Name: Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a isolar miofibras esqueléticas de embriões e larvas de zebrafish para análise detalhada da morfologia e localização de proteínas musculares. Este método permite estudos de fisiologia muscular com maior resolução.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer) que contribuíram para o desenvolvimento da técnica e da produção do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Taubman, do Departamento de Pediatria da Universidade de Michigan, e em parte, de doações da Associação de Distrofia Muscular (JJD MDA186999) e os Institutos Nacionais de Saúde (JJD 1K08AR054835).

1. Preparação de poli-L-lisina revestido Lamelas (Tempo: 1 hora) Lamelas de revestimento permite a rápida colonização myofiber e aderência. Isto pode ser realizado durante o passo de dissociação do isolamento de células musculares (passo 2 abaixo). <ol><li> Cortar e colocar Parafilm na parte inferior de uma placa de Petri de 60 mm (qualquer marca). </li><li> Coloque deslizamentos de vidro da tampa do microscópio (12 mm de diâmetro) em Parafilm em um 60 milímetros de cultura de tecidos prato ou colocá-los individualmente em poços individuais de placas de 24 poços. </li></ol> Nota 1: Estas pequenas lamelas redondas ajudam a concentrar myofiber números e reduzir o excesso de uso de anticorpos. Nota 2: Outras lamelas tamanho vai funcionar, no entanto, os volumes de reagentes e embriões utilizados deverão ser ajustados em conformidade. <ol start="3"><li> Pipeta de 50-200 ul de solução de poli-L-lisina (0,01%) em cada tampa de vidro numa placa de Petri. </li><li> Permitir as lamelas de sentar-se pelo menos um hour a 37 ° C. Incubações mais longas não vai influenciar negativamente os resultados. </li><li> Remove-poli-L-lisina solução da tampa de vidro e lavar duas vezes com um mínimo de 100 l 1x PBS. </li><li> Permitir lamelas secar. </li><li> Lamelas está agora pronto para miofibras. </li></ol> Nota 3: A fim de garantir a esterilidade, o revestimento pode ser feito de um capô e em lamelas autoclavados. Nota 4: Mantenha a placa de Petri de 60 mm e Parafilm na parte inferior. Esta configuração será usada durante myofiber revestimento e imunomarcação (posteriores passos). Alternativa 1: Em vez de lamelas de revestimento imediatamente antes da utilização, um estoque lamela revestida pode ser utilizado. Um prato de 60 milímetros de Petri contendo um mínimo de 2 ml de poli-L-lisina pode ser armazenado a 4 ° C contendo numerosas lamelas. Com esta alternativa começar no passo 1.5 para processar as lamelas de miofibras. Alternativa 2: Também lamelas de casaco em poli-L-ornitina. To é mais trabalhosa, mas é útil para a cultura de longo prazo, porque lamelas revestidas com poli-L-ornitina pode ser tratado UV. Com o tratamento UV e técnica estéril cuidado myofibers ao vivo geralmente pode ser mantidas em cultura 4-7 dias. 2. A dissociação de embriões Zebrafish e chapeamento de fibras musculares (Tempo: 1 a 3 hr) Nota: o protocolo padrão se aplica melhor a 3 dpf (dias após a fertilização) Embriões. <ol><li> Transferência de embriões de peixes-zebra em um tubo de centrífuga de 1,5 ml padrão e remover o máximo de água de peixe possível. Tipicamente, pode ser utilizada 10-20 embriões por tubo, embora menos. Usando mais do que 20-25 embriões muitas vezes resulta numa preparação de densidade excessiva. <ol><li> Retirar córions antes da dissociação, utilizando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, a remoção do cório químico é conseguido através de um tratamento de 10-15 min com Pronase. Normalmente, a remoção prévia do córion só é necessária quando a confirmação prévia de um mutÉ necessário fenótipo formiga ou morfologia, ou quando usar estágios em que os embriões são naturalmente chocado de seu córion. </li></ol></li><li> Adicionar 900 ul de CO 2 meios independentes para o tubo contendo os embriões. </li><li> Adicionar 100 ul de colagenase tipo II, concentração final de 3,125 mg / ml (solução de colagenase a 31,25 mg / mL diluído em PBS 1x), para começar a dissociação. Colagenase IV também pode ser utilizado para a dissociação. </li><li> Rode embriões num agitador orbital, e tritura-se a cada 30 min em temperatura ambiente usando um P1000 Pipetman para a trituração. </li></ol> Nota 2: Acompanhar atentamente dissociação embrião; sobre ou sob a dissociação (especialmente over) são as razões mais comuns para a falha de protocolo. Os tempos para a digestão irá variar dependendo da intensidade de trituração, o número de embriões por tubo, e idade dos embriões. É também muitas vezes menos (em comparação com os tipos selvagens) para embriões de mutantes do músculo esquelético. Nota3: tempo de digestão médio por idade embrião: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 hr, 3 dpf = 2 horas e 4 dpf = 2-2,5 horas. <ol start="5"><li> Pare de digestão quando há embriões inteiros são visíveis, mas pedaços sólidos ainda são visíveis - isto é essencial para prevenir overdigestion. </li><li> Tubos de centrífuga com embriões dissociadas em 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos para as células de pelotas. </li><li> Remover o sobrenadante de células peletizadas e lavar 2x com CO 2 a mídia independente. </li><li> Adicionar fresco CO 2 mídia independente para ressuspender as células. 1 ml é normalmente usado para preparações de 10-20 embriões. O volume pode ser dimensionado com base no número de embriões. </li><li> Usando uma pipeta P1000, passar a suspensão através de um filtro de embriões de 70 mM. Isso ajuda a remover os resíduos indesejáveis ​​do prep. </li></ol> Nota 4: suspensão de embriões pode ser filtrado uma segunda vez, através de um filtro de 40 um para remover mais restos não desejados. A partir de uma dupla filtração, a recuperação é approximdiatamente 800 mL de um volume inicial de 1 ml. <ol start="10"><li> Adicionar cerca de 50-100 ul de suspensão de células musculares para cada lamela revestida com poli-L-lisina. </li></ol> Nota 5: Execute o passo 2.9 em placas de Petri com Parafilm no fundo, previamente preparado. O Parafilm mantém a suspensão de células musculares de correr as lamelas revestidas. Manter placas de Petri cobertas para evitar a evaporação. <ol start="11"><li> Permitir myofibers para resolver aproximadamente 1 hora para as lamelas revestidas à temperatura ambiente. </li></ol> Nota 6: fibras musculares começam a se estabelecer dentro de 5-10 min. No entanto, para uma boa pega myofiber, recomenda-se um mínimo de 1 hora (1-2 h). Permitindo myofibers que se contentar com mais tempo não irá prejudicar a preparação. Para incubações mais longos (incluindo durante a noite), os antibióticos podem ser adicionados aos meios de comunicação. Com antibióticos e técnica estéril culturas vivas geralmente pode ser mantida por 1-2 dias. <ol start="12"><li> Vivo myofibers pode ser observado neste ponto. Miofibras a partir de embriões 2 dpf e mais tarde será visto como células alongadas e estriadas (Figura 1). Neste ponto, myofibers agora está pronto para análise ao vivo ou por imunomarcação. </li></ol> Nota 7: O músculo esquelético a partir de 1 dpf embriões não placa fibras como alongados e claramente estriados. Em vez disso, grandes myoballs são visíveis. Além disso, durante a fase de granulação de pós de dissociação (passo 2.6), um dpf myoballs precisam de ser centrifugada durante um mínimo de 8 minutos a 5.000 xg, para atingir um sedimento. Para a análise de embriões, nesta fase, recomenda-se usar a linha transgénica que expressa EGFP especificamente no músculo esquelético 23. Isto irá permitir a identificação de células de origem muscular versus outras fontes. 3. Fluorescência imunocoloração de dissociadas Zebrafish miofibras (Tempo: cerca de 1 dia) 3.1. Imunomarcação <ol><li> Retire uma porçãomedia de fibras musculares aderidas à lamela revestido </li><li> Fix células usando 4% de paraformaldeído ou metanol. Para PFA, retire ½ o volume de mídia e substituir com a mesma quantidade de PFA. Correção para 10 min à temperatura ambiente, em seguida, remova volume total, substitua por 50-100 mL de PFA, e corrigi por mais 10 min. Para a fixação de álcool, metanol arrefecido em gelo ou acetona pode ser aplicado a 4 ° C durante 10 minutos ou 5 minutos, respectivamente. </li><li> Lavar miofibras, pelo menos, 3-5x com PBS 1x ou 1x PBS mais 0,1% de Tween. O volume médio de lavagem é 50-100 mL por lamela. </li><li> Adicionar solução para miofibras (trabalhando estoque) de bloqueio e incubar 20-60 minutos em temperatura ambiente. A solução de bloqueio irá variar dependendo dos anticorpos primários e secundários. Os dois mais comuns usadas no laboratório são: (1) PBS 1x, 2 mg / ml de BSA, 1% de soro de ovelha, 0,25% de Triton X-100 final e (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) e 5% de soro de ovelha / cabra. </li><li> Remova a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário diluído em qualquer bsolução ou PBS bloqueio. Incubar miofibras durante a noite a 4 ° C. Certifique-se de ambos os Parafilm ou embrulhe em Saran Wrap placa de Petri contendo as lamelas carregados de fibra muscular revestidas com anticorpos. Pequenos pedaços de toalha de papel humedecido pode ser adicionado para criar uma câmara humidificada. </li><li> Remover o anticorpo primário e lava-se a partir de lamelas lamelas de 3-5x durante 5 minutos com PBS ou solução de bloqueio. </li><li> Adicionar anticorpo secundário na concentração adequada diluída em 1x PBS ou solução de bloqueio durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo secundário e lava-miofibras 3-5x em PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li></ol> 3.2. Lamelas de montagem <ol start="9"><li> Aplicar 1-2 gotas de reagente antifade a uma lâmina de microscópio. </li><li> Cuidadosamente pick-up a lamela revestido e immunolabled usando uma pinça e lugar (myofibers para baixo) a lamela sobre o reagente antifade na lâmina de microscópio. </li></ol> Nota 1: Atenção para a orientação do clamela oated é crítica. <ol start="11"><li> Coloque 1-2 Kimwipes sobre uma superfície sólida duro. Inverter rapidamente o slide com as lamelas revestidas descansando sobre o reagente antifade e colocá-lo (lamela para baixo) na Kimwipes. </li><li> Aplicar uma leve pressão para os cantos da lâmina de microscópio para remover o excesso de Antifade e formar uma vedação estanque entre a lâmina e lamela </li><li> Permitir a Antifade restante secar durante 5-10 min à temperatura ambiente, em seguida, as fibras musculares estão prontos para a imagem (Figuras 2A e B) ou armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Vivo celular Imagem de cálcio Usando GCaMP3 Experiências de células vivas pode ser realizada em miofibras antes da fixação (passo seguintes 2.10). O protocolo seguinte descreve a imagem ao vivo em miofibras expressando GCaMP3 24, um indicador de cálcio geneticamente codificado, expressa pelo específica zebrafish actina-α promotor músculo esquelético (pSKM) 23. Alternativamente,esta técnica pode ser facilmente adaptado para utilizar corantes indicadores de cálcio tais como o Fura-2. <ol><li> Injetar embriões com pSKM: GCaMP3 construir na fase 1-2 celular </li><li> Aos 3 dpf, coletar as larvas e preparam myofibers conforme descrito nas seções 1 e 2. Permitir miofibras-se aderir durante um período mínimo de 1 hora. Para esta técnica, que se preparam lamelas em pratos de 24 poços, é necessária. </li><li> Remova cuidadosamente qualquer excesso de mídia, e adicionar 300 ml de CO 2 mídia independente fresco à temperatura ambiente. </li><li> Observar células sob um microscópio invertido. GCaMP3 myofibers positivos deve ser visível sob fluorescência verde. </li><li> Configure câmera para a gravação, se desejar. </li><li> Prepare uma solução de cafeína 30 mM em CO 2 mídia independente. Para estimular as células, Pipeta suavemente 300 ml de solução de cafeína para o bem sob ampliação. Dentro 5-10 seg, GCaMP miofibras positivas deve responder a cafeína com um aumento rápido na fluorescência (Figura 3). Myofibers também podem contrair. De nota, a cafeína induz a liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático das lojas 25. Outros agentes, tais como KCl 26 e ryanodine 4, pode ser usado para estudar liberação induzida de cálcio. </li></ol>

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<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Zebrafish são um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento muscular e função in vivo 25,27,28. Eles também têm emergido como um recurso valioso para a modelagem de doenças musculares humanos 14,15,20,29. Enquanto grandes avanços têm sido tomadas para promover o uso e aplicação de peixe-zebra para o estudo da função muscular e doença muscular, há uma necessidade crítica constante para desenvolver ferramentas que permitem análise mais aprofundada que complementa a ...

O músculo esquelético é um tecido altamente especializado responsável por gerar as forças necessárias para a motilidade contráteis. A contração é iniciada através de um processo conhecido como excitação-contração (CE) acoplamento que converte os sinais elétricos para liberação de cálcio dos estoques intracelulares 1,2. Liberação de cálcio intracelular ativa o sarcômero para encurtar e gerar força. Os vários componentes específicos do maquinário molecular responsável por mediar a transmissão junção neuromuscular 3, acoplamento CE 4,5 e actina e miosina contrações dependentes 6 continuam a ser objecto de investigação em curso intenso. Além disso, as proteínas que estabilizam a membrana muscular durante 7,8 contracção e que medeiam a sinalização entre a fibra muscular e da matriz extracelular 7,9 foram identificados e estudados em grande detalhe. As mutações em vários genes importantes para a estrutura de um músculofunção nd foram identificados como causas de doenças do músculo esquelético humano ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Estas doenças, classificadas amplamente como miopatias e distrofias musculares esqueléticas com base em características clínicas e histopatológicas, estão associadas com fraqueza muscular, deficiência ao longo da vida, e 10,11 mortalidade precoce. O peixe-zebra tem provado ser um sistema excelente para modelar e estudar as doenças do músculo esquelético humanos 8,12,13. Ele tem sido empregado para validar as novas mutações genéticas 8, definir novos aspectos da doença fisiopatologia 14,15, e identificar novas abordagens terapêuticas 15,16. A potência do peixe-zebra para o estudo da doença muscular humana refere-se a um grande número de descendentes, o rápido desenvolvimento da estrutura muscular e na função, a clareza óptica do embrião do peixe-zebra, e a facilidade da manipulação genética e farmacológica da zebra desenvolvimentopeixe 17. Nós e outros 12,18,19 recentemente desenvolvida uma técnica simples para o isolamento rápido e eficiente de miofibras do peixe-zebra desenvolvimento. Esta metodologia permitiu o exame de miofibras em maior detalhe do que pode ser fornecida por análise de embrião inteiro. A técnica tem sido explorada para a caracterização da proteína de localização subcelular 20, bem como para a identificação de características histopatológicas importantes como parte de estudos de validação em modelos de doença recentemente desenvolvidos 21. Além disso, fibras musculares isolados podem ainda ser usado para geração de imagens ao vivo e para estudos eletrofisiológicos 22, técnicas que permitam o interrogatório dos aspectos-chave da função muscular. O protocolo específico para o isolamento de células musculares, junto com dois exemplos de experiências analíticas subseqüentes, é detalhado nas partes restantes deste manuscrito.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Meio independente</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo II</td><td>Worthington</td><td>Bioquímica LS004186</td><td>Lote 41H12764</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Soro de ovelha</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagente</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa;-Actinina</td><td>anticorpo Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de desenvolvimento embrionário e larval zebrafish esqueléticos miofibras de preparações dissociadas

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

O peixe-zebra tem provado ser um sistema modelo valioso para explorar a função do músculo esquelético e para o estudo de doenças musculares humanas. Apesar das muitas vantagens oferecidas por análise in vivo de músculo esquelético, no peixe-zebra, visualizando o meio complexo e finamente estruturado proteína responsável pela função muscular, particularmente, em todo o embrião, pode ser problemático. Este impedimento resulta de o pequeno tamanho do músculo esquelético do peixe-zebra (60 mM) e o tamanho ainda menor do sarcómero. Aqui nós descrevemos e demonstrar um método simples e rápido para isolar miofibras esqueléticas a partir de embriões de peixes-zebra e larvas. Nós também incluímos protocolos que ilustram as técnicas de preparação de pós úteis para analisar a estrutura e função muscular. Especificamente, detalhar a localização imunocitoquímica posterior das proteínas do músculo esquelético e da análise qualitativa da liberação de cálcio estimulada através de imagem de cálcio de células vivas. No geral, este vídeoartigo fornece um método direto e eficaz para o isolamento e caracterização de fibras musculares esqueléticas de peixe-zebra, uma técnica que proporciona um canal para estudos subsequentes miríade de estrutura e função musculares.

Imunomarcação fluorescente de miofibras (Figura 2) As imagens mostram o esperado padrão de marcação fluorescente de miofibras imunocoradas após o isolamento bem sucedido e revestimento. As fibras têm sido marcada ou com anti-receptor de rianodina (1:100) (figura 2A) ou anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B), anticorpos, e revelam imunocoloração da tríade e a banda Z respectivamente. Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluo...

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar de forma eficiente fibras musculares esqueléticas de peixes-zebra em estágios embrionários e larvais. Isso é realizado primeiramente preparando lamínulas revestidas com poli-L-lisina; em seguida, um a quatro dias após a fertilização, embriões de peixe-zebra são dissociados. Então, fibras miológicas isoladas dos embriões dissociados são semeadas nas lamínulas de polilisina.Por fim, as fibras musculares são fixadas, coradas e analisadas por imagem para avaliação das proteínas musculares. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram a localização subcelular de proteínas musculares por meio de microscopia de imunofluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de embriões inteiros, é que ela permite o estudo da morfologia e fisiologia de fibras musculares individuais com maior detalhe.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área muscular, como aquelas relacionadas à localização proteica subcelular, e pode ser combinado com a imagem de cálcio em células vivas. As implicações desta técnica estendem-se à validação de modelos de peixe-zebra para doenças musc

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Medições da força pode ser usada para demonstrar as alterações na função muscular, devido ao desenvolvimento, lesões, doença, o tratamento ou a toxicidade química. Neste vídeo, demonstramos um método para medir a força durante uma contração máxima de zebrafish músculos do tronco larval.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

O peixe-zebra é um excelente modelo para estudar a função muscular e doenças. Durante o início da embriogênese, o peixe-zebra inicia contrações musculares regulares, produzindo um comportamento rítmico de natação, que é alterado quando o músculo é interrompido. Aqui descrevemos um ensaio de resposta evocada por toque e locomoção para examinar o desempenho da natação como uma medida da função muscular.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

A Análise de Elementos Finitos é uma ferramenta frequentemente usada para investigar o desempenho mecânico de estruturas sob carga. Aqui, aplicamos seu uso para modelar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aprenda a isolar miofibras esqueléticas de embriões e larvas de zebrafish para análise detalhada da morfologia e localização de proteínas musculares. Este método permite estudos de fisiologia muscular com maior resolução.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

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