Uma Introdução à Centrifugadora

A centrífuga é um instrumento utilizado em praticamente todos os laboratórios de pesquisa biomédica do mundo.

A centrifugação é um processo pelo qual se utiliza uma centrífuga para separar componentes de uma mistura complexa.

Ao girar amostras laboratoriais em velocidades muito altas, os componentes de uma determinada mistura são submetidos à força centrífuga, o que faz com que partículas mais densas migrem para longe do eixo de rotação e as mais leves se desloquem em direção a ele. Essas partículas podem se sedimentar no fundo do tubo, formando o que é conhecido como um pellet, e esse espécime isolado, ou a solução remanescente, chamada sobrenadante, pode ser posteriormente processado ou analisado.

O componente principal de uma centrífuga é o rotor, que é a parte móvel que gira em altas velocidades.

Os rotores podem ser fixos em posição, ou uma centrífuga pode usar múltiplos rotores fixados sobre uma parte chamada eixo.

Normalmente, o rotor da centrífuga terá uma tampa que é firmemente parafusada para impedir que as amostras saiam voando.

Muitas centrífugas possuem uma unidade de refrigeração que permite controlar a temperatura interna durante a centrifugação.

Elas também possuem botões ou controles para inserir os parâmetros de cada corrida, que podem incluir a duração da centrifugação, a temperatura e a intensidade da rotação em termos de velocidade ou força relativa.

A velocidade de rotação é medida em RPM, ou rotações por minuto. O RPM é um valor enganoso, porque não é a velocidade da centrífuga que faz as partículas se separarem da mistura, mas sim a força que atua sobre essas partículas.

A força que atua sobre uma partícula está relacionada ao raio do rotor da centrífuga, e como centrífugas diferentes possuem rotores de tamanhos distintos, forças diferentes podem ser aplicadas na mesma velocidade, ou RPM.

A intensidade da centrifugação também pode ser quantificada como força centrífuga relativa, ou RCF. O RCF é geralmente apresentado como um múltiplo da aceleração gravitacional da Terra.

O RCF é expresso como o produto do raio do rotor e do quadrado da velocidade angular, dividido pela aceleração gravitacional da Terra.

O RCF pode ser relacionado ao RPM pela seguinte equação, onde r representa o raio da centrífuga medido em centímetros.

O uso dessa equação pode significar a diferença entre um experimento fracassado ou bem-sucedido, mas você não precisa aplicar esse cálculo em todo novo procedimento. As centrífugas geralmente vêm acompanhadas de nomogramas que facilitam bastante a conversão de RCF para RPM. Use uma régua para conectar o raio da centrífuga a um determinado valor de RPM, a fim de obter o RCF.

Para começar a centrifugar suas amostras, considere a temperatura. Se você estiver usando uma centrífuga refrigerada, será necessário que a temperatura interna do equipamento atinja o valor desejado antes de iniciar a centrifugação, ou então você pode encontrar outras formas de resfriar o rotor.

Imediatamente antes da centrifugação, certifique-se de que todas as tampas dos seus tubos estejam bem fechadas e seguras.

Ao carregar seus tubos, garanta que cada amostra seja contrabalançada por outra amostra diretamente oposta a ela.

Se você tiver apenas um tubo, prepare outro tubo que possa funcionar como contrapeso.

Se você tiver três tubos, pode organizá-los em um triângulo de modo que fiquem igualmente espaçados entre si.

O balanceamento de pesos em uma centrífuga é essencial. Os rotores de centrífuga atingem altas velocidades e possuem muita energia cinética. Se forem mal balanceados, todo o conjunto da centrífuga pode ser lançado de sua posição e causar danos sérios.

Depois de confirmar que o rotor e a tampa estão seguros, inicie a centrífuga e permaneça por perto até que ela atinja a velocidade desejada. Se notar algum problema, chame um membro experiente do laboratório para ajudá-lo.

Quando a centrifugação estiver concluída, você deverá ser capaz de ver seu espécime biológico no fundo do tubo, na forma de um pellet, que se separou do restante da solução, ou sobrenadante.

O sobrenadante pode ser removido por decantação – um termo elegante para derramar – ou pode ser aspirado – um termo sofisticado para usar sucção na remoção.

O espécime purificado pode então ser retornado a uma solução por meio de um processo chamado ressuspendimento. Repetições de centrifugação, ou centrifugação de células, seguidas pela aspiração das células e ressuspendimento em tampão, são frequentemente denominadas lavagem de células.

Agora que você viu alguns conceitos básicos de centrifugação, é hora de conhecer alguns dos tipos de centrífugas disponíveis e os procedimentos que você pode realizar com elas.

As centrífugas com rotor de ângulo fixo são provavelmente o tipo mais comum desse instrumento que você encontrará no laboratório. Muitas centrífugas de bancada se enquadram nesta categoria.

Essas centrífugas, nas quais os tubos permanecem em posição fixa e inclinada, são usadas em protocolos de centrifugação diferencial. Nestes protocolos, uma série de centrifugações em diferentes velocidades pode ser utilizada para purificar espécimes biológicos, como células de animais. Normalmente, esses protocolos envolvem várias etapas de lavagem celular.

Em contraste com os rotores de ângulo fixo, os rotores de balanço possuem suportes de tubos flexíveis que permitem que as amostras girem para fora. Esses rotores são vantajosos em aplicações como a centrifugação em gradiente de densidade, na qual amostras biológicas migram para camadas distintas do meio em gradiente. Esse tipo de centrifugação é útil para isolar rapidamente um tipo celular de outro, ou para isolar organelas individuais.

Por fim, a ultracentrífuga é a versão mais potente de todas as centrífugas que você encontrará no laboratório. Ela pode girar a mais de 70.000 rpm, o que a torna adequada para o isolamento de partículas pequenas, como DNA ou vírus.

Devido às altas velocidades dessa centrífuga, é necessário ter cuidado extra para garantir que as cargas estejam adequadamente balanceadas e que tanto o rotor quanto a tampa estejam firmemente fixos.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE sobre centrifugação. Neste vídeo, revisamos: o que é uma centrífuga e como ela funciona, como operar e utilizar uma centrífuga, algumas precauções de segurança e diferentes aplicações da sua centrifugação. Obrigado por assistir e lembre-se de balancear seus tubos.