Name: Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda microscopia de vídeo de células vivas para estudar fagocitose de Candida albicans por macrófagos. Este método permite análise em tempo real das etapas de migração, reconhecimento e maturação do fagossoma.

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LPE é Senior Fellow escocês Clínica e reconhece o apoio do Escritório Cientista Chefe (SCD/03). Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust Projeto Grant para EFL (089.930). Narg foi financiado pelo Wellcome Trust um Programa Grant (080.088) e um Grant equipamento (075.470) (para DeltaVision), e por um Grant FP7-2007-2013 (SAÚDE-F2-2010-260338-ALLFUN). Gostaríamos de agradecer à Universidade de Aberdeen instalação de imagem, em particular, Kevin MacKenzie, de apoio e conselhos úteis.

1. C. albicans condições de crescimento e <ol><li> Preparar as placas de agar SC-Ura, adicionando 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 1 ml de NaOH 1 M, 10 mL de 1% (w / v) de sal hemissulfato de adenina e 20 g de agar técnica (previamente descrito em detalhe em 11). Faça-se o volume para 900 ml com água destilada H 2 O. Autoclave, permita ágar arrefecer, mas não o suficiente para solidificar, e depois adicionar 50 ml estéril de 40% de D-glucose e 50 ml estéril a 4% SC-Ura dropout sob condições assépticas. Misturar, verte-se sobre placas de Petri e deixar placas de ágar arrefecer e solidificar. Loja de placas de agar a 5 ° C até à utilização. </li><li> Streak C. albicans serotipo A, estirpe CAI4 + CIp10 de estoques de glicerol armazenada a -80 ° C para SC-Ura placa de ágar. </li><li> Incubar a placa a 30 ° C até as colónias forma e armazenamento a 5 ° C. </li><li> Uma cultura única C. albicans colónia em 5 ml de meio SC-Ura (a receita como em 1.1, mas sem agar técnica) e incubar durante a noite a 30° C, 200 rpm, para gerar fase estacionária C. albicans. </li></ol> 2. C. albicans coloração com isotiocianato de fluoresceína (FITC) <ol><li> Adicionar 10 ul C. albicans cultura durante a noite a 990 ul de PBS (pH 7,4) e realizar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Para auxiliar a visualização de C. albicans durante ensaios de fagocitose, mancha 1 × 10 8 C. albicans, utilizando 1 mg / ml de FITC em 0,05 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio (pH 9,6) durante 10 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Para remover FITC desvinculado, lavar C. albicans em 1 ml 1 x PBS, centrifugação a 3000 × g durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de 1 x PBS. Repita 3 vezes. </li><li> Ressuspender o pellet em 1 x 10 6 células / ml em 1 x PBS. </li></ol> 3. Preparação da Linha Celular J774.1 Rato Macrophage <ol><li> Manter J774.1 macrófagos no tecido 75 cm 2frascos de cultura em meio DMEM suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina, a 37 ° C com 5% de CO 2. A preparação de macrófagos primários são descritos noutro documento em detalhe 12, 13. </li><li> Raspe J774.1 células do frasco de cultura de tecido e transferir para um tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 600 xg durante 5 min para obter um pellet de células. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de pré-aquecida meio DMEM suplementado. Contar as células utilizando um hemocitómetro e placa 1 x 10 6 J774.1 macrófagos em 2 ml de meio DMEM suplementado em um prato de 35 milímetros de imagens à base de vidro. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Antes da imagiologia, substitua meio suplementado com 2 ml de DMEM pré-aquecido suplementado CO meio 2-independente (com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) contendo 1 mM Lyso Tracker Red DND-99.</li></ol> 4. Vídeo ao vivo celular Ensaio Fagocitose Microscopia <ol><li> A escolha do microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara com ambiente aquecido a 37 ° C e de excitação / emissão de filtros para as manchas escolhidas (FITC e TRITC). </li><li> Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente aquecer até 37 ° C. O tempo necessário para que a temperatura da câmara para estabilizar pode variar para diferentes configurações do microscópio. </li><li> Ligue o microscópio e computador, e carregar o software de imagem. Monte o prato de imagens no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os J774.1 macrófagos. Optimizar o aspecto das imagens TRITC e DIC, ajustando a percentagem de luz transmitida e tempos de exposição. </li><li> Retire o prato de imagem e adicionar 3 × 10 6 FITC manchado de C. albicans a tele prato. Anote o tempo que C. albicans é adicionada ao prato. Retorne o prato para o palco e otimizar a aparência das imagens FITC, se necessário. Configurar uma lista de pontos, se necessário. </li><li> Começar de imagem quando todos os pontos estão em foco e os canais são otimizados. Capturar imagens com FITC, TRITC e DIC a cada minuto durante 6 horas. </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar. NG é um receptor de subvenções de apoio irrestrito para a pesquisa básica pela Gilead Sciences. LE trabalha como consultor para a GSK no desenvolvimento de drogas mais cedo.

Aqui, o método para a utilização de células-vivo microscopia vídeo para estudar a fagocitose de macrófagos é descrito. Microscopia de vídeo oferece múltiplas camadas adicionais de informações para análise. Uma vantagem básica é que os dados de absorção pode ser gerada (a partir de uma única experiência) para qualquer ponto no tempo ao longo do período de observação de 6 horas. Mais importante, o método descrito permite a análise diferencial das fases individuais de fagocitose. Nós temos, por exemplo, mostra que as mudanças na absorção global da C. albicans glicosilação e mutantes morfogênese por linhas celulares de macrófagos e macrófagos primários pode ser uma consequência de mudanças na migração de macrófagos em relação às células-alvo ou de taxa de uma vez a imersão contacto célula-célula é estabelecida 7. Há uma série de armadilhas a evitar quando condução desses experimentos. Primeiro, é muito importante para garantir a estabilidade das condições ambientais durante o procedimento experimentalDure. Este é o melhor alcançado em uma câmara ambiental que está definida para as condições experimentais várias horas antes de iniciar o experimento. A qualidade do vídeo é altamente dependente de módulos sofisticados que usam lasers infravermelhos para manter automaticamente a amostra z posição independentemente das alterações mecânicas ou térmicas, eliminando assim a necessidade de correções de foco manual. Dada a natureza prolongada das experiências, é importante para limitar a exposição à luz do laser e efeitos associados fotobranqueamento e fotoconversão, que podem ser minimizados através da utilização de marcadores altamente fluorescentes, o que facilita baixos tempos de exposição. O protocolo de coloração FITC descrito aqui é rápida e fiável. Como FITC é um muito brilhante e estável de manchas, os tempos de exposição baixos são necessários e isso torna ideal FITC por longos time-lapse filmes. No entanto, habitualmente utilizam uma variedade de manchas alvo diferentes, incluindo calcofluor white e corantes PKH, bem como organismos marcados. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A maioria do nosso trabalho publicado é realizada utilizando um microscópio de campo amplo, mas a exposição pode ser ainda mais reduzido por meio de um microscópio confocal disco giratório e em nossas mãos é essencial para lapso de tempo microscopia de vídeo 3D. Durante este estudo, as imagens foram captadas a intervalos de 1 min ao longo de um ensaio de fagocitose 6 hr. O intervalo entre as imagens podem ser ajustadas de acordo com o processo sob investigação. Por exemplo, o intervalo pode ser diminuído quando se investiga processos rápidos como o tráfico vesicular. O intervalo de tempo mínimo será limitada pelas especificações de microscópio e camera. Há algumas considerações a ter em conta quando se ajusta horários. Primeiro, diminuindo o intervalo entre os instantâneos vai significar menos pontos podem ser visualizados e tamanho do arquivo será aumentado consideravelmente. Pelo contrário, o aumento do intervalo de imagem muito irá fazer o filme perde a continuidade. Esta abordagem pode ser aplicadaem princípio, para estudar outros patogénios e absorção de morte de células hospedeiras. Por exemplo, recentemente demonstrado que os macrófagos de medula óssea derivadas de camundongos deficientes sialoadhesin exibem muito reduzida de ligação e fagocitose de sialilado Campylobacter jejuni 8. No entanto, o tamanho do alvo é um importante determinante para a viabilidade, tal como a análise de imagens torna-se cada vez mais difícil com a redução do tamanho da célula-alvo. Software de análise sofisticada imagem é essencial para a análise rápida de vídeo microscopia, e isso deve ser acompanhado de suporte de bioinformática adequado para facilitar a geração de algoritmos para estudar a migração de células individuais e populações de células inteiras 7. Live-célula microscopia de vídeo em combinação com um sofisticado software de análise de imagem para a análise minuto-a-minuto da migração e individuais macrófagos C.albicans interações, fornece uma visão única sobre a complexidade da C. albicans fagocitose por macrophages. Há um enorme potencial para expandir estes métodos para estudar outros patogénios e fagócitos (células dendríticas, neutrófilos) e desenvolver a microscopia de vídeo 3D de imagem interacções célula-célula em maior detalhe ou em mais superfícies fisiológicos, tais como camadas de células epiteliais e endoteliais. Esta técnica é parte da próxima geração de ferramentas no estudo da interação patógeno-hospedeiro e vai ajudar a gerar informações detalhadas espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Sal hemissulfato adenina </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar técnica (n. º 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura abandono </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonato de sódio </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> Lyso Tracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro-pratos </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-célula microscopia vídeo de fagocitose patógeno fúngico

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Apuramento fagocítica de fungos patogénicos e microrganismos, de modo mais geral, podem ser considerados para consistir de quatro fases distintas: (i) a migração dos fagócitos para o local onde estão localizados os patógenos, (ii) reconhecimento do agente patogénico padrões moleculares associados (PAMPs) através do padrão receptores de reconhecimento (PRRs), (iii) imersão de microorganismos ligados à membrana celular dos fagócitos, e (iv) de processamento de células englobadas dentro de fagossomos vencimento e digestão da partícula ingerida. Estudos que avaliam a fagocitose na sua totalidade são informativas 1, 2, 3, 4, 5, mas são limitados na medida em que normalmente não se dividir o processo em imersão, migração e maturação do fagossoma, o que pode ser afectada diferencialmente. Além disso, estes estudos avaliar a absorção, como um evento único, e não como um processo dinâmico contínuo. Desenvolvemos recentemente tecnologias avançadas vivo de células de imagem, e combinaram estes com a análise funcional de ambos genéticacélulas de patógenos e de acolhimento para criar uma plataforma inter-disciplinar para a análise da função da célula imune inata e patogenicidade. Esses estudos têm revelado novos aspectos de fagocitose, que só poderia ser observados usando análise temporal sistemática das interações celulares e moleculares entre fagócitos humanos e fungos e microorganismos infecciosos em geral. Por exemplo, podemos ter começado a definir o seguinte: (a) os componentes da superfície da célula necessárias para cada fase do processo de imersão, o reconhecimento ea morte de células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) a geometria da superfície como influencia a eficiência de absorção de macrófagos e morte de células de levedura e hifa 7, e (c) como imersão leva a alterações do ciclo celular e no comportamento dos macrófagos 9, 10. Em contraste com a de um único ponto de tempo de instantâneos, live-célula microscopia de vídeo que permite uma grande variedade de células hospedeiras e organismos patogénicos para ser estudado como coseqüências ntinuous em períodos de tempo longos, fornecendo informação espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos, incluindo a migração celular, replicação e tráfico vesicular. Aqui descrevemos em detalhes como preparar hospedeiro e células fúngicas, e para realizar os experimentos de microscopia de vídeo. Estes métodos podem fornecer um guia para estudos futuros com outros fagócitos e microorganismos.

Aqui nós mostramos resultados representativos para C. albicans absorção por uma linha de células de macrófagos de murino J774.1 durante 6 horas uma experiência microscopia vivo de células de vídeo. Figura 1 é um representante vivo de células filme microscopia video, mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Live-célula microscopia de vídeo permite a internalização de C. albicans a ser visualizados sem a necessidade de se manchar Candida externa. No entanto, durante estas experiências, C. albicans foi corada usando o corante sensível ao pH com FITC (verde), o que é extinta durante a acidificação do fagossoma macrófago, e facilita a confirmação de que Candida foi internalizado (Figura 1). Para visualização auxílio adicional de C. ingerida albicans, macrófagos foram corados com o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99, os compartimentos que cora ácidos e serve como um marcador não específico de maturação do fagossoma.A Figura 2 é uma imagem fixa a partir de uma experiência de microscopia vivo de células de vídeo e ilustra a variação do número de C. albicans ingeridos por macrófagos J774.1 individuais. Nesta experiência, 82% de macrófagos J774.1 engolida pelo menos um C. albicans de células no final do ensaio de fagocitose 6 hr. Na Figura 3, o número de internalizada C. albicans células por macrófago é relatado. O número médio de C. albicans assumidas por macrófagos é de 3,4, mas curiosamente os macrófagos podem ingerir até 16 células fúngicas. Figura 4 é uma sequência de imagens estáticas de um representante experiência microscopia live-célula de vídeo mostrando um macrófago fagocitando C. albicans células, hifa de crescimento com o macrófago e lise de macrófagos. finalmente Figura 4 mostra que a microscopia de vídeo permite a análise de eventos após imersão de células-alvo, ou seja, dados podem ser gerados para o killing de macrófagos por C. albicans hifas em relação ao número e morfogénese de células alvo ingeridas, e como morte de macrófagos refere-se a maturação do fagossoma, que pode ser estudado em tempo real. Figura 1. Live-célula filme microscopia vídeo mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Macrófagos e C. albicans foram co-cultivados durante um período de 6 horas a 37 ° C em CO 2 completo independente meio. As imagens foram capturadas em intervalos de 1 min para 6 horas. Os macrófagos podem ser vistos estabelecer contacto célula-célula com C. albicans, que é então seguida pela absorção de C. albicans em fagossomas macrófagos. As setas indicam a C. albicans antes da imersão por macrófagos J774.1. Este vídeo mostra também que a fluorescência FITC é quenched imersão seguinte de C. albicans. Barra de escala, 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figura 2. Representante microscopia de vídeo ao vivo de células variação da imagem ainda mostra o número de C.albicans engolido por macrófagos individuais. Os macrófagos (coradas utilizando Lyso Tracker red DND-99) foram co-cultivados com FITC-stained C. albicans (verde). Há uma variação do número de C. albicans engolida (um número ao lado de uma seta indica o número de C. albicans engolida), e em C. albicans morfologia (ou seja, versos levedura hifa). Barra de escala, 20 m. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figura 3. Gráfico mostrando o número de C. albicans ingeridos por macrófagos murinos J774.1 no final de 6 ensaios de fagocitose hr. Os dados representam dois experimentos independentes. Um total de 100 macrófagos foram contados a partir de 3 campos de cada experiência, dando um total de 600 macrófagos individuais. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figura 4. Uma série de imagens a partir de um experimento representativo microscopia vivo de células vídeo mostrando um macrófago (M) e C. albicans (C), antes e durante o reconhecimento de (A, B), e, durante e após a absorção (C, D). C. albicans hifas continuar a crescer dentro do macrófago (E, F), o que pode resultar na lise de macrófagos (G). Outros macrófagos são recrutadas para o local de ruptura e tentam ingerir o C. libertado albicans (H). Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente LysoTracker vermelho DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Note-se que a coloração é parada após FITC C. albicans absorção por macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, 10 um.

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de microscopia<em&gt; Candida albicans</em&gt; A fagocitose por macrófagos. Esses métodos permitem estágio específico de análise, migração de macrófagos, imersão, o reconhecimento e a maturação do fagossoma e revelar novos aspectos da fagocitose.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um experimento de microscopia de vídeo de células vivas para estudar a fagocitose do patógeno fúngico humano candida albicans. Isso é realizado pela primeira cultura em candida albicans durante a noite, para que eles entrem em sua fase estacionária. O próximo passo é colocar os macrófagos J 7 74 em placas de imagem com fundo de vidro de 35 milímetros e cultivá-los durante a noite.No dia seguinte, candida albicans são coradas com Zi sensível ao pH e as organelas ácidas dos macrófagos são coradas usando liso tracker red. A etapa final é fazer um vídeo do ensaio de fagocitose onde os macrófagos J 7 7 4 são cultivados com a candida albicans. Em última análise, o vídeo resultante pode mostrar a análise do estágio do Pacífico do reconhecimento da migração de macrófagos, engolfamento e maturação da zona FGA.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunocitoquímica, é que a microscopia de vídeo ao vivo pode ser usada para quebrar as diferenças observadas em estágios individuais, como migração, engolfamento e maturação do fagossomo, que podem ser afetados. Diferencialmente, embora este método possa fornecer informações sobre a fagocitose do Canadá Acan. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros patógenos, fagócitos, incluindo células dendríticas e neutrófilos.Esta cultura requer preparação avançada de placas SC menos ágar U. Eles podem ser armazenados refrigerados, comece com a colocação do sorotipo candida albican, uma cepa CI quatro mais CLP 10 de estoques de glicerol armazenados a menos 80 graus Celsius em uma placa de ágar SC U. Incube a placa a 30 graus Celsius até que as colônias se formem, normalmente 48 horas.Neste ponto, a placa pode ser armazenada a quatro graus Celsius até que esteja pronta para uso. Agora escolha uma única colônia e cultive-a em cinco mililitros, SCU ou médio durante a noite a 30 graus Celsius em um balancim ajustado a 200 RPM. Isso gerará candida albicans em fase estacionária.Adicione 10 microlitros de candida albicans durante a cultura noturna a 990 microlitros de PBS em pH 7,4 e realize uma contagem de células usando um hemocitômetro para visualizar a candida albicans durante os ensaios de fagocitose corram 100 milhões de candida usando Zi por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, remova o fitzy não ligado lavando a candida albicans três vezes em PBS para lavar a centrífuga a 3000 vezes G por cinco minutos. Remova o estabilizante e suspenda novamente o pellet em um mililitro de PBS Reese.Suspender o glóbulo final em PBS a uma concentração de 1 milhão de células por microlitro. Para este protocolo, preparamos uma cultura de macrófagos J 7 7 4 0,1 em frascos quadrados de cultura de tecidos de 75 centímetros em DMEM suplementado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono do frasco. Descarte os macrófagos e transfira-os para um tubo Falcon Centrif de 50 mililitros.Use os macrófagos a 600 vezes G por cinco minutos para obter um palato celular. Remova o supinato e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DM dmm suplementado antes da guerra. Agora conte as células usando um hemocitômetro e coloque 1 milhão de células em uma placa de imagem à base de vidro de 35 milímetros com dois mililitros de meio DMM suplementado.Incube o prato durante a noite a 37 graus Celsius e com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte. Antes da imagem, substitua o meio DMM suplementado por dois mililitros de meio independente de dióxido de carbono pré-aquecido contendo um micromolar de Liso tracker red DND 99 e os mesmos suplementos do dmm. A configuração do microscópio precisa incluir um estágio invertido e uma câmara ambiental aquecida a 37 graus Celsius e filtros de emissão de excitação para as manchas escolhidas sendo fitzy e trixy.Neste exemplo, um núcleo de visão delta de precisão aplicada é utilizado. Primeiro ligue o aquecedor do microscópio para que a câmara de controle esteja quente a 37 graus Celsius. Em seguida, ligue o microscópio e o computador e carregue o software de imagem, monte a placa de imagem no microscópio stage e ajuste o foco para encontrar os macrófagos J 7 74 0,1.Otimize a aparência das imagens trixi e DIC ajustando a porcentagem de luz transmitida e os tempos de exposição. Remova a placa de imagem e adicione 3 milhões de candida albicans manchadas à placa. Registre o tempo e devolva o prato ao palco, otimize a aparência das imagens fitzy, se necessário, e configure os pontos de interesse no software de imagem, se necessário.Agora comece a imagem quando todos os pontos estiverem em foco e os canais estiverem otimizados. Capture imagens fitzy, trixi e DIC a cada minuto durante seis horas. Esta é a etapa mais crítica do procedimento.É necessário levar tempo para configurar o microscópio corretamente. Se os filmes estiverem sub ou superexpostos ou se estiverem fora de foco, eles ficarão inutilizáveis e o experimento precisará ser repetido. Este vídeo representativo mostra a captação de candida albicans pela linha celular de macrófagos murinos J 7 74 0,1.Durante um experimento de microscopia de vídeo de células vivas de seis horas, a candida albicans em verde foi corada usando o corante sensível ao pH fitsi, que foi extinto durante a acidificação do fagossomo de macrófagos. Confirmando assim quando a cândida foi internalizada, os compartimentos ácidos dos macrófagos foram corados com um corante fluorescente vermelho. Observe a variação no número de macrófagos J 7 74 0,1 individuais ingeridos neste experimento, 82% dos macrófagos J 7 74 0,1 engolfaram pelo menos uma célula de candida albican dentro das seis horas.O número médio de candida albicans absorvidos por macrófago foi de 3,4, mas, curiosamente, os macrófagos podem ingerir até 16 células fúngicas. Os dados permitem a observação de macrófagos e candida albicans antes e durante o reconhecimento e absorção. Candida albicans hyer pode continuar a crescer dentro do macrófago, o que pode resultar em lise de macrófagos.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de microscopia de vídeo de células vivas usando candida albicans na linha celular semelhante a um micrófago J 7 7 4 0.1. Você deve ser capaz de configurar culturas noturnas de ambos os tipos de células e realizar um ensaio de fagocitose, o que permitirá a análise específica do estágio de reconhecimento e engolfamento da migração e também da maturação do fagossomo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Aqui, demonstramos como citometria de imagem pode ser usada para quantificação de fungos patogénicos em associação com as células hospedeiras em cultura. Esta técnica pode ser usado como uma alternativa para CFU enumeração.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.

A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a atividade antifúngica de células imunes humanas primárias em tempo real usando fluorescente Aspergillus repórter conídios em conjunto com microscopia de vídeo ao vivo de células e citometria de fluxo. Dados gerados fornecer informações sobre hospedeiras cell- interacções Aspergillus tais como actividade fungicida, a fagocitose, a migração de células e inibição do crescimento de fungos.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.

Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

Investigando a Faagocytose da Leishmania usando Microscopia Confocal

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Aprenda microscopia de vídeo de células vivas para estudar fagocitose de Candida albicans por macrófagos. Este método permite análise em tempo real das etapas de migração, reconhecimento e maturação do fagossoma.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

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