Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

O objetivo geral deste procedimento é preparar vesículas unilamelares gigantes de maneira compatível com a integridade funcional das proteínas de membrana incorporadas à membrana da vesícula. Isso é feito depositando primeiro lipídios ou pequenos lipossomas em uma superfície condutora, como uma lâmina de vidro revestida com ITO. O segundo passo é evaporar o solvente de maneira controlada para obter um filme lipídico uniforme na superfície condutora.

Em seguida, reidratar cuidadosamente o filme lipídico em um tampão adequado e preparar a câmara de eletroformação. A etapa final é aplicar uma tensão oscilante através do filme lipídico para gerar vesículas de Miller unais gigantes. Por fim, as vesículas serão fotografadas para determinar seu tamanho e qualidade e comparar com as vesículas formadas usando uma técnica clássica.

A demonstração visual deste protocolo é útil porque a deposição de lipídios pode ser difícil de dominar, depende de muitas variáveis e é melhor testada por inspeção visual. Antes de iniciar este procedimento, remova os lipídios do armazenamento a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius e aqueça à temperatura ambiente. Se possível, realize o experimento em uma atmosfera de gás inerte, como um porta-luvas.

Em seguida, cubra os lipídios em argônio seco ou gás nitrogênio e em todas as etapas minimize a exposição ao ar. Se os lipídios não forem fornecidos em solvente orgânico, suspenda 0,3 miligramas de lipídios em clorofórmio ou ciclo-heano a 10 miligramas por mililitro. Observe que os fabricantes declararam que as concentrações são normalmente apenas nominais.

Use etanol para limpar ambos os lados de 2 lâminas de vidro revestidas com ITO de 25 milímetros por 37,5 milímetros. Em seguida, adicione mais 0,1 por cento de DPPE vermelho Texas aos lipídios para imagens fluorescentes. Meça a resistência da superfície com um multímetro para verificar se o lado revestido com ITO das lâminas de vidro está voltado para cima, o que é indicado por uma resistência de algumas centenas de ohms.

Aspire os lipídios para uma seringa resistente a solventes com a agulha da seringa sem tocar totalmente a superfície ITO. Aplique lentamente o lipídio movendo a agulha para frente e para trás na lâmina. Cubra a superfície uniformemente, procurando um brilho de arco-íris na superfície do vidro.

Em seguida, coloque as corrediças rapidamente em um vácuo dessecador e bombeie a câmara para menos de um ou vácuo por 0,5 a uma hora. Para remover qualquer traço de solvente. Libere o vácuo com gás inerte.

Aplique uma fina camada de graxa de silicone em ambos os lados de uma junta de silicone e, em seguida, coloque a junta na corrediça. Deixe pelo menos cinco milímetros de lâmina descoberta exposta em uma extremidade da lâmina. Em seguida, hidrate cuidadosamente cada poço colocando uma agulha de seringa de calibre 27 na borda da junta e aplique lentamente o tampão transbordando cada poço de junta em aproximadamente 10% com três pilhas milimolares.

Depois que os lipídios estiverem hidratados, prossiga rapidamente pelas etapas restantes. Como os filmes lipídicos começam a delaminar, verifique imediatamente o lado condutor da lâmina com o multímetro. Em seguida, aplique a segunda face condutora da corrediça ITO na parte superior da junta.

Certifique-se de ter pelo menos cinco milímetros de saliência fora da área da junta e oposta à primeira saliência e pressione suavemente para garantir uma boa vedação. Limpar as duas saliências com etanol. Agora prenda o sanduíche deslizante ITO em contatos elétricos, como barras de cobre ou espuma de vedação.

Este gráfico mostra uma vista explodida da câmara e do conjunto de contato como referência. Planos detalhados podem ser encontrados no protocolo de texto usando um multímetro. Verifique se não há curto-circuito elétrico entre os contatos e se os contatos se conectam corretamente às superfícies ITO.

Em seguida, coloque a câmara de eletroformação em um forno e aqueça a câmara 10 graus Celsius acima da temperatura de fusão mais alta de qualquer um dos lipídios presentes. Meça a lacuna entre as duas superfícies revestidas com ITO para determinar a amplitude da onda senoidal. A amplitude da onda senoidal deve ser de aproximadamente 0,7 volts RMS Para cada intervalo milimétrico entre as superfícies ITO, aplique uma onda senoidal de 10 hertz por 60 a 90 minutos.

Conecte o gerador à câmara de eletroformação e confirme a tensão com um multímetro. Após 60 a 90 minutos de eletroformação, vesículas unais gigantes devem ter se formado. Use um microscópio invertido equipado com um cubo de filtro para corante vermelho do Texas para obter imagens dos lipossomas.

O lipossoma deve ser esférico, predominantemente Ella a olho nu e isento de defeitos, tais como fios pendurados no lipossoma. As etapas anteriores cobriram a preparação clássica de lipossomas gigantes a partir de lipídios puros. Uma preparação mais desafiadora usando pequenos lipossomas é mostrada.

Em seguida, prepare uma solução saturada de carbonato de potássio de 44% de umidade relativa a 20 graus Celsius. Use um recipiente de iogurte e granola de plástico com um copo superior de aninhamento que foi modificado com orifícios no copo superior. Coloque a solução salina saturada e o excesso de sal em um recipiente hermeticamente fechado com uma prateleira interna.

Recoloque a prateleira após o enchimento e certifique-se de que o fluido esteja de cinco a 10 milímetros abaixo da prateleira. Coloque um sensor de umidade em um entalhe na lateral do recipiente. Limpe ambos os lados das lâminas de vidro revestidas com ITO com etanol.

Use o multímetro para determinar qual lado é condutor e rotule o lado não condutor com o nome da amostra. Em seguida, lubrifique levemente os dois lados de uma junta de silicone de uma ou várias porções. Coloque o condutor da lâmina, coloque-o na bancada e aplique as juntas de silicone em cada lâmina na qual o lipídio será aplicado.

Certificando-se de que haja pelo menos cinco milímetros de corrediça exposta em uma extremidade para conectar ao aparelho de eletroformação. Alise a junta para garantir uma boa vedação, dilua a preparação da vesícula no tampão iso modic com baixo teor de sal para aproximadamente um a dois miligramas por mililitro. Aplique o lipídio na lâmina em gotas de um a 10 microlitros.

Coloque a lâmina na prateleira interna acima da solução salina saturada e feche bem o recipiente. Deixe em temperatura ambiente por três horas a durante a noite. A lâmina agora pode ser usada para a eletroformação de lipossomas gigantes, conforme mostrado anteriormente no protocolo clássico.

Observe a aparência do arco-íris dos depósitos individuais. Esta imagem mostra lipossomas eletroformados a partir de lipídios depositados a partir do clorofórmio, as setas apontam para lipossomas gigantes. Esta imagem tem muito poucas áreas difusas e, portanto, indica uma boa preparação.

Esta próxima imagem tem muitas regiões difusas e, portanto, indica uma preparação geralmente ruim. Observe que a seta dois indica uma região com lipossomas pouco distinguíveis e que nenhum lipossoma pode ser focalizado na área indicada pela seta três. Aqui é mostrada uma ampliação de 10 x dos lipossomas eletroformados com sucesso a partir de lipídios depositados pela desidratação de pequenos lipossomas.

As setas indicam três lipossomas de boa qualidade variando em tamanho de aproximadamente cinco a 20 micrômetros com aumento de 40x. Um anel claro pode ser visto na borda do lipossoma, o que indica um lipossomo uni ou quase lumal. As correntes iônicas TR PV one ativadas por capsaicina registradas em manchas de membrana lipídica excisadas dos lipossomas gigantes formados são retratadas aqui.

A corrente de fuga indicou uma resistência de vedação de 500 mega antes da adição da capsaicina. A saturação da capsaicina ativou uma grande corrente T RRP V uma. O retorno atual para perto da linha de base à medida que a capsaicina é lavada do adesivo durante a tentativa deste procedimento.

É importante permanecer flexível, pois muitos fatores afetam a forma como os lipídios desidratam e formam uma película uniforme no substrato de vidro. Consulte nossa seção de solução de problemas on-line e varie a temperatura, a umidade, a concentração de lipídios e o tamanho das gotículas para obter os melhores resultados.