Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microscopia de vídeo de células vivas para estudar a fagocitose do patógeno fúngico humano candida albicans. Isso é realizado pela primeira cultura em candida albicans durante a noite, para que eles entrem em sua fase estacionária. O próximo passo é colocar os macrófagos J 7 74 em placas de imagem com fundo de vidro de 35 milímetros e cultivá-los durante a noite.

No dia seguinte, candida albicans são coradas com Zi sensível ao pH e as organelas ácidas dos macrófagos são coradas usando liso tracker red. A etapa final é fazer um vídeo do ensaio de fagocitose onde os macrófagos J 7 7 4 são cultivados com a candida albicans. Em última análise, o vídeo resultante pode mostrar a análise do estágio do Pacífico do reconhecimento da migração de macrófagos, engolfamento e maturação da zona FGA.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunocitoquímica, é que a microscopia de vídeo ao vivo pode ser usada para quebrar as diferenças observadas em estágios individuais, como migração, engolfamento e maturação do fagossomo, que podem ser afetados. Diferencialmente, embora este método possa fornecer informações sobre a fagocitose do Canadá Acan. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros patógenos, fagócitos, incluindo células dendríticas e neutrófilos.

Esta cultura requer preparação avançada de placas SC menos ágar U. Eles podem ser armazenados refrigerados, comece com a colocação do sorotipo candida albican, uma cepa CI quatro mais CLP 10 de estoques de glicerol armazenados a menos 80 graus Celsius em uma placa de ágar SC U. Incube a placa a 30 graus Celsius até que as colônias se formem, normalmente 48 horas.

Neste ponto, a placa pode ser armazenada a quatro graus Celsius até que esteja pronta para uso. Agora escolha uma única colônia e cultive-a em cinco mililitros, SCU ou médio durante a noite a 30 graus Celsius em um balancim ajustado a 200 RPM. Isso gerará candida albicans em fase estacionária.

Adicione 10 microlitros de candida albicans durante a cultura noturna a 990 microlitros de PBS em pH 7,4 e realize uma contagem de células usando um hemocitômetro para visualizar a candida albicans durante os ensaios de fagocitose corram 100 milhões de candida usando Zi por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, remova o fitzy não ligado lavando a candida albicans três vezes em PBS para lavar a centrífuga a 3000 vezes G por cinco minutos. Remova o estabilizante e suspenda novamente o pellet em um mililitro de PBS Reese.

Suspender o glóbulo final em PBS a uma concentração de 1 milhão de células por microlitro. Para este protocolo, preparamos uma cultura de macrófagos J 7 7 4 0,1 em frascos quadrados de cultura de tecidos de 75 centímetros em DMEM suplementado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono do frasco. Descarte os macrófagos e transfira-os para um tubo Falcon Centrif de 50 mililitros.

Use os macrófagos a 600 vezes G por cinco minutos para obter um palato celular. Remova o supinato e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DM dmm suplementado antes da guerra. Agora conte as células usando um hemocitômetro e coloque 1 milhão de células em uma placa de imagem à base de vidro de 35 milímetros com dois mililitros de meio DMM suplementado.

Incube o prato durante a noite a 37 graus Celsius e com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Antes da imagem, substitua o meio DMM suplementado por dois mililitros de meio independente de dióxido de carbono pré-aquecido contendo um micromolar de Liso tracker red DND 99 e os mesmos suplementos do dmm. A configuração do microscópio precisa incluir um estágio invertido e uma câmara ambiental aquecida a 37 graus Celsius e filtros de emissão de excitação para as manchas escolhidas sendo fitzy e trixy.

Neste exemplo, um núcleo de visão delta de precisão aplicada é utilizado. Primeiro ligue o aquecedor do microscópio para que a câmara de controle esteja quente a 37 graus Celsius. Em seguida, ligue o microscópio e o computador e carregue o software de imagem, monte a placa de imagem no microscópio stage e ajuste o foco para encontrar os macrófagos J 7 74 0,1.

Otimize a aparência das imagens trixi e DIC ajustando a porcentagem de luz transmitida e os tempos de exposição. Remova a placa de imagem e adicione 3 milhões de candida albicans manchadas à placa. Registre o tempo e devolva o prato ao palco, otimize a aparência das imagens fitzy, se necessário, e configure os pontos de interesse no software de imagem, se necessário.

Agora comece a imagem quando todos os pontos estiverem em foco e os canais estiverem otimizados. Capture imagens fitzy, trixi e DIC a cada minuto durante seis horas. Esta é a etapa mais crítica do procedimento.

É necessário levar tempo para configurar o microscópio corretamente. Se os filmes estiverem sub ou superexpostos ou se estiverem fora de foco, eles ficarão inutilizáveis e o experimento precisará ser repetido. Este vídeo representativo mostra a captação de candida albicans pela linha celular de macrófagos murinos J 7 74 0,1.

Durante um experimento de microscopia de vídeo de células vivas de seis horas, a candida albicans em verde foi corada usando o corante sensível ao pH fitsi, que foi extinto durante a acidificação do fagossomo de macrófagos. Confirmando assim quando a cândida foi internalizada, os compartimentos ácidos dos macrófagos foram corados com um corante fluorescente vermelho. Observe a variação no número de macrófagos J 7 74 0,1 individuais ingeridos neste experimento, 82% dos macrófagos J 7 74 0,1 engolfaram pelo menos uma célula de candida albican dentro das seis horas.

O número médio de candida albicans absorvidos por macrófago foi de 3,4, mas, curiosamente, os macrófagos podem ingerir até 16 células fúngicas. Os dados permitem a observação de macrófagos e candida albicans antes e durante o reconhecimento e absorção. Candida albicans hyer pode continuar a crescer dentro do macrófago, o que pode resultar em lise de macrófagos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de microscopia de vídeo de células vivas usando candida albicans na linha celular semelhante a um micrófago J 7 7 4 0.1. Você deve ser capaz de configurar culturas noturnas de ambos os tipos de células e realizar um ensaio de fagocitose, o que permitirá a análise específica do estágio de reconhecimento e engolfamento da migração e também da maturação do fagossomo.