Name: Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a isolar miofibras esqueléticas de embriões e larvas de zebrafish para análise detalhada da morfologia e localização de proteínas musculares. Este método permite estudos de fisiologia muscular com maior resolução.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer) que contribuíram para o desenvolvimento da técnica e da produção do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Taubman, do Departamento de Pediatria da Universidade de Michigan, e em parte, de doações da Associação de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) e os Institutos Nacionais de Saúde (JJD 1K08AR054835).

1. Preparação de poli-L-lisina revestido Lamelas (Tempo: 1 hora) Lamelas de revestimento permite a rápida colonização myofiber e aderência. Isto pode ser realizado durante o passo de dissociação do isolamento de células musculares (passo 2 abaixo). <ol><li> Cortar e colocar Parafilm na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm (qualquer marca). </li><li> Coloque deslizamentos de vidro da tampa do microscópio (12 mm de diâmetro) em Parafilm em um 60 milímetros de cultura de tecidos prato ou colocá-los individualmente em poços individuais de placas de 24 poços. </li></ol> Nota 1: Estas pequenas lamelas redondas ajudam a concentrar myofiber números e reduzir o excesso de uso de anticorpos. Nota 2: Outras lamelas tamanho vai funcionar, no entanto, os volumes de reagentes e embriões utilizados deverão ser ajustados em conformidade. <ol start="3"><li> Pipeta de 50-200 ul de solução de poli-L-lisina (0,01%) em cada tampa de vidro numa placa de Petri. </li><li> Permitir as lamelas de sentar-se pelo menos um hour a 37 ° C. Incubações mais longas não vai influenciar negativamente os resultados. </li><li> Remove-poli-L-lisina solução da tampa de vidro e lavar duas vezes com um mínimo de 100 l 1x PBS. </li><li> Permitir lamelas secar. </li><li> Lamelas está agora pronto para miofibras. </li></ol> Nota 3: A fim de garantir a esterilidade, o revestimento pode ser feito de um capô e em lamelas autoclavados. Nota 4: Mantenha a placa de Petri de 60 mm e Parafilm na parte inferior. Esta configuração será usada durante myofiber revestimento e imunomarcação (posteriores passos). Alternativa 1: Em vez de lamelas de revestimento imediatamente antes da utilização, um estoque lamela revestida pode ser utilizado. Um prato de 60 milímetros de Petri contendo um mínimo de 2 ml de poli-L-lisina pode ser armazenado a 4 ° C contendo numerosas lamelas. Com esta alternativa começar no passo 1.5 para processar as lamelas de miofibras. Alternativa 2: Também lamelas de casaco em poli-L-ornitina. To é mais trabalhosa, mas é útil para a cultura de longo prazo, porque lamelas revestidas com poli-L-ornitina pode ser tratado UV. Com o tratamento UV e técnica estéril cuidado myofibers ao vivo geralmente pode ser mantidas em cultura 4-7 dias. 2. A dissociação de embriões Zebrafish e chapeamento de fibras musculares (Tempo: 1 a 3 hr) Nota: o protocolo padrão se aplica melhor a 3 dpf (dias após a fertilização) Embriões. <ol><li> Transferência de embriões de peixes-zebra em um tubo de centrífuga de 1,5 ml padrão e remover o máximo de água de peixe possível. Tipicamente, pode ser utilizada 10-20 embriões por tubo, embora menos. Usando mais do que 20-25 embriões muitas vezes resulta numa preparação de densidade excessiva. <ol><li> Retirar córions antes da dissociação, utilizando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, a remoção do cório químico é conseguido através de um tratamento de 10-15 min com Pronase. Normalmente, a remoção prévia do córion só é necessária quando a confirmação prévia de um mutÉ necessário fenótipo formiga ou morfologia, ou quando usar estágios em que os embriões são naturalmente chocado de seu córion. </li></ol></li><li> Adicionar 900 ul de CO 2 meios independentes para o tubo contendo os embriões. </li><li> Adicionar 100 ul de colagenase tipo II, concentração final de 3,125 mg / ml (solução de colagenase a 31,25 mg / mL diluído em PBS 1x), para começar a dissociação. Colagenase IV também pode ser utilizado para a dissociação. </li><li> Rode embriões num agitador orbital, e tritura-se a cada 30 min em temperatura ambiente usando um P1000 Pipetman para a trituração. </li></ol> Nota 2: Acompanhar atentamente dissociação embrião; sobre ou sob a dissociação (especialmente over) são as razões mais comuns para a falha de protocolo. Os tempos para a digestão irá variar dependendo da intensidade de trituração, o número de embriões por tubo, e idade dos embriões. É também muitas vezes menos (em comparação com os tipos selvagens) para embriões de mutantes do músculo esquelético. Nota3: tempo de digestão médio por idade embrião: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 hr, 3 dpf = 2 horas e 4 dpf = 2-2,5 horas. <ol start="5"><li> Pare de digestão quando há embriões inteiros são visíveis, mas pedaços sólidos ainda são visíveis - isto é essencial para prevenir overdigestion. </li><li> Tubos de centrífuga com embriões dissociadas em 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos para as células de pelotas. </li><li> Remover o sobrenadante de células peletizadas e lavar 2x com CO 2 a mídia independente. </li><li> Adicionar fresco CO 2 mídia independente para ressuspender as células. 1 ml é normalmente usado para preparações de 10-20 embriões. O volume pode ser dimensionado com base no número de embriões. </li><li> Usando uma pipeta P1000, passar a suspensão através de um filtro de embriões de 70 mM. Isso ajuda a remover os resíduos indesejáveis ​​do prep. </li></ol> Nota 4: suspensão de embriões pode ser filtrado uma segunda vez, através de um filtro de 40 um para remover mais restos não desejados. A partir de uma dupla filtração, a recuperação é approximdiatamente 800 mL de um volume inicial de 1 ml. <ol start="10"><li> Adicionar cerca de 50-100 ul de suspensão de células musculares para cada lamela revestida com poli-L-lisina. </li></ol> Nota 5: Execute o passo 2.9 em placas de Petri com Parafilm no fundo, previamente preparado. O Parafilm mantém a suspensão de células musculares de correr as lamelas revestidas. Manter placas de Petri cobertas para evitar a evaporação. <ol start="11"><li> Permitir myofibers para resolver aproximadamente 1 hora para as lamelas revestidas à temperatura ambiente. </li></ol> Nota 6: fibras musculares começam a se estabelecer dentro de 5-10 min. No entanto, para uma boa pega myofiber, recomenda-se um mínimo de 1 hora (1-2 h). Permitindo myofibers que se contentar com mais tempo não irá prejudicar a preparação. Para incubações mais longos (incluindo durante a noite), os antibióticos podem ser adicionados aos meios de comunicação. Com antibióticos e técnica estéril culturas vivas geralmente pode ser mantida por 1-2 dias. <ol start="12"><li> Vivo myofibers pode ser observado neste ponto. Miofibras a partir de embriões 2 dpf e mais tarde será visto como células alongadas e estriadas (Figura 1). Neste ponto, myofibers agora está pronto para análise ao vivo ou por imunomarcação. </li></ol> Nota 7: O músculo esquelético a partir de 1 dpf embriões não placa fibras como alongados e claramente estriados. Em vez disso, grandes myoballs são visíveis. Além disso, durante a fase de granulação de pós de dissociação (passo 2.6), um dpf myoballs precisam de ser centrifugada durante um mínimo de 8 minutos a 5.000 xg, para atingir um sedimento. Para a análise de embriões, nesta fase, recomenda-se usar a linha transgénica que expressa EGFP especificamente no músculo esquelético 23. Isto irá permitir a identificação de células de origem muscular versus outras fontes. 3. Fluorescência imunocoloração de dissociadas Zebrafish miofibras (Tempo: cerca de 1 dia) 3.1. Imunomarcação <ol><li> Retire uma porçãomedia de fibras musculares aderidas à lamela revestido </li><li> Fix células usando 4% de paraformaldeído ou metanol. Para PFA, retire ½ o volume de mídia e substituir com a mesma quantidade de PFA. Correção para 10 min à temperatura ambiente, em seguida, remova volume total, substitua por 50-100 mL de PFA, e corrigi por mais 10 min. Para a fixação de álcool, metanol arrefecido em gelo ou acetona pode ser aplicado a 4 ° C durante 10 minutos ou 5 minutos, respectivamente. </li><li> Lavar miofibras, pelo menos, 3-5x com PBS 1x ou 1x PBS mais 0,1% de Tween. O volume médio de lavagem é 50-100 mL por lamela. </li><li> Adicionar solução para miofibras (trabalhando estoque) de bloqueio e incubar 20-60 minutos em temperatura ambiente. A solução de bloqueio irá variar dependendo dos anticorpos primários e secundários. Os dois mais comuns usadas no laboratório são: (1) PBS 1x, 2 mg / ml de BSA, 1% de soro de ovelha, 0,25% de Triton X-100 final e (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) e 5% de soro de ovelha / cabra. </li><li> Remova a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído em qualquer bsolução ou PBS bloqueio. Incubar miofibras durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de ambos os Parafilm ou embrulhe em Saran Wrap placa de Petri contendo as lamelas carregados de fibra muscular revestidas com anticorpos. Pequenos pedaços de toalha de papel humedecido pode ser adicionado para criar uma câmara humidificada. </li><li> Remover o anticorpo primário e lava-se a partir de lamelas lamelas de 3-5x durante 5 minutos com PBS ou solução de bloqueio. </li><li> Adicionar anticorpo secundário na concentração adequada diluída em 1x PBS ou solução de bloqueio durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo secundário e lava-miofibras 3-5x em PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li></ol> 3.2. Lamelas de montagem <ol start="9"><li> Aplicar 1-2 gotas de reagente antifade a uma lâmina de microscópio. </li><li> Cuidadosamente pick-up a lamela revestido e immunolabled usando uma pinça e lugar (myofibers para baixo) a lamela sobre o reagente antifade na lâmina de microscópio. </li></ol> Nota 1: Atenção para a orientação do clamela oated é crítica. <ol start="11"><li> Coloque 1-2 Kimwipes sobre uma superfície sólida duro. Inverter rapidamente o slide com as lamelas revestidas descansando sobre o reagente antifade e colocá-lo (lamela para baixo) na Kimwipes. </li><li> Aplicar uma leve pressão para os cantos da lâmina de microscópio para remover o excesso de Antifade e formar uma vedação estanque entre a lâmina e lamela </li><li> Permitir a Antifade restante secar durante 5-10 min à temperatura ambiente, em seguida, as fibras musculares estão prontos para a imagem (Figuras 2A e B) ou armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Vivo celular Imagem de cálcio Usando GCaMP3 Experiências de células vivas pode ser realizada em miofibras antes da fixação (passo seguintes 2.10). O protocolo seguinte descreve a imagem ao vivo em miofibras expressando GCaMP3 24, um indicador de cálcio geneticamente codificado, expressa pelo específica zebrafish actina-α promotor músculo esquelético (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica pode ser facilmente adaptado para utilizar corantes indicadores de cálcio tais como o Fura-2. <ol><li> Injetar embriões com pSKM: GCaMP3 construir na fase 1-2 celular </li><li> Aos 3 dpf, coletar as larvas e preparam myofibers conforme descrito nas seções 1 e 2. Permitir miofibras-se aderir durante um período mínimo de 1 hora. Para esta técnica, que se preparam lamelas em pratos de 24 poços, é necessária. </li><li> Remova cuidadosamente qualquer excesso de mídia, e adicionar 300 ml de CO 2 mídia independente fresco à temperatura ambiente. </li><li> Observar células sob um microscópio invertido. GCaMP3 myofibers positivos deve ser visível sob fluorescência verde. </li><li> Configure câmera para a gravação, se desejar. </li><li> Prepare uma solução de cafeína 30 mM em CO 2 mídia independente. Para estimular as células, Pipeta suavemente 300 ml de solução de cafeína para o bem sob ampliação. Dentro 5-10 seg, GCaMP miofibras positivas deve responder a cafeína com um aumento rápido na fluorescência (Figura 3). Myofibers também podem contrair. De nota, a cafeína induz a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático das lojas 25. Outros agentes, tais como KCl 26 e ryanodine 4, pode ser usado para estudar liberação induzida de cálcio. </li></ol>

<ol><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li>
<li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+myoplasmic+gap%3A+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li>
<li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Nerve%22%5BJournal%5D)">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li>
<li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%3A+structure%2C+expression%2C+molecular+details%2C+and+function+in+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity%3A+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystroglycan%3A+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li>
<li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li>
<li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li>
<li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Zebrafish+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease%3B+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li>
<li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling%2C+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li>
<li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene%2C+CACNB1%2C+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li>
<li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((accordion%2C+a+zebrafish+behavioral+mutant%2C+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2%2B+pump+SERCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li>
<li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Zebrafish são um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento muscular e função in vivo 25,27,28. Eles também têm emergido como um recurso valioso para a modelagem de doenças musculares humanos 14,15,20,29. Enquanto grandes avanços têm sido tomadas para promover o uso e aplicação de peixe-zebra para o estudo da função muscular e doença muscular, há uma necessidade crítica constante para desenvolver ferramentas que permitem análise mais aprofundada que complementa a ...

O músculo esquelético é um tecido altamente especializado responsável por gerar as forças necessárias para a motilidade contráteis. A contração é iniciada através de um processo conhecido como excitação-contração (CE) acoplamento que converte os sinais elétricos para liberação de cálcio dos estoques intracelulares 1,2. Liberação de cálcio intracelular ativa o sarcômero para encurtar e gerar força. Os vários componentes específicos do maquinário molecular responsável por mediar a transmissão junção neuromuscular 3, acoplamento CE 4,5 e actina e miosina contrações dependentes 6 continuam a ser objecto de investigação em curso intenso. Além disso, as proteínas que estabilizam a membrana muscular durante 7,8 contracção e que medeiam a sinalização entre a fibra muscular e da matriz extracelular 7,9 foram identificados e estudados em grande detalhe. As mutações em vários genes importantes para a estrutura de um músculofunção nd foram identificados como causas de doenças do músculo esquelético humano ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Estas doenças, classificadas amplamente como miopatias e distrofias musculares esqueléticas com base em características clínicas e histopatológicas, estão associadas com fraqueza muscular, deficiência ao longo da vida, e 10,11 mortalidade precoce. O peixe-zebra tem provado ser um sistema excelente para modelar e estudar as doenças do músculo esquelético humanos 8,12,13. Ele tem sido empregado para validar as novas mutações genéticas 8, definir novos aspectos da doença fisiopatologia 14,15, e identificar novas abordagens terapêuticas 15,16. A potência do peixe-zebra para o estudo da doença muscular humana refere-se a um grande número de descendentes, o rápido desenvolvimento da estrutura muscular e na função, a clareza óptica do embrião do peixe-zebra, e a facilidade da manipulação genética e farmacológica da zebra desenvolvimentopeixe 17. Nós e outros 12,18,19 recentemente desenvolvida uma técnica simples para o isolamento rápido e eficiente de miofibras do peixe-zebra desenvolvimento. Esta metodologia permitiu o exame de miofibras em maior detalhe do que pode ser fornecida por análise de embrião inteiro. A técnica tem sido explorada para a caracterização da proteína de localização subcelular 20, bem como para a identificação de características histopatológicas importantes como parte de estudos de validação em modelos de doença recentemente desenvolvidos 21. Além disso, fibras musculares isolados podem ainda ser usado para geração de imagens ao vivo e para estudos eletrofisiológicos 22, técnicas que permitam o interrogatório dos aspectos-chave da função muscular. O protocolo específico para o isolamento de células musculares, junto com dois exemplos de experiências analíticas subseqüentes, é detalhado nas partes restantes deste manuscrito.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Meio independente</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo II</td><td>Worthington</td><td>Bioquímica LS004186</td><td>Lote 41H12764</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Soro de ovelha</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa;-Actinina</td><td>anticorpo Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de desenvolvimento embrionário e larval zebrafish esqueléticos miofibras de preparações dissociadas

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

O peixe-zebra tem provado ser um sistema modelo valioso para explorar a função do músculo esquelético e para o estudo de doenças musculares humanas. Apesar das muitas vantagens oferecidas por análise in vivo de músculo esquelético, no peixe-zebra, visualizando o meio complexo e finamente estruturado proteína responsável pela função muscular, particularmente, em todo o embrião, pode ser problemático. Este impedimento resulta de o pequeno tamanho do músculo esquelético do peixe-zebra (60 mM) e o tamanho ainda menor do sarcómero. Aqui nós descrevemos e demonstrar um método simples e rápido para isolar miofibras esqueléticas a partir de embriões de peixes-zebra e larvas. Nós também incluímos protocolos que ilustram as técnicas de preparação de pós úteis para analisar a estrutura e função muscular. Especificamente, detalhar a localização imunocitoquímica posterior das proteínas do músculo esquelético e da análise qualitativa da liberação de cálcio estimulada através de imagem de cálcio de células vivas. No geral, este vídeoartigo fornece um método direto e eficaz para o isolamento e caracterização de fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra, uma técnica que proporciona um canal para estudos subsequentes miríade de estrutura e função musculares.

Imunomarcação fluorescente de miofibras (Figura 2) As imagens mostram o esperado padrão de marcação fluorescente de miofibras imunocoradas após o isolamento bem sucedido e revestimento. As fibras têm sido marcada ou com anti-receptor de rianodina (1:100) (figura 2A) ou anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B), anticorpos, e revelam imunocoloração da tríade e a banda Z respectivamente. Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluo...

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar de forma eficiente fibras musculares esqueléticas de peixes-zebra em estágios embrionários e larvais. Isso é realizado primeiramente preparando lamínulas revestidas com poli-L-lisina; em seguida, um a quatro dias após a fertilização, embriões de peixe-zebra são dissociados. Então, fibras miológicas isoladas dos embriões dissociados são semeadas nas lamínulas de polilisina.Por fim, as fibras musculares são fixadas, coradas e analisadas por imagem para avaliação das proteínas musculares. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram a localização subcelular de proteínas musculares por meio de microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de embriões inteiros, é que ela permite o estudo da morfologia e fisiologia de fibras musculares individuais com maior detalhe.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área muscular, como aquelas relacionadas à localização proteica subcelular, e pode ser combinado com a imagem de cálcio em células vivas. As implicações desta técnica estendem-se à validação de modelos de peixe-zebra para doenças musculares, pois permite visualizar anormalidades estruturais patognomônicas associadas a doenças humanas. Também pode ser utilizado para ajudar a identificar novos aspectos das doenças musculares.Patogênese Através deste método, é possível obter informações sobre a estrutura e função muscular. Ele também pode ser aplicado a outros estudos, como doenças do músculo esquelético humano. Para se preparar para a dissociação de embriões de peixe-zebra, prepare lamínulas cortando-as e colocando parafina na base de uma placa de Petri de 60 milímetros.Em seguida, coloque lamínulas de vidro sobre o parafina e pipete de 50 a 200 microlitros da solução de polilisina sobre cada lamínula. Incube as lamínulas a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de remover a solução de polilisina e lavá-las duas vezes com 100 microlitros de PBS. Deixe as lamínulas secarem e, em seguida, armazene-as em um recipiente tampado.Para a dissociação de embriões. Transfira embriões de peixe-zebra de 10 a 23 dias pós-fertilização para um tubo de centrífuga padrão de 1,5 mililitro e remova o máximo de água de peixe em excesso possível. Pipete 900 microlitros de meio independente de dióxido de carbono para dentro do tubo.Em seguida, adicione 100 microlitros de colagenase a 3,125 miligramas por mililitro, solução dois ou quatro, para iniciar a dissociação. Incube os embriões em agitador orbital à temperatura ambiente e, a cada 30 minutos, utilize uma pipeta P1000 para pipetar a amostra e evitar digestão excessiva, quando não forem visíveis embriões inteiros, mas ainda houver fragmentos sólidos. Interrompa a reação centrifugando as amostras a 0,8–2,3 Gs durante três a cinco minutos.Remova o sobrenadante e lave duas vezes com meio independente de dióxido de carbono. Passe a suspensão por um filtro de 70 micrômetros para remover detritos, adicionando cerca de 50 a 100 microlitros de suspensão de miófibras a cada lamínula revestida com poli-L-lisina. Deixe as miófibras sedimentarem por uma hora à temperatura ambiente após o fixação e marcação imunológica das miófibras, conforme o protocolo descrito no texto, antes do montagem.Coloque as lamínulas aplicando primeiro uma a duas gotas do reagente Antifa em uma lâmina. Use pinças para levantar cuidadosamente uma lamínula, inverta-a e coloque-a sobre as gotas do reagente antidesvanecimento na lâmina do microscópio. Em seguida, coloque um a dois lenços sobre uma superfície dura e sólida e rapidamente inverta a lâmina sobre os lenços.Aplicar pressão suave aos cantos da lâmina para remover o excesso de reagente Antifa e formar um selo hermético entre a lâmina e a lamínula. Deixar as lâminas secarem por cinco a dez minutos à temperatura ambiente antes da análise microscópica ou armazená-las a quatro graus Celsius. Aqui mostrado, miofibras marcadas imunofluorescentemente contra o receptor anódino e a alfa-actinina revelam o tríade e a zândia, respectivamente.Utilizamos fibras miopáticas isoladas em estudos anteriores para determinar a localização subcelular de proteínas musculares. Para estudar a localização de transgenes quiméricos expressos e definir parâmetros específicos das fibras musculares, incluindo o tamanho. Esta figura demonstra a liberação normal de cálcio induzida por cafeína em fibras miopáticas que expressam o construto PSKM GCaMP três.A técnica descrita no protocolo textual pode ser utilizada para investigar o acoplamento excitação-contração por meio de imagem em tempo real após a realização deste procedimento. Outros métodos, como a imagem de cálcio em tempo real, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: existem defeitos no acoplamento excitação-contração após o seu desenvolvimento? Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de estudos de doenças musculares explorarem estudos de validação de genes recém-identificados associados a doenças musculares e determinarem novos aspectos da patogênese das doenças musculares.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar o FBS leve individual de embriões de peixe-zebra.

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Medições da força pode ser usada para demonstrar as alterações na função muscular, devido ao desenvolvimento, lesões, doença, o tratamento ou a toxicidade química. Neste vídeo, demonstramos um método para medir a força durante uma contração máxima de zebrafish músculos do tronco larval.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

A Análise de Elementos Finitos é uma ferramenta frequentemente usada para investigar o desempenho mecânico de estruturas sob carga. Aqui, aplicamos seu uso para modelar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aprenda a isolar miofibras esqueléticas de embriões e larvas de zebrafish para análise detalhada da morfologia e localização de proteínas musculares. Este método permite estudos de fisiologia muscular com maior resolução.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

Explorar mais vídeos