1.1: Uma introdução à centrífuga

A centrífuga é um instrumento usado em quase todos os laboratórios de pesquisa biomédica em todo o mundo.

A centrifugação é um processo pelo qual uma centrífuga é usada para separar componentes de uma mistura complexa.

Ao girar amostras de laboratório em velocidades muito altas, os componentes de uma determinada mistura são submetidos à força centrífuga, que faz com que partículas mais densas migrem para longe do eixo de rotação e as mais leves se movam em direção a ele. Essas partículas podem sedimentar no fundo do tubo no que é conhecido como pellet, e essa amostra isolada, ou a solução restante, o sobrenadante, pode ser processada ou analisada posteriormente.

O principal componente de uma centrífuga é o rotor, que é a parte móvel que gira em altas velocidades.

Os rotores podem ser fixados na posição ou uma centrífuga pode usar vários rotores fixados no topo da parte chamada fuso.

Normalmente, o rotor da centrífuga terá uma tampa bem aparafusada para evitar que as amostras voem.

Muitas centrífugas terão uma unidade de refrigeração que permite que a temperatura interna seja controlada durante a centrifugação.

Eles também têm botões ou botões para inserir os parâmetros para cada corrida, que podem incluir a duração do giro, a temperatura e a magnitude do giro em termos de velocidade ou força relativa.

A velocidade de rotação é medida como RPM ou rotações por minuto. RPM é um valor complicado, porque não é a velocidade da centrífuga que faz com que as partículas se separem de uma mistura, mas a força que atua sobre essas partículas.

A força que atua sobre uma partícula está relacionada ao raio do rotor da centrífuga e, como diferentes centrífugas têm diferentes tamanhos de rotor, diferentes forças podem ser aplicadas na mesma velocidade ou RPM.

A força de centrifugação também pode ser quantificada como força centrífuga relativa, ou RCF. RCF é geralmente apresentado como um múltiplo da aceleração gravitacional da Terra.

RCF é expresso como o produto do raio do rotor e o quadrado da velocidade angular dividido pela aceleração gravitacional da Terra.

O RCF pode ser relacionado ao RPM pela seguinte equação, onde são representados pelo raio da centrífuga medido em centímetros.

Usar essa equação pode significar a diferença entre um experimento fracassado ou bem-sucedido, mas você não precisa aplicar esse cálculo para cada novo procedimento. As centrífugas geralmente vêm com nomogramas que podem ajudar a converter RCF em RPM com bastante facilidade. Use uma régua para conectar o raio da centrífuga e um determinado valor de RPM, a fim de obter RCF.

Para começar a girar suas amostras, considere a temperatura. Se você estiver usando uma centrífuga refrigerada, desejará que a temperatura interna da máquina atinja o valor desejado antes de iniciar a centrifugação ou poderá encontrar outras maneiras de resfriar o rotor.

Imediatamente antes de uma centrifugação, certifique-se de que todas as tampas dos tubos estejam apertadas e seguras.

Ao carregar seus tubos, certifique-se de que cada amostra seja contrabalançada com outra amostra diretamente em frente a ela.

Se você tiver apenas um tubo, faça outro tubo que possa atuar como contrapeso.

Se você tiver três tubos, poderá organizá-los em um triângulo para que fiquem equidistantes um do outro.

Equilibrar pesos em uma centrífuga é fundamental. Os rotores de centrífuga atingem altas velocidades e têm muita energia cinética. Se estiver mal balanceada, toda a unidade centrífuga pode ser impulsionada de seu local de descanso e causar sérios danos.

Depois de confirmar que o rotor e a tampa estão seguros, ligue a centrífuga e espere até atingir a velocidade desejada. Se você notar um problema, ligue para um membro experiente do laboratório para ajudá-lo.

Quando sua centrifugação estiver concluída, você poderá ver sua amostra biológica no fundo do tubo em um pellet, que se separou do resto da solução, ou sobrenadante.

O sobrenadante pode ser removido decantando-o - um nome chique para despejá-lo, ou pode ser aspirado - um termo chique para usar sucção para removê-lo.

A amostra purificada pode então ser devolvida a uma solução por meio de um processo chamado ressuspensão. Repetições de centrifugação ou fiação de células, seguidas de células aspiradas e ressuspensão em tampão, são frequentemente chamadas de células de lavagem.

Agora que você viu alguns conceitos básicos de centrifugação, é hora de dar uma olhada em alguns dos tipos de centrífugas existentes e os procedimentos que você pode realizar com elas.

As centrífugas de rotor de ângulo fixo são provavelmente o tipo mais comum deste instrumento que você encontrará no laboratório. Muitas centrífugas de mesa se encaixam nesta categoria.

Essas centrífugas, nas quais os tubos ficam em posição fixa e angular, são usadas em protocolos de centrifugação diferencial. Nesses protocolos, uma série de centrifugações em diferentes velocidades pode ser usada para purificar espécimes biológicos como células animais. Normalmente, esses protocolos envolvem várias etapas de lavagem de células.

Em contraste com os rotores de ângulo fixo, os rotores de giro têm suportes de tubos flexíveis que permitem que as amostras girem para fora. Esses rotores são benéficos em aplicações como centrifugação de gradiente de densidade, onde amostras biológicas migram para camadas distintas de meios de gradiente. Este tipo de centrifugação é útil para isolar rapidamente um tipo de célula de outro ou para isolar organelas individuais.

Por fim, a ultracentrífuga é o irmão mais velho de todas as centrífugas que você encontrará no laboratório. Ele pode girar mais de 70.000 rpm, o que o torna adequado para o isolamento de pequenas partículas, como DNA ou vírus.

Devido às altas velocidades desta centrífuga, deve-se tomar cuidado extra para garantir que as cargas estejam devidamente equilibradas e que o rotor e a tampa estejam seguros.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à Centrifugação. Neste vídeo, revisamos: o que é uma centrífuga e como ela funciona, como operar e operar uma centrífuga, algumas precauções de segurança e diferentes aplicações de sua centrifugação. Obrigado por assistir e lembre-se de equilibrar seus tubos.