Name: Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando 19 F / 1 H Ressonância Magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a rastrear a migração de células dendríticas para linfonodos usando ressonância magnética de flúor e prótons em camundongos. Este método não invasivo oferece imagens sem ruído de fundo.

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Este estudo foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft para SW (DFG WA 2804) e uma bolsa da universidade para SW a partir do Centro de Pesquisa Experimental e Clínica, a cooperação do Max Centro de Medicina Molecular e Faculdade de Medicina Charité, em Berlim Delbrück. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos ao Sr. Robert Westphal para o suporte técnico durante o seu estágio no nosso laboratório.

Todos os procedimentos com animais devem ser aprovados pelo comitê institucional local, bem-estar animal antes da execução. Durante as medições MR um nível adequado de anestesia e de monitorização fisiológica (temperatura corporal, freqüência respiratória) são requisitos indispensáveis. 1. Geração de Rato derivadas da medula óssea células dendríticas <ol><li> Extrair as células da medula óssea de ratinhos C57BL / 6, como previamente descrito 12. Esse protocolo remonta a 1992 e 13 foi originalmente descrito por um grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descobridor da célula dendrítica 14. </li><li> Resumidamente, extrai tíbia e fíbula logo após sacrificar ratinhos. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar (para evitar a contaminação microbiana), lave a medula óssea em uma pequena placa de Petri com meio de lavagem (5% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% HEPES em RPMI) 12. </li><li> Transferência da suspensão de células através de uma célula de estrainer (tamanho de malha de 100 um, de nylon) em um tubo de centrífuga estéril de 50 ml, a fim de remover restos de osso e tecido. Depois de várias etapas de lavagem e uma de 12 etapas de lise, a contagem das células viáveis ​​utilizando azul de tripano e um hemocitômetro. </li><li> Ressuspender as células da medula óssea a uma concentração de 400.000 células ml -1 em meio de cultura (RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de HEPES e 1% de L-glutamina) contendo 75 ng mL-1 de rato de granulócitos macrófago factor estimulante de colónias (mGM-CSF), obtida a partir de sobrenadantes de células HEK 293FT transfectadas com um plasmídeo de GMCSF rato. Transferem-se 10 ml de suspensão de células (4 x 10 6 culas) em placas de Petri (100 mm x 20 mm) e incubadas num incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2). No dia 3, reabastecer meio de idade com 10 ml de meio fresco (mantendo a concentração final da MGM-CSF em 75 ng ml -1). No dia 6, remover 10 ml do meio velho e reconstituircom 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 75 ng ml -1). No dia 8, remover 10 ml do meio velho e reabastecer com 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 150 ng ml -1). </li><li> No dia 10, a amadurecer diferenciada CC com 1 ug mL1 lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 horas. </li></ol> 2. Marcação de células dendríticas com 19 Partículas F-ricos <ol><li> Durante a etapa de maturação 24 hr (1,5), com o rótulo do CD 1 mM de flúor rico perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas (500-560 nm), também por 24 hr. Prepara grandes partículas flúor-rotulados por emulsionar PFCE em Pluronic F-68 (volume total de 2,5 mL) utilizando uma célula de desregulação sonotrodo titânio e empregando um programa de pulso contínua (100% de amplitude, potência = 250 W) durante 60 segundos. </li><li> Após os passos de incubação acima, recolher o DC maduras e flúor marcado utilizando um raspador de células de cultura de tecidos, a transferência para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugara 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Para lavar as partículas de sobra e células mortas, deixa as células colhidas a aderir em pratos de poli-L-lisina. Para se preparar para este passo, placas de Petri com revestimento de poli-L-lisina (1 mg mL-1) a 37 ° C durante 1 hora, em seguida lavar o não ligado a poli-L-lisina com PBS. </li><li> Incubar as células colhidas de cima das placas de poli-L-lisina em meio isento de soro e permitir que as células a aderir (1 hr a 37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Lavar o meio para descartar as células não aderentes, as partículas remanescentes e células mortas e lavar três vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. </li><li> Colheita de células aderentes por um tratamento tripsina-EDTA (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubação a 37 ° C). </li><li> Seguindo um outro passo de centrifugação de lavagem, ressuspender a quantidade necessária de CD maduras no soro livre de PBS estéril. </li><li> Para determinar se as células foram marcadas com êxito, é recomendado verificar a physicochemicos características das células por citometria de fluxo (FACS). A dispersão lateralmente (SSC) deve revelar um aumento na granularidade nestas células, como previamente descrito 11. Deve também ser mantido em mente que os fibroblastos podem contaminar as culturas DC e também pode assumir as partículas 19 F em paralelo. Por conseguinte, o grau de pureza DC devem ser avaliados (por medição da percentagem de células CD11c + CD11b + utilizando FACS) antes da aplicação in vivo. </li></ol> 3. Aplicação in vivo de 19 F-marcadas Células Dendríticas <ol><li> Administrar DC (junho 10 - julho 10) num volume de 50-100 ul intracutaneamente nos membros posteriores de um ratinho C57BL / 6, posicionando o rato num suporte e cuidadosamente inserindo uma agulha G 26 ½ nas camadas superiores da pele antes da aplicação (uso de seringas de 0,5 ml de tuberculina com agulhas permanentemente conectados para minimizar volume morto). Para garantir umn aplicação intradérmica apropriada, é importante que a parte inserida da agulha seja parcialmente visível por baixo da pele. Se a agulha não é mais visível, a agulha foi inserida demasiado profunda nas camadas da pele. Para o indivíduo não treinado, a aplicação intradérmica pode ser realizada sob anestesia. </li><li> Imagem membros por em flúor vivo (19 F) / prótons (1 H) MRI (veja a próxima seção) 21 horas após a injecção. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H Ressonância Magnética As instruções detalhadas para configurar os exames de RM referem-se a um scanner MR Bruker usando o software de controle Paravison (versão 5.1). Nomes referentes a funções e itens específicos do fornecedor foram destacadas em itálico. Para outros scanners MR estes passos pode ter de ser ajustada de acordo com as orientações dos fabricantes. <ol><li> Organizar o acesso a um dedicadopequeno scanner de ressonância magnética animal. Para qualidade de imagem adequada, um sistema com uma intensidade de campo magnético de 9,4 Tesla ou mais e bobinas de radiofreqüência sob medida (por exemplo, um H / 19 F bobina dupla ajustável volume de RF, 35 mm de diâmetro interno, 50 mm de comprimento; rápida Biomed, Würzburg, Alemanha) são recomendados. </li><li> Antes de ressonância magnética, preparar a instalação do aparelho de ressonância magnética para anestesia e monitorização fisiológica. Assegure-se que a máscara respiratória do leito / detentor animal é ligado ao sistema de isoflurano e que a sonda de temperatura e uma almofada de respiração está conectado a um sistema de monitorização remota de animais (por exemplo, Modelo 1025, SA Instruments Inc., Nova Iorque, EUA). Este último serve para monitorar os parâmetros vitais do animal, tais como a temperatura do corpo e da respiração. </li><li> Anestesiar ratos narcose por inalação através de uma câmara de mouse conectado a um sistema de isoflurano. Ajustar o fluxo de ar e O 2 em 0,2 L min -1 e 0,1 L min -1, respectivamentee 3% de isoflurano (ajustados a partir de um vaporizador) durante cerca de 2 min, até que o nível desejado de anestesia é alcançado (sem resposta seguinte pitada tep). Taxas de fluxo óptimas podem variar dependendo da configuração que está sendo usado. Esteja ciente de que altas taxas de fluxo pode levar à desidratação. A monitorização cuidadosa das condições dos animais é necessária em todos os momentos, como mencionado acima. </li><li> Posicione o mouse propenso na cama mouse / detentor do pequeno animal MR scanner (Figura 1). </li><li> Mantendo a taxa de fluxo de ar constante e S 2, ajustar o vaporizador isoflurano para 0,8-1,5%, até um padrão de respiração óptima é alcançada. Recomenda-70 respirações por min - A freqüência respiratória de 50. </li><li> Mantenha a temperatura do corpo a 36-37 ° C durante o experimento, empregando uma água morna (ou, alternativamente, ar quente) sistema de circulação. </li><li> Mantenha os olhos do úmido mouse com estéril olho pomada lubrificante durante a medição. </li><li> Depois de garantir que o animalno suporte de imagem e as ligações ao sistema de monitorização, mova o suporte para o centro do 1 H / 19 F ampliada da bobina (que está posicionado no isocentro do íman scanner para animais). </li><li> Definir a posição do rato de modo que o joelho encontra-se dentro do isocentro do íman, ou com um método automático (por exemplo, usando um laser de posicionamento combinado com um suporte de animais motorizado) ou manualmente, por meio do cálculo da distância do suporte precisa ser movido para o íman para atingir o isocentro. </li><li> Para confirmar o posicionamento correto do animal no scanner e, posteriormente, o planejamento da geometria fatia de imagem (ou seja, tamanho, posição e rotação no espaço), adquirir explorar imagens em três orientações padrão (axial, coronal, sagital), utilizando resolução de imagem rápida e de baixo métodos de aquisição (por exemplo, protocolo TriPilot, que usa uma seqüência de pulsos flash). </li><li> Ajustar a bobina RF ao H frequência de ressonância 1 (p.ex.. 400,1 MHz para 9,4 T) e para a frequência de ressonância de 19 F (por exemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão e recepção do sinal. </li><li> Realize as configurações do sistema automático necessárias, incluindo calços para ajustar a homogeneidade do campo magnético (por exemplo ADJ_SHIM), ajustes de freqüência do sistema para ajustar a RF à freqüência Lamor do mouse (por exemplo ADJ_SF) e ganho de referência para ajustar a amplitude RF ( por exemplo ADJ_REFG). Todas essas configurações são importantes para tornar os campos magnéticos estáticos e variável (B 0, B 1), na região de interesse, o mais homogéneo possível. </li><li> Adquirir um segundo conjunto de imagens agente (como acima) ao longo das três orientações ortogonais, após ter regulado o campo de visão (FOV) de tal modo que ambos os membros inferiores ARe visível a partir da pelve de pé (CxLxA = 50x25x25 mm). Estas imagens servem para planejar as orientações das 3D 1 H / 19 F exames finais. </li><li> Estabelecer um protocolo 3D TurboRARE para um H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Fator RARE = 16 (. Tempo de varredura de aproximadamente 60 min). Ajuste FOV com a ajuda das imagens de escoteiros, iniciar a digitalização (semáforo). </li><li> Carregar um único pulso-FID de sequência com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir núcleo a 19 F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas. </li><li> Inicie a medição sem a gravação de dados para exibir um sinal de MR em tempo real usando GSP (ir setup). Se o sinal espectral 19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante) até um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica para o centro de pico espectral 19 F em 0 Hz na janela de aquisição. Aplicar freqüência básica e pressione Parar. Note-se que o isoflurano utilizada como anestésico pode gerar um sinal de fundo. De 9,4 Tesla MRI o deslocamento químico entre os 19 partículas F contendo eo isoflurano é de cerca de 1800 Hz. Assegure-se que a largura de banda de excitação é menor do que 3.600 Hz para evitar a excitação do isoflurano em conjunto com as células ou partículas de 19 F-etiquetados. A freqüência básica deve ser definido corretamente no sinal gerado pelos 19 células F-marcadas. Alternativamente, outro método de anestesia pode ser usado como o experimentador entender. </li><li> Clone (duplicado) o protocolo TurboRARE 3D a partir do anterior 1 H digitalização. Vá em Edit Método e desmarque o ganho de referência automático (como acima). Set 19 F núcleo de edição de digitalização. Mudar a matriz de 128x64x64ea RARE-Factor, pelo menos, 40 (até 64). Para uma TR / TE 1000/6 ms e 64 médias, o tempo de verificação é de aproximadamente 70 min. Defina o ganho do receptor para 101 (caixa de ferramentas) e iniciar a digitalização sem quaisquer ajustes usando GOP (ir gasoduto). </li><li> Quando os exames terminar retrair o titular do mouse a partir do scanner MR. Desligue o rato cuidadosamente do titular. Se o mouse não é sacrificado para análise ex vivo (por exemplo, histologia ou espectroscopia, veja abaixo) diretamente após as medidas de RM, acompanhar de perto até que ele esteja completamente recuperado da anestesia. Regulação da temperatura corporal é afetada pela anestesia, por isso durante o processo de recuperação, coloque o rato em uma gaiola separada, que é colocada sobre uma almofada de temperatura regulada quente. Uma vez que o mouse esteja completamente recuperado da anestesia, devolvê-lo à sua gaiola exploração e à sala do animal. </li><li> Para sobrepor as imagens para 19 F 1 imagens H, utilize o Menu Exibir oPÇÃO no mesmo software (Paravison). A função Underlay pode ser encontrado em Correlacionar. Salve o underlay, carregue a nova imagem e destacar a camada de 19 F, definindo uma nova cor a partir do olhar para cima da tabela. A discriminar entre os 19 e F 1 H scans, alterar o limite para a cor escolhida (corte Olhe para cima de mesa) de tal forma que o sinal de 19 F terá a cor escolhida ea imagem H fundo uma permanecerão em escala de cinza. Outros programas de pós-processamento (por exemplo, ImageJ) estão disponíveis para criar as 1 h / 19 F sobreposições de imagem. </li><li> No caso de uma quantificação em vivo do sinal 19F ser necessário, seguir um protocolo quantitativa simples como anteriormente descrito 15,16. Em resumo, a quantificação pode ser feita através da colocação de um tubo de referência com uma concentração conhecida de PFCE-emulsão no FOV lado do rato. Depois de adquirir as imagens MR, quantificar as intensidades dos sinais de F-19, utilizando região de interesse análise (ROI) e comparar com a curva de calibração in vitro, como mostrado na Figura 2. </li></ol> 5. Linfonodo Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS) <ol><li> Depois de sacrificar o mouse, remova o linfonodo poplíteo e coloque em um pequeno tubo NMR 5 mm e adicionar 100 ml de 2% PFA. </li><li> Instalar uma bobina de espectroscopia de 19 F (por exemplo uma bobina toroidal), que tem uma abertura de pelo menos 5 mm, para segurar o tubo de RMN contendo o nódulo linfático. </li><li> Colocar o tubo de NMR no interior da bobina e mover a bobina ao isocentro do magneto. </li><li> Ajustar a bobina de RF com a frequência de ressonância 19F (376,3 MHz, por exemplo, para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão de sinal erecepção. </li><li> Defina todos os parâmetros de correção dentro do Toolbox calçar a 0 e pressione aplicar. Normalmente, não é necessário aplicar métodos shimming vez que o volume da amostra é relativamente pequena. Se um sinal 19 F suficiente estiver disponível, os métodos automatizados pode ser aplicada para calçar, a frequência do sistema e o ganho do receptor, conforme descrito acima. </li><li> Carregar uma única sequência de impulsos FID com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir o núcleo de 19 F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas. Defina o número de médias a 1. </li><li> Comece a seqüência usando GSP. Se o sinal espectral 19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante), até que um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica de modo que o 19 F SPEpico ctral está no centro da janela de aquisição a 0 Hz e aplicar frequência de base. Ajustar o pulso atenuador de novo para maximizar o sinal, para alcançar 90 ° excitação. Quando o sinal é na Parada máximo de imprensa. </li><li> Definir as médias no Método Editar entre 64 e 256 (ou mais, se necessário, dependendo do sinal) e de iniciar a aquisição usando GOP. O sinal detectado correlaciona linearmente com o número de médias. Durante quantificação ter em mente que o sinal detectado deve ser normalizada para uma média. Além disso, é necessário calcular o número de células a partir do sinal normalizado 19 F (figura 2) um padrão de concentração conhecida de um ou de uma curva de calibração de calibração. </li><li> Uma vez que a verificação for concluída, remova a amostra, coloque a próxima amostra e prosseguir com o passo 5.3. </li></ol>

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<li>Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenically+cooled+probes+-+a+leap+in+NMR+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Cryogenically cooled probes - a leap in NMR technology.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).</li>
<li>Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796(2012).</li>
<li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaacke%2C+EM+%22Magnetic+resonance+imaging+physical+principles+and+sequence+design%22">Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design</a>. , John Wiley & Sons. (1999).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este método de empregar 19 F / 1 H MRI para seguir o movimento de CC no nó de linfa dá a oportunidade de estudar os padrões de migração de células imunitárias in vivo. As células dendríticas são excelentes exemplos de rápida migração de células do sistema imunológico que são capazes de manobrar através de estruturas tridimensionais sem fortemente aderidos a substratos específicos 17. Embora a resolução espacial baixa (gama im) da técnica descrita não é comparável com a que pode ...

O rastreamento de células in vivo é um aspecto crucial em vários campos da biomedicina. Para isso, as técnicas de imagem não invasivas, que pode selectivamente células localizam ao longo de um período de tempo são extremamente valiosos. Antes do desenvolvimento de tridimensional ressonância magnética (IRM), o seguimento da migração de células imunitárias foi limitado a análises microscópicas ou biópsias de tecidos. Rastreamento celular com a ajuda da ressonância magnética ganhou imensa atenção nos últimos anos, não só para estudar o comportamento de células imunologistas imune in vivo, mas também para investigadores clínicos e de células estaminais. Durante meados dos anos 90, os primeiros estudos sobre as nanopartículas de óxido de ferro 1 iniciada uma cascata de acontecimentos para as células de rastreamento com ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro reduzir o tempo de relaxamento MR (T2 *) das células marcadas e, assim, causar depleção de sinal em imagens por ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro têm sido empregadas para rotular macrófagos 2, oligodendrocyte progenitors 3 e muitos outros tipos de células. Algumas destas partículas também têm sido clinicamente aprovado pela FDA para a rotulagem de vacinas celulares em pacientes com melanoma 4. Desde in vivo ou ex vivo de células rotulagem com partículas de óxido de ferro se baseia em um encurtamento do sinal T2 *, a qual pode ser também provocada por in vivo relacionados com susceptibilidade T2 * efeitos, tais como micro-hemorragias, depósitos de ferro ou bolhas de ar, pode ser difícil de identificar células marcadas in vivo a partir de outro fundo T2 * extinções de sinal 5. Neste artigo, descreve uma técnica para rastrear as células dendríticas (DC), in vivo, através do emprego de 19 F / 1 A imagiologia por ressonância magnética (MRI). Esta tecnologia de rastreamento de celular só foi introduzido em 2005, 6 anos após as primeiras aplicações reconhecidas para 19 F em MRI foram notificados 7. Uma adva importantentage de 19 F sobre óxido de ferro marcação celular partícula é a baixa ocorrência biológica de 19 F no tecido, o que torna possível rastrear células muito seletiva com imagens, basicamente, background-livres. Além disso, é possível sobrepor a F sinal MR 19 a partir de células marcadas transplantados com imagens anatómicas obtidas a partir de ressonância magnética convencional 1H. 19F / 1 H RM é, assim, bastante relevante para os estudos que investigam a migração de células in vivo. As células estudadas com este método são etiquetados com 19-F de partículas ricas. Perfluorocarbonetos sinteticamente derivados (PFC) que consistem principalmente de carbono e átomos de flúor são normalmente usados ​​para preparar as partículas. Estes compostos são insolúveis em água e devem ser emulsionados antes da aplicação in vitro ou in vivo. O tamanho habitual das partículas do PFC que tenham sido utilizados por outros grupos para in vivo de 19 experiências de acompanhamento F-RMvaria entre 100 nm e 245 nm 6,8-10. Temos, porém, que a eficiência de marcação das células dendríticas com perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas aumenta com o aumento do tamanho de partícula (&gt; 560 nm) 11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos</td><td>Charles River, Berlim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Perfluoro-15-coroa-5-éter </td><td>ChemPur</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Pluronic F-68 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>(35 x 10 mm)</td><td>VWR, Alemanha</td><td>391-1996</td><td></td></tr><tr><td>27 &frac12; G syringes</td><td>VWR, Alemanha</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de nylon (100 &mu; m mesh) </td><td>VWR, Alemanha</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de RMN </td><td>VWR, Alemanha</td><td>634-0461</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>FST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora </td><td>Aglutinante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de RM para pequenos animais</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td>9.4T BioSpec 94/20 USR, Software de Aquisição e Processamento ParaVision</td></tr><tr><td>1H/19F bobina RF de volume duplo ajustável </td><td>Rapid Biomed, W&#252; rzburg, Alemanha</td><td></td><td>35 mm de diâmetro interno, 50 mm de comprimento</td></tr><tr><td>19F bobina de espectroscopia </td><td>bobina de loop de</td><td>tune/match interna, 4 voltas, diâmetro interno 5 mm, 10 mm de comprimento, dois capacitores para sintonizar e combinar</td>o sistema de inalação de Isoflurano F&#246;<td></td></tr><tr><td></td><td> hr Medical Instruments GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de monitoramento de animais Modelo 1025</td><td>SA Instruments Inc., Nova York, EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento da migração de células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; f /<sup&gt; 1</sup&gt; h ressonância magnética

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Avanços contínuos nos métodos de imagem não invasivos, como a ressonância magnética (RM) tem melhorado muito a nossa capacidade de estudar os processos fisiológicos ou patológicos em organismos vivos. MRI também está provando ser uma ferramenta valiosa para capturar células transplantadas in vivo. Estratégias de rotulagem de células iniciais para utilização de agentes de contraste de MRI que influenciam os tempos de relaxação de RM (T1, T2, T2 *) e conduzem a um acessório (T1) ou depleção (T2 *) do sinal onde células marcadas estão presentes. T2 * agentes de melhoramento tais como ultrasmall agentes de óxido de ferro (USPIO) foram utilizados para estudar a migração de células e alguns têm sido aprovados pela FDA para uso clínico. A desvantagem de T2 * agentes é a dificuldade de distinguir a extinção do sinal criado pelas células rotuladas de outros artefatos, como coágulos de sangue, micro hemorragias ou bolhas de ar. Neste artigo, descrevemos uma técnica emergente para as células de monitoramento in vivo quebaseia-se na marcação das células com flúor (19F) ricos em partículas. Estas partículas são preparadas por emulsão de perfluorocarbono compostos (PFC) e, em seguida, utilizado para as células de etiqueta, que, posteriormente, pode ser visualizada, por 19 F RM. Vantagens importantes de PFC para o rastreamento de células in vivo incluem (i) a ausência de carbono ligado a 19 C, in vivo, o que proporciona então as imagens de fundo e livres de células completo selectivityand (ii) a possibilidade de quantificar o sinal de células por 19 F MR espectroscopia .

Dezoito de 21 horas após a aplicação intradérmica, 19 células dendríticas F-rotulada (DC) migram para o nó de linfa poplíteos de drenagem. O movimento de CC através dos canais linfáticos para o nó de linfa de drenagem politeal pode ser apreciado por sobrepondo as imagens anatómicas H 1 com as imagens DC 19 F (Figura 2A). Temos anteriormente relatado na migração dessas células in vivo, bem como o impacto de 19 tamanho de partícula em F-CC imunobiologia...

Rastreamento de células usando MRI ganhou notável atenção nos últimos anos. Este protocolo descreve a marcação das células dendríticas com flúor (<sup&gt; 19</sup&gt; Partículas F)-ricos, em aplicação vivo destas células, e acompanhamento do alcance de sua migração para o linfonodo de drenagem com<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H ressonância magnética e<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a migração de células dendríticas para o linfonodo drenante utilizando imagem por ressonância magnética com flúor não invasiva ou RM com flúor, em combinação com a RM convencional por prótons. Isso é alcançado primeiramente preparando células dendríticas derivadas de medula óssea murina e marcando as células totalmente diferenciadas com partículas ricas em flúor. Na segunda etapa, as células marcadas com flúor são administradas por via intra-cutânea nas patas traseiras de um camundongo, garantindo a transmigração eficiente das células administradas.Em seguida, a região anatômica de interesse é imageada por meio de ressonância magnética de flúor e próton para monitorar a migração das células dendríticas da pele até os linfonodos drenantes. Em última análise, a migração das células dendríticas da área de aplicação para o linfonodo drenante pode ser visualizada por ressonância magnética de flúor. A principal vantagem deste método em comparação com outras técnicas de rastreamento celular, como aquelas que requerem nanopartículas de óxido de ferro, é que o flúor ligado ao carbono é virtualmente ausente em todos os organismos vivos.Is

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Bioimaging métodos utilizados para avaliar biodistribuição das células de nanopartículas são aplicáveis ​​para monitorização terapêutica e de diagnóstico de compostos nanoformulated. Os métodos descritos neste documento são sensíveis e específicos, quando avaliada por coregistration histológica. As metodologias de fornecer um caminho de translação de roedores para aplicação em seres humanos.

BioImaging registradas de Nanomateriais para Monitoramento de Diagnóstico e Terapêutica

Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados ​​às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.

Rastreamento de células-tronco mesenchymal rotuladas por óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após parto intranasal em um modelo de urina de urina de lesão cerebral traumática

Este artigo detalha a metodologia para radiomarcação de um anticorpo monoclonal anti-CD19 humano-específico e como usá-lo para quantificar células B no sistema nervoso central e tecidos periféricos de um modelo de esclerose múltipla em camundongos usando imagens PET in vivo, contagem gama ex vivo e abordagens de autorradiografia.

Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

A terapia celular oferece uma intervenção promissora para a fibrose pulmonar usando células progenitoras para reparar tecidos danificados e melhorar a função pulmonar. Como a imagem desempenha um papel fundamental no rastreamento da integração celular, descrevemos o rastreamento in vivo guiado por imagens de partículas magnéticas da terapia celular para fibrose pulmonar em um modelo de camundongo.

Rastreamento in vivo guiado por imagem de células progenitoras epiteliais pulmonares distais transplantadas para fibrose pulmonar usando imagens de partículas magnéticas

Aprenda a rastrear a migração de células dendríticas para linfonodos usando ressonância magnética de flúor e prótons em camundongos. Este método não invasivo oferece imagens sem ruído de fundo.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando

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