Optogenética ativação de neurônios Zebrafish somatossensoriais usando chef-tdTomato

O objetivo geral deste procedimento é ativar neurônios somatossensoriais únicos em larvas de peixe-zebra. Isso é feito primeiro preparando um cabo óptico e conectando-o ao laser azul ADPS. O segundo passo é injetar o transgene em um a dois embriões em estágio celular.

Em seguida, rastreie embriões gordos que expressam tomate C-H-E-F-T-D em neurônios somatossensoriais e monte-os inus. A etapa final é fornecer um pulso curto de luz azul para ativação de um único neurônio e registrar o comportamento resultante. A principal vantagem dessa técnica dos métodos existentes usando a opção dois da raiz do canal é que essa abordagem pode ser usada para obter respostas comportamentais de neurônios únicos ativados até pelo menos quatro dias após a hospitalização.

Embora este método esteja sendo usado para fornecer informações sobre a função de neurônios somatossensoriais específicos em larvas de peixe-zebra. Essa abordagem também pode ser adaptada para estudar comportamentos provocados por qualquer população neuronal de peixe-zebra, como neurônios internos ou neurônios motores. Essa abordagem genética pode ser usada para ativar neurônios específicos in vivo, caracterizar o desenvolvimento funcional, avaliar os efeitos de mutações ou bloqueio fenomenológico de proteínas específicas no comportamento e mapear redes neuronais a jusante que levam a respostas comportamentais distintas.

Para iniciar este procedimento, crie uma unidade de armazenamento para o cabo óptico derretendo o gargalo cônico de um vidro. Pipeta de macarrão sobre um pão e queimador para fazer um ângulo de 150 graus. Em seguida, usando um alicate ou lâmina de barbear, corte cuidadosamente o cabo óptico em dois pedaços.

Cada peça deve ter uma extremidade exposta e uma extremidade com um adaptador de PC FC. Em seguida, descasque o cabo óptico até o revestimento, removendo a capa de fibra, reforçando as fibras e revestindo a partir de 5,0 centímetros da extremidade cortada do cabo. Em seguida, insira o cabo óptico na pipeta de macarrão preparada.

Certifique-se de que o cabo possa entrar e sair facilmente da ponta da pipeta usando um cortador de vidro diamantado ou uma pinça de ponta fina. Corte a fibra de vidro e quebre a extremidade para criar um corte limpo na extremidade da fibra. Em seguida, retraia o cabo óptico na pipeta de macarrão.

Em seguida, posicione o cabo óptico na pipeta de macarrão usando um micromanipulador sob o microscópio CUBRA manualmente 24 a 48 embriões HPF usando uma pinça em seguida, anestesiar as larvas usando 0,02% trica usando um microscópio de dissecação fluorescente. Identifique as larvas com expressão do neurônio Ron Beard ou do neurônio trigêmeo Embriões com expressão esparsa em células facilmente identificáveis são ideais, mas os neurônios individuais serão direcionados para ativação com um cabo de fibra óptica, portanto, uma ampla faixa de densidade de expressão é aceitável. Transfira as larvas para um novo prato com água fresca de embrião azul PTU.

Armazene os embriões a 28,5 graus Celsius no escuro até o estágio experimental desejado. Nesta seção, faça 1,5% de baixa maltase e água bidestilada e armazene em um bloco de calor de 42 graus Celsius para evitar que solidifique. Usando uma pipeta de macarrão de vidro, transfira uma das larvas pré-peneiradas para um tubo de agarose de baixo derretimento a 1,5% com o mínimo possível de água de embrião azul.

Em seguida, transfira a larva em uma gota de agarose para uma pequena placa de Petri. Sob um microscópio de dissecação, posicione o lado dorsal da lava para cima quando o aros estiver solidificado. Use uma lâmina de barbear fina para cortar aros de ambos os lados da lava.

Encha a área ao redor do aros com água azul embrionária. Em seguida, faça dois cortes diagonais em ambos os lados da gema, tomando cuidado para não cortar a lava. Depois, puxe o agrow para longe do tronco e da cauda da lava.

Agora monte a câmera de alta velocidade na luneta de dissecação e conecte a câmera ao computador. Em seguida, ligue o computador e a câmera de alta velocidade. Abra o software de imagem de vídeo e ajuste as configurações da câmera.

Em seguida, conecte o cabo óptico, o laser e o estimulador. Em seguida, ligue o estimulador e ajuste-o para um máximo de cinco volts e a duração do pulso de cinco milissegundos. Em seguida, ligue o laser.

Em seguida, use o microscópio de dissecação fluorescente para posicionar a ponta do cabo óptico perto de um corpo celular de neurônio com expressão de tomate C-H-E-F-T-D. Forneça um pulso de luz azul para ativar o neurônio sensorial. Em seguida, registre as respostas usando uma câmera de alta velocidade.

Defina em 500 ou 1000 quadros por segundo e repita o experimento com pelo menos um minuto entre as ativações para evitar a habituação, para liberar a parte anterior da lava, o Aris com fórceps, e tome cuidado para não inre o animal. Em seguida, transfira-o para água fresca de embrião azul. Os animais podem se desenvolver ainda mais e o procedimento pode ser repetido em estágios mais antigos.

O embrião também pode ser remontado para imagens confocais de alta resolução da célula ativada, a fim de correlacionar o comportamento com a estrutura celular. A lava do peixe-zebra diagramada aqui é parcialmente montada em 1,5% de baixo malte Aris representado pelas linhas tracejadas ao redor de sua porção rostral. Um neurônio trigêmeo e um neurônio da barba de Rohan são representados em células vermelhas da boca são delineadas pelas linhas tracejadas na ilustração.

Aqui está um filme mostrando que a ativação de um único neurônio da barba de Rohan expressando tomate C-H-E-F-T-D em uma lava de aproximadamente 35 HPF provoca uma resposta comportamental. Este filme mostra a ativação do tomate C-H-E-F-T-D expressando neurônios da barba de Rohan em uma lava de 60 HPF, e este filme mostra a ativação dos neurônios da barba de Rohan da expressão do tomate C-H-E-F-T-D em uma lava de quatro DPF Uma vez dominada. Essa abordagem gênica pode ser realizada em menos de uma hora.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ativar neurônios individuais e larvas de peixes de Libra em vários momentos. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso e as devidas precauções de segurança devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.