Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando ¹⁹ F / ¹ H Ressonância Magnética

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a migração de células dendríticas para o linfonodo de drenagem usando ressonância magnética de flúor não invasiva ou ressonância magnética em combinação com ressonância magnética de prótons convencional. Isso é conseguido preparando primeiro as células dendríticas derivadas da medula óssea murina e marcando as células totalmente diferenciadas com partículas ricas em flúor. Durante a segunda etapa, as células marcadas com flúor são administradas intracutâneas nos membros posteriores de um camundongo, garantindo a transmigração eficiente das células administradas.

Em seguida, a região anatômica de interesse é visualizada por flúor, ressonância magnética de prótons, para monitorar a migração das células dendríticas da pele para os linfonodos de drenagem. Em última análise, a migração de células dendríticas da área de aplicação para o linfonodo de drenagem pode ser visualizada por ressonância magnética com flúor. A principal vantagem deste método sobre outras técnicas de rastreamento celular, como aquelas que requerem nanopartículas de óxido de ferro, é que o piso ligado ao carbono está praticamente ausente em todos os organismos vivos.

Isso produz imagens completas sem fundo e uma seletividade celular completa após a aplicação de células marcadas com flúor in vivo. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da imunologia, como qual é a influência dos candidatos moleculares na migração de células dendríticas in vivo. Demonstrando o método está Yulia Kovski técnica e Helma VIIs, uma cientista sênior do meu laboratório No dia 10 da cultura de células dendríticas da medula óssea.

Ative as células dendríticas com LPS por 24 horas. Rotule as células dendríticas com um milimolar rico em flúor por fluor 15 coroa cinco partículas de éter durante esse período também, para confirmar que as células dendríticas foram marcadas com sucesso, verifique as características físico-químicas das células usando citometria de fluxo. As células marcadas com flúor são mostradas aqui como eventos vermelhos no gráfico de dispersão direta e lateral e as células não marcadas são mostradas como eventos azuis.

Em seguida, posicione-se um camundongo C 57 preto de seis em um suporte e, em seguida, carregue uma seringa de tuberculina de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 26 e meio com células dendríticas marcadas com fluorescência em um volume de 50 a 100 microlitros. Agora insira cuidadosamente a agulha nas camadas superiores da pele em cada um dos membros posteriores do animal para administrar as células. Após anestesiar o rato, posicione o animal de bruços na cama do rato do scanner de ressonância magnética de pequenos animais.

Depois de prender o animal no suporte de imagem e nas conexões com o sistema de monitoramento, mova o suporte para o centro da bobina de RF de flúor de prótons para confirmar o posicionamento correto do animal e do scanner. E posterior planejamento da geometria da fatia da imagem. Adquira imagens de reconhecimento em três orientações padrão usando métodos de aquisição de imagem de resolução rápida e baixa no software MR Scanner.

Sintonize a bobina de RF para a frequência de ressonância do próton e para a frequência de ressonância do flúor. Use o monitor de sintonia do scanner MR animal para combinar a impedância característica da bobina com 50 ohms. Em seguida, defina as configurações automáticas necessárias do sistema, incluindo calços para ajustar a homogeneidade dos ajustes de frequência do sistema de campo magnético para ajustar o RF à frequência LA específica do sistema de RM para prótons e ganho de referência.

Para ajustar a amplitude de RF, configure um protocolo 3D turbo raro para a varredura de prótons, usando um TR de 1500 milissegundos e TE de 53 milissegundos, uma matriz de 400 por 200 por 200 e um fator raro de 16. Ajuste o campo de visão com a ajuda das imagens do batedor. Em seguida, inicie a verificação.

Carregue uma única sequência FID de pulso com o TR de pelo menos 1000 milissegundos e, em seguida, abra a varredura de edição e defina o núcleo para flúor no método de edição da caixa de ferramentas. Desmarque o ganho de referência automático usando a configuração go. Inicie a medição sem registrar os dados para exibir um sinal de RM em tempo real.

Ajuste a frequência básica para centralizar o pico espectral de flúor em zero hertz na janela de aquisição. Em seguida, selecione, aplique a frequência básica e pressione parar agora. Clone o protocolo 3D turbo raro da varredura de prótons anterior.

Vá para o método de edição e desmarque o ganho de referência automático, conforme mostrado na verificação de edição. Defina o núcleo de flúor e altere a matriz para 1 28 por 64 por 64 e o fator raro para pelo menos 40. Quando as digitalizações forem concluídas, retraia o suporte do mouse do scanner de RM e use o menu de visualização para sobrepor as imagens de flúor às imagens de prótons.

Depois de sacrificar o camundongo, remova o linfonodo popal de interesse e coloque-o em um tubo de RMN de cinco milímetros contendo 100 microlitros de 2% de PFA. Em seguida, coloque o tubo dentro de uma bobina de espectroscopia de flúor e mova a bobina para o centro ISO do ímã. Sintonize a bobina de RF para a frequência de ressonância do flúor e, em seguida, no monitor de sintonia do scanner de ressonância magnética animal, combine a impedância característica da bobina com 50 ohms dentro da caixa de ferramentas de calço.

Defina todos os parâmetros de calço para zero e pressione aplicar. Em seguida, carregue uma única sequência FID de pulso com um TR de pelo menos 1000 milissegundos. Abra a digitalização de edição e defina o núcleo para flúor.

Agora, usando a configuração go, inicie a sequência, ajuste a frequência básica para que o pico espectral do flúor fique no centro da janela de aquisição em zero hertz e aplique a frequência básica. Em seguida, ajuste o atenuador de pulso novamente para maximizar o sinal para atingir 90 graus de excitação. Quando o sinal estiver no máximo, pressione parar.

Finalmente, no método de edição, defina as médias entre 64 e 256 dependendo do sinal e, em seguida, usando o pipeline go. Inicie a aquisição 18 a 21 horas após a aplicação intracutânea. As células dendríticas marcadas com flúor migram para o linfonodo popal de drenagem.

O movimento das células dendríticas através dos ductos linfáticos para o linfonodo público de drenagem pode ser apreciado sobrepondo as imagens anatômicas de prótons com as células dendríticas de flúor. Imagens, as células dendríticas são mostradas como um MR de flúor. Sinal em vermelho, enquanto os linfonodos e ductos linfáticos são mostrados na imagem anatômica de prótons em escala de cinza. A fim de quantificar a extensão da migração de células dendríticas para os linfonodos de drenagem, os gânglios linfáticos são extraídos e a MRS de flúor é realizada como demonstrado quando o sinal de flúor obtido de cada linfonodo é comparado com o sinal de flúor obtido de diferentes números de células dendríticas marcadas com cinco partículas de éter por coroa de flúor 15, conforme ilustrado por esta curva de calibração, O número de células dendríticas marcadas com flúor que atingem o linfonodo de drenagem pode ser deduzido para este experimento representativo.

Pode-se estimar que 7,5 vezes 10 elevado ao quarto dendrítico células que não foram carregadas com antígeno atingiram o linfonodo esquerdo, enquanto 3,6 vezes 10 elevado ao quinto antígeno carregado Embora isso possa fornecer informações sobre os mecanismos moleculares da migração de células imunes durante condições normais, também pode ser usado em modelos animais, como os de doenças autoimunes. Além disso, as implicações dessa técnica se estendem ao campo da terapia do câncer.

Quaisquer alvos moleculares identificados podem ser usados para manipular células dendríticas para terapia tumoral.