Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado

O objetivo geral do experimento a seguir é testar o comportamento fototático inato e circadiano de larvas de drosófila por meio de um teste de preferência entre luz e escuridão. Isso é conseguido primeiramente criando-se as larvas experimentais em condições definidas de luz e escuridão, a fim de estabelecer um relógio circadiano inicial nas larvas. Em seguida, as larvas são transferidas para escuridão constante, o que permite que o relógio circadiano larval funcione livremente.

Uma vez atingida a fase de alimentação L3, as larvas são separadas em grupos para testar sua preferência por luz em diferentes pontos temporais circadianos. Os resultados obtidos demonstram a preferência inata e circadiana pela luz, com base no cálculo de um índice de preferência e na comparação entre os diferentes pontos temporais e grupos experimentais. Embora este método possa fornecer informações sobre a regulação inata e circadiana da percepção luminosa e o processamento do comportamento fotossensível, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como olfação, aversão, quimiotaxia e termotaxia.

Da mesma forma, pode ser modificado para testes de aprendizado e memória. Demonstrarão o procedimento Alina e BMA para estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para coletar ovos, permita que moscas adultas acasaladas depositem por 12 horas em placas frescas e transfira-as para novos frascos. Continue transferindo os adultos a cada 12 horas em um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.

Mantenha as coletas de ovos de 12 horas na incubadora. Para o experimento, eleve os animais até o estágio de larva L3 inicial. Essas são larvas alimentadoras disponíveis entre 84 e 108 horas após a postura dos ovos.

A correta estagificação de LAE é fundamental para o sucesso do experimento. Desde o final do terceiro estágio larval, o LAE altera o comportamento fototáctico para testar os componentes circadianos do comportamento visual. 48 horas antes do teste e logo antes do amanhecer subjetivo das larvas, coloque as larvas coletadas em uma caixa de papelão.

Em seguida, transfira a caixa para um incubador com escuridão constante por 48 horas até o experimento, durante as quais as larvas devem permanecer inalteradas em seu espaço dedicado. Prepare a tampa de uma placa de Petri de nove centímetros usando um quadrado de 20 centímetros dividido em quatro quadrantes. Como guia.

Cole quadrados de 10 centímetros de folha de alumínio em quadrantes opostos e cubra-os com fita preta. Certifique-se de cobrir a borda da tampa. Em seguida, cole um quadrado de 20 centímetros dividido em quatro quadrantes sob a fonte de luz na mesa.

Marque a circunferência de uma placa de teste na folha para servir como guia para um deslocamento consistente. Instale uma lâmpada de LED acima da placa de Petri usando um suporte de ferro. Ajuste a altura de forma que toda a placa de teste seja iluminada de maneira homogênea.

Ajuste a intensidade da luz em um local de teste entre 350 e 760 lux, ajustando ainda mais a altura da lâmpada ou utilizando uma fonte de alimentação regulável. O ambiente do experimento precisa ter iluminação com luz vermelha e deve apresentar a mesma temperatura do local onde os animais são criados. Os frascos foram criados por dois dias em escuridão constante.

Colete as larvas com a comida usando uma espátula dos cinco milímetros superiores da ração. Espalhe a ração no lado externo da tampa de uma placa de Petri. Adicione um pouco de água à ração e misture suavemente com a espátula.

Adicione uma gota de água da torneira a um novo recipiente usando um pincel. Transfira as larvas para a gota de água para lavá-las. Em seguida, use um pincel úmido para coletar as larvas.

Selecione apenas larvas L3 em fase inicial de alimentação e evite larvas L3 em fase tardia de errantismo. Transfira as larvas selecionadas para o centro de uma placa de teste. Larvas L3 em fase de alimentação possuem esferoides anteriores abertos e protruídos para o exterior.

Em forma de dedo. Os esféricos posteriores possuem três aberturas cada e quatro grupos de pelos grandes ramificados. As glândulas salivares estendem-se até o segundo segmento abdominal.

Após posicionar 30 larvas no centro da placa de teste, cubra-a com a tampa preparada. Ligue a lâmpada de LED. Inicie um cronômetro e deixe as larvas se moverem livremente sobre a placa por cinco minutos.

Em seguida, remova rapidamente a tampa e conte o número de larvas nos quadrantes escuros e claros. Marcar a posição de cada larva pode facilitar a contagem. Uma fotografia rápida também pode ajudar. Larvas que mostram preferência luminosa indefinida, como aquelas rastejando pelas paredes ou se enterrando no ágar, devem ser contadas como preferência neutra e adicionadas ao número total de larvas ao calcular o índice de preferência luminosa.

Após contar as larvas, descarte a placa e utilize uma nova placa de teste para o próximo experimento. Após realizar de 10 a 15 ensaios por genótipo, prossiga com a análise seguindo o protocolo. A preferência por luz e escuridão de larvas Canton ES foi comparada em dois diferentes tempos circadianos.

CT zero e CT 12, subjetivamente, larvas ao amanhecer e ao crepúsculo ou gemidos por 48 horas em condições padrão e, em seguida, mudar para escuridão constante por três dias. O teste de claro-escuro sob 350 lux revelou que a fotossensibilidade à luz era maior nas larvas testadas no CT zero em comparação com as larvas testadas no CT 12. Usando esta fórmula, a preferência pela escuridão das larvas no CT zero foi de 0,52 em comparação com 0,36.

A comparação dos índices entre as larvas CT 12 utilizando um teste de Wilcoxon produz um valor de P significativo de 0,023. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como testar a preferência por luz de larvas trof em diferentes circuitos e pontos temporais em relação a este objetivo. Você deverá ser capaz de sincronizar larvas oph no estágio F três, testar seu comportamento fotofóbico e calcular o índice de preferência por luz para comparação estatística.