Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

O objetivo geral deste procedimento é isolar os adipócitos primários e induzir sua diferenciação em cultura em células bege ou brilhantes. O primeiro passo é dissecar o tecido adiposo de camundongos. Em seguida, o tecido é digerido com colagenase.

Uma vez que a fração vascular do estroma é isolada, as células são plaqueadas. A etapa final é induzir a diferenciação das células em células bege ou brilhantes. Em última análise, métodos analíticos são usados para mostrar o aumento da expressão de genes específicos de adipócitos marrons.

Este método pode ajudar a abordar as questões-chave nos tecidos adiposos marrons, que é o mecanismo molecular que regula o desenvolvimento de células brilhantes ou be. As implicações dessa técnica se estendem ao tratamento da obesidade e outras doenças do estilo de vida. Uma vez que a manipulação do tecido adiposo marrom em humanos pode ser usada como uma potencial intervenção terapêutica, O primeiro passo é preparar o meio de digestão.

Então, após a eutanásia, o tecido adiposo é removido. Primeiro, isole o tecido adiposo marrom interescapular ou morcego cortando ao longo das costas do animal até o pescoço. Dois lobos de tecido adiposo marrom podem ser encontrados logo abaixo da pele entre os ombros.

Em seguida, remova cuidadosamente a fina camada de gordura branca que cobre o morcego. Uma vez isolado, coloque o tecido diretamente no PBS limpo. O tecido adiposo branco inguinal ou wat é encontrado diretamente sob a pele em ambos os lados.

Estende-se até o interior das coxas e desce em direção aos testículos. Remova o lenço e coloque em PBS limpo. As etapas a seguir são aplicadas às amostras de morcego e úmidas.

Remova rapidamente toda a contaminação, como cabelo, músculo esquelético e tecido conjuntivo das seções de tecido. Em seguida, seque o tecido rapidamente em uma toalha de papel para evitar a diluição do meio de dissecção com PBS e coloque-o em uma placa seca. Adicione o meio de digestão e pique o tecido em pedaços pequenos.

Em seguida, transfira o tecido para um tubo de 50 mililitros contendo o restante do meio de digestão. Coloque o tubo em uma incubadora de 37 graus Celsius com agitação constante por 40 a 50 minutos para digerir. Verifique a cada 10 a 15 minutos para garantir que a digestão esteja indo bem e para evitar a digestão excessiva.

Depois que o tecido estiver bem digerido, pare a digestão. Ao adicionar cinco mililitros de meio completo e misturar bem, as células devem ficar quase completamente homogêneas. Em seguida, centrifugue a amostra a 700 vezes G por 10 minutos.

A fração vascular estromal agora deve ser visível à medida que um pellet acastanhado na parte inferior do tubo aspira a camada oleosa de adipócitos maduros na parte superior e a maior parte da camada líquida. Em seguida, dissolva o pellet em 10 mililitros, complete o meio e misture bem. Depois de misturado, coloque um filtro de células sobre um novo tubo de 50 mililitros e filtre a suspensão de células.

Transferir a suspensão de células filtradas para um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 700 vezes G durante 10 minutos. Em seguida, aspire o meio e ressuspenda o pellet. Em 10 mililitros de pipeta média completa e misture bem as células conforme necessário.

Geralmente, cinco camundongos produzem duas placas de 10 centímetros de água inguinal e uma placa de morcego. Uma ou duas horas após o revestimento. Aspire a lavagem média com PBS duas vezes e adicione meio fresco.

Esta etapa é importante, pois pode remover glóbulos vermelhos, células imunológicas e outros contaminantes. Os meios de manutenção e indução são preparados com antecedência. Uma vez que os adipócitos primários tenham crescido para 95 a 97% de confluência, troque o meio completo regular por meio de indução.

Após 48 horas, troque o meio por meio de manutenção contendo glitazona RO 0,5 micromolar. Após mais 48 horas, mude para um novo meio de manutenção contendo uma glitazona RO micromolar por mais dois a três dias. As gotículas aparecerão cerca de três a quatro dias após a indução, como visto aqui, seis a sete dias após a primeira adição do meio de indução.

As células devem ser totalmente diferenciadas para células de gordura maduras e devem ser preenchidas com gotículas de óleo. As células agora podem ser colhidas e usadas para análises posteriores. O escurecimento dos adipócitos primários pode ser avaliado medindo o mRNA de genes específicos ou seletivos da gordura marrom por Q-R-T-P-C-R, como visto aqui.

RO glitazona, UCP fortemente induzido uma expressão de mRNA FORSKOLIN tratamento designado aqui como cíclico A MP. Aumentou ainda mais a expressão de UCP induzida por glitazona RO. Cdia. Outro gene seletivo da gordura marrom também foi aumentado de forma robusta de maneira dose-dependente. O tratamento com glitazona RO também aumentou a expressão de FABP quatro e marcador adipogênico para gordura marrom e branca.

Esse efeito de escurecimento não se deveu simplesmente a um aumento da adipogênese em si. Como a indução da expressão de UCP um e CDIA ainda era significativa, mesmo que os níveis de mRNA fossem normalizados para os de FABP quatro, esse Western blot confirma o aumento do nível proteico de UCP um. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar pré-adipócitos e como diferenciar essas células em células bege ou brilhantes em cultura.