mg de fosfolípido padrão, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol), num copo de vidro. Dissolver em 20 ml de 02:01 clorofórmio: metanol (25 nanomoles por 50 ul). Manter coberto com folha de alumínio até à sua utilização.Padrão também pode ser mantida a -80 ° C em um frasco de vidro com tampa hermética fenólico por 1 ano. Padrão de triglicéridos Pesar 6,8 mg de padrão de triglicéridos, tritridecanoin, para um copo de vidro. Dissolver em 30 ml 02:01 clorofórmio: metanol (16,7 nanomoles por 50 ul). Manter coberto com folha de alumínio até à sua utilização. Padrão também pode ser mantida a -80 ° C em um frasco de vidro com tampa hermética fenólico por 1 ano. </td></tr></tbody></table>

bioquímica e alto rendimento avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

O nemátodo C. elegans emergiu como um importante modelo para o estudo de vias conservadas genéticos que regulam o metabolismo da gordura, uma vez que se relaciona com a obesidade humana e suas patologias associadas. Várias metodologias anteriores desenvolvidos para a visualização de C. elegans ricas em triglicérides depósitos de gordura têm provado ser errada, destacando compartimentos celulares diferentes gotículas lipídicas. Outros métodos exigem equipamentos especializados, são demorados, ou produzir resultados inconsistentes. Nós introduzimos uma rápida, reprodutível, fixador baseada Nilo método de coloração vermelho para a detecção precisa e rápida de gotículas lipídicas neutras em C. elegans. A etapa de fixação curto em isopropanol a 40% faz com que os animais completamente permeáveis ​​ao vermelho do Nilo, que é então utilizado para corar animais. Propriedades espectrais deste corante lipofílico permitir que fluorescem fortemente e selectivamente no espectro verde-amarela apenas quando em um ambiente rico em gordura, mas não em maisambientes polares. Assim, as gotículas de lípidos podem ser visualizadas num microscópio de fluorescência equipado com a capacidade de imagem simples GFP após apenas um passo breve Nilo coloração vermelha em isopropanol. A velocidade, acessibilidade e reprodutibilidade deste protocolo o tornam ideal para telas de alto rendimento. Também demonstramos um método combinado para a determinação bioquímica de triglicéridos e fosfolípidos, utilizando cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa. Este protocolo mais rigoroso deve ser usada como a confirmação dos resultados obtidos a partir da determinação de lípidos Nilo vermelho microscópica. Prevemos que essas técnicas vão se tornando novos padrões no campo da C. elegans pesquisa metabólica.

Um exemplo de uma placa com imagens que foi tomada através do fluxo de trabalho de coloração de gordura é mostrado na Figura 1. Controles específicos para gordura (daf-2 receptor de insulina RNAi), baixo teor de gordura (LPD-3 proteína necessária para os grânulos de armazenamento de lipídios no intestino RNAi), gordura pequenos e de baixo (FASN-1 ácido graxo sintase RNAi), e do vetor vazio ( controlo) mostra as variações na intensidade de fluorescência de acordo com os níveis de gordura dos animais, e os valores correspondentes de lípidos determinada por análise GC / MS (Figura 2). Note-se que inativações genes que conduzem a developmentally preso, pequenos animais, muitas vezes, parecem ter gordura muito menor do que os animais de controlo do adulto, independentemente de qualquer ligação com o metabolismo da gordura (Figura 3). Análises secundárias, incluindo a análise de coloração e bioquímica lipídica com SPE-GCMS de animais selvagens de controle de um estágio similar de desenvolvimento deve ser feito para garantir a validade dospequena ou developmentally preso sucessos positivos. No caso de FASN-1 RNAi (Figura 2), os animais de captura quer no L2 ou L3 fase larval, e têm coloração de gordura mais baixo do que o controlo RNAi adulto, mas semelhante em abundância a animais fase L2-L3 (percentagem de controlo de RNAi mancha de gordura adulto de controle RNAi: 49,9 ± 4,5% para FASN-1 RNAi e 20,2 ± 2,1% para L2 controle RNAi, e 64,7 ± 1,3 para L3 controle RNAi). Como alternativa, a análise bioquímica indicou uma menor TAG / PL relação de estágio L2 combinado animais controle N2 (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 para FASN-1 RNAi e 46,1 ± 3,4 para o estágio de controle pareados RNAi, P ≤ 0,05). Assim, neste caso, pode ser confirmada por análises bioquímicas que FASN-1 tem um papel importante na armazenagem de lípidos, em vez de apenas uma fase de redução específica da massa gorda. A análise de acompanhamento de vermes imaged depende fortemente de uma plataforma computacional, como Profiler usando celularo WormToolbox 30. Para um número menor de imagens, uma plataforma de análise de imagem à disposição do público, tais como ImageJ, livremente disponível a partir do NIH, pode ser usado. Para nossa análise, os scripts originais Matlab foram usados ​​primeiro a identificar o bem, e, posteriormente, para excluir poços vazios ou com bolhas, e distinguir pequenos detritos de vermes. Controle de qualidade manual era necessário para imagens sinalizadas para exclusão pelas razões mencionadas acima. Descobrimos empiricamente que a intensidade do percentil 90 do sem-fim através de pixels de um poço, normalizado para a área através de um sem-fim bem, desde que consistente métrica de intensidade de coloração em todos os estádios de desenvolvimento verme (Figura 3). Integrando a massa total de gordura sobre a área do sem-fim, pelo contrário, teria tendência para marcar pequenos vermes brilhantes equivalentemente, com grandes vermes dim. Porque o nosso método não integra o sinal fluorescente total sobre a zona do sem-fim, tendo em um percentil intensidade, as mudanças no tamanho do sem-fim, por si só não fazemt viés a intensidade medida. Em vez disso, as diferenças na distribuição de intensidade de pixel são medidos. No entanto, apesar disto, grandes diferenças são observadas em manchas distribuição de intensidade de pixel entre animais de diferentes fases de desenvolvimento, de modo que é importante para o estudo do efeito de RNAi para qualquer gene de encontro aos animais de uma fase de desenvolvimento similar (Figura 3). Variabilidade média entre réplicas é mostrado na Figura 4, indicando elevada reprodutibilidade do método de coloração de gordura. Note-se que a força do método é altamente dependente da obtenção de imagens de qualidade para cada uma das placas, em condições de iluminação uniforme, utilizando tempos de exposição idênticos, e com o mínimo de bolhas, detritos, ou de cruzamento de vermes em outros poços. SPE foi realizada no pré-misturado, purificado padrões para determinar o grau em que pode ser separada TAGs de PLs (Figura 5A). Nesta análise, conseguimos uma s 100%eparation de TAG e PL, indicada como uma completa ausência de 17:00 ácidos gordos derivados a partir de PL na amostra TAG e uma ausência completa de 13:00 que corresponde ácidos gordos derivados de TAG na amostra PL (Figura 5A). Assim SPE é altamente eficiente na hora de separar as classes de lipídios. Esta análise não indica que todos os TAGs de diferentes comprimentos de cadeia será purificado equivalentemente pela SPE e detectados por GCMS com eficiência semelhante. Ele só assegura que TAG e lípidos PL no total estão completamente separados um do outro. Uma amostra de rastreio de GC-MS de animais de tipo selvagem N2 tomadas através de extracção em fase sólida e preparação FAME é mostrado na Figura 5B. Para ambos TAG e PL, os picos podem ser identificados com base no tempo de retenção e iões-mãe e sua filha no espectro de massa, e a área total sob os picos identificados normalizada para a área dos respectivos padrões internos. Para determinar a quantidade normalizada de TAG, a áreasob todos os picos do cromatograma de TAG, excepto o padrão 13:00, foram adicionados em conjunto e dividida pela área sob o pico de 13:00. Do mesmo modo, para determinar a quantidade normalizada PL total, a área sob todos os picos, excepto o padrão 17:0, foram adicionados em conjunto e dividida pela área sob o pico de 17:00. Os valores normalizados para o TAG e PL amostras são então utilizadas para calcular a relação de TAG / PL final para a amostra: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="Equação 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> Deve notar-se que os dados de SPE-GCMS permitir uma análise mais sofisticada de ácidos gordos presentes em cada fracção de lípidos do que o cálculo simples do TAG total à relação PL. Por exemplo, o investigador pode integrar um único pico correspondendo a um único ácido gordo e comparar a sua abundância normalizada entre amostras (por exemplo, cOMPARAÇÃO em N2 de tipo selvagem contra daf-2 RNAi a área integrada do pico de 18:00 dividido pelo pico 13:00 standard, normalizada para a massa total dividido pelo PL PL 17:00 a área do pico padrão): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="Equação 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> No caso de o investigador escolher, também seria possível determinar a percentagem de qualquer ácido gordo determinado no TAG ou fracções de PL, como uma percentagem da quantidade total de ácido gordo quantificado (como um exemplo de 18:00 na fracção TAG em N2 vermes ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="Equação 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = &quot;Figura 1&quot; fo: conteúdo largura = &quot;3.25in&quot; fo: src = &quot;files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg /&quot; /&gt; Figura 1. Fluxo típico para a experiência geral. Dia 1, as placas congeladas de RNAi de biblioteca são estampadas em Amp / Tet placas de agar LB e incubadas a 37 ° C. Dia 2, Amp / Tet placas são utilizados para culturas de sementes líquidos de RNAi clones em blocos bem profundas. Dia 3, as bactérias são concentradas por centrifugação e transferidas para placas de 96 poços de RNAi. Dia 4, L1 hatchling C. elegans são adicionados a placas de RNAi em líquido e deixa-se secar. Dia 7, os animais são recolhidos no estado líquido, corados com vermelho do Nilo em isopropanol a 40%, montadas em lâminas de 96 cavidades de Teflon e fotografadas com um microscópio de elevado rendimento. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> Figura 2. Fixador baseados nilo manchas vermelhas grandes <em&gt; C. lojas elegans gordura. campo brilhante Representante e imagens de fluorescência da GFP são mostrados de N2 vermes alimentados com FASN-1 (gordura, pequena baixa), lpd-3 (baixo teor de gordura), controle (vetor vazio), ou daf-2 (gordura) RNAi clones. As amostras foram processadas de acordo com o protocolo (esquemático na Figura 1). Animais fixados, corados em vermelho Nilo, eo resultado com imagens em níveis de lipídios comparáveis ​​como obtido medição lipídico bioquímico. Isopropanol-nilo fixos níveis de vermelho de fluorescência, adquiridas a partir de, pelo menos, seis repetições biológica, são apresentados na primeira linha. Os níveis de triglicérides quantitativos, reflexo do total das lojas de lipídios neutros quando normalizado para os níveis de fosfolipídios globais (TAG / PL), extraídos de quatro biológica repetições, são mostrados na segunda linha. É importante notar que a quantificação absoluta obtida a partir de fixador coloração vermelha do Nilo e determinação de lípidos bioquímico geralmente não combinam perfeitamente. Neste exemplo, embora qualitativamentesemelhante, FASN-1 (RNAi) tem massa de triglicérides mais diferentes versus controle por métodos bioquímicos do que o indicado por microscopia, lpd-3 é comparativamente diferente, e daf-2 (RNAi) é menos diferente, apesar de todas as diferenças são estatisticamente significativos e as medições foram altamente reprodutíveis. Os dados apresentados são a média ± SEM (*, P ≤ 0,01; **, P ≤ 0,0001 a relação de controlo, determinada por não emparelhado, bicaudal teste T, assumindo variância igual). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Massa gorda determinada por coloração com vermelho do Nilo de fixação, em diferentes estádios de desenvolvimento. Os animais foram criados em OP50 bactérias e recolhido no L1, L2, L3, L4 e adultos grávidos estágios de desenvolvimento. As imagens foram capturadas após coloração fixação e analisados ​​usando um script personalizado Matlab para determinar o 90 º percentil of intensidade de pixel ao longo da área de verme identificado. Note-se que os níveis de lípidos de animais como aumentar grandemente o animal desenvolve a partir de fase L2 e L4, e depois diminuir ligeiramente à medida que o animal começa a desviar calorias para a proliferação da linha germinativa na fase adulta. Os dados apresentados são a média ± SEM de 6-8 repetições (**, P ≤ 0,0001 a relação adulto gravídico, determinado por não emparelhado, bicaudal teste-T). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Alta reprodutibilidade através independente biológica repetições. Mostrado é um gráfico de dispersão de intensidades Nilo fluorescência vermelha em todo biológica repetições (n = 6-8). Para cada réplica, todos os valores são normalizados para a intensidade média dos controlos vector vazio. Os dados apresentados são a média ± SEM (**, P ≤ 0,0001 a relação de controlo, determinada por não emparelhado, bicaudal teste t assumindovariância igual). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> Figura 5. GC-MS cromatogramas da SPE separados normas e TAG tipo selvagem e abundância PL. (A) GC-MS traços são mostrados da separação SPE da TAG e padrões PL. Note-se a ausência total de ácido gordo no rastreamento 13:00 PL e a ausência do correspondente ácido gordo 17:00 no rastreamento TAG, indicando uma separação completa de TAG (tritridecanoin) a partir de PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero -3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol)). (B) Um representante de espectro completo de TAG e PL de uma amostra de N2 tipo selvagem animais alimentados com controle vetorial RNAi (HT115 bactérias com L4440 vazio vetor RNAi). Um microlitro de amostra foi injetado em uma 6890/5973N Agilent GCMS de acordo com o protocolo, e picos individuais foram identificados por retention tempo e os seus espectros de massa respectiva. Abreviaturas: ciclo de ácido ciclopropano, gordos; iso: iso-metil. Ácido graxo de cadeia ramificada; GLA, ácido gama-linolênico, ALA, o ácido alfa-linolênico, DGLA, dihomo ácido gama-linolênico, EPA, ácido eicosapentaenóico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Nós apresentamos robustos métodos bioquímicos e microscópicos para estudar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Lojas lipídicas. Um rápido, simples, processo que fixa-coloração para imagiologia fluorescente lipídico gotícula utiliza as propriedades espectrais do corante lipofílico Nilo vermelho. Em seguida, apresentamos dosagens bioquímicas de triglicerídeos e fosfolipídios utilizando a extração em fase sólida e cromatografia gasosa e espectrometria de massa.

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The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

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Biologia

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