De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

O objetivo geral deste procedimento é identificar reguladores transcricionais de qualquer gene de interesse usando um protocolo simples de transfecção de alto rendimento e um ensaio caseiro de luciferase de brilho duplo. Isso é feito primeiro projetando e clonando um conjunto único de plasmídeos repórteres de luciferase dupla. Esses plasmídeos são transfectados em 2 9 3 células T em microplaca com plasmídeos de uma biblioteca de expressão de DNA, de modo que cada poço seja transfectado com um único plasmídeo de biblioteca.

Após 48 horas, a atividade da luciferase do vaga-lume é testada, seguida por um ensaio da atividade da luciferase baunilha. A etapa final é calcular as taxas de atividade do vaga-lume para a luciferase baunilha. Em última análise, a indução relativa do gene de interesse em resposta a cada biblioteca.

O gene é inferido pela proporção da atividade do vaga-lume para a luciferase baunilha em cada poço após a normalização baseada em placa. A principal vantagem dessa técnica sobre os protocolos de ensaio repórter existentes é sua capacidade de gerar rapidamente dados funcionais para um grande número de genes com mão de obra e custo mínimos. Um dia antes da transfecção designada como o primeiro dia da tela, 2 9 3 células T são colocadas em 96.

As células das placas de poços são dimensionadas, contadas e ressuspensas a uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. Em DMEM contendo 14% de FBS, despeje as células em um reservatório estéril. Coloque o reservatório com seis placas de fundo transparente, 96 poços e uma caixa de ponteiras de pipeta de filtro no deck do robô do manipulador de líquidos automatizado.

Duas placas de células devem ser assentadas para cada placa de biblioteca a ser rastreada. Dispense 100 microlitros de células em cada poço de cada placa para uma densidade de 1,5 vezes 10 elevado a quarto de células por poço. Três placas de biblioteca serão exibidas nesta demonstração.

Assim, seis placas de células são preparadas: centrifugue as placas celulares a 50 vezes G por dois minutos usando baixas velocidades de rampa para garantir a densidade celular igual em cada poço. Esta imagem ilustra como as células revestidas devem ficar após a centrifugação. Incube as células a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono durante a noite.

Para preparar os plasmídeos repórter de vaga-lume e baunilha, dilua cada um até cinco nanogramas por microlitro em água livre de endotoxina em um tubo cônico de 15 mililitros. Combine as diluições em uma proporção de cinco a três vaga-lumes para plasmídeo de baunilha em volume. Pipete os plasmídeos combinados em cada poço de uma placa de 96 poços, dispensando 17 microlitros por placa de biblioteca, mais dois a 10 microlitros em excesso em cada poço, as células são transfectadas no segundo dia da tela.

Para iniciar este procedimento, para cada placa de biblioteca, misture 107,5 microlitros de defeito de temperatura ambiente com 4,3 mililitros de meio livre de soro, uma diluição de um a 40 em um tubo de poliestireno, incube por cinco minutos em temperatura ambiente, dispense 44 microlitros por placa de biblioteca em cada poço de uma placa de poliestireno de 96 poços com fundo em V. Coloque a placa de DNA da biblioteca, a placa de efeito opt diluída, a placa de plasmídeo repórter e uma caixa de pontas de pipeta no deck do robô aspirado. 17 microlitros de plasmídeos repórteres, 43 microlitros de efeito opt diluído e 26 microlitros de DNA de biblioteca, inserindo um espaço de ar de cinco microlitros entre cada aspiração.

O DNA da biblioteca deve ser aspirado por último para evitar contaminação cruzada. Dispense o conteúdo das pontas em uma nova tampa de mistura de placa de poliestireno com fundo em V e reserve por 20 minutos para permitir a formação de complexos lipídicos de DNA. Se estiver seccionando várias placas de biblioteca, substitua as pontas da pipeta e a placa da biblioteca e repita após 20 minutos, descubra a placa de mistura de DNA de efeito óptico e coloque-a no deck do robô com duas placas de 2 9 3 células T usando uma única caixa de pontas de pipeta.

Aspire 80 microlitros da mistura de DNA opt effect e dispense lentamente 40 microlitros por poço para cada placa de células. Cubra as células após a mistura de DNA de efeito opt ter sido adicionada às células em todas as placas. Centrifugue as placas a 1.200 vezes G por 30 minutos.

Retorne as placas para a incubadora e incube as células por quatro a seis horas. Durante esta incubação, prepare um meio fresco misturando 12 mililitros de DMEM contendo 10% de FBS e 10 microgramas por mililitro de ciprofloxina. Para cada placa de biblioteca transfectada, despeje a mídia fresca em um reservatório estéril.

Em seguida, coloque duas caixas de pontas de robô, uma única placa de células, o reservatório contendo mídia fresca e um reservatório de resíduos no deck do robô. Em seguida, aspirar 100 microlitros de meio das células e dispensar no reservatório de resíduos, parcialmente preenchido com etanol 70%. Usando pontas frescas, aspire 100 microlitros de meio fresco e distribua lentamente nas células.

Devolva as placas à incubadora por 48 horas. Os ensaios de vaga-lume e luciferase de baunilha são realizados. 48 horas após a transfecção no quarto dia da tela para cada placa de biblioteca, prepare oito mililitros de três x tampão de ensaio de vaga-lume e 12 mililitros de três x tampão de ensaio de baunilha de suas respectivas soluções de estoque dispense 82 microlitros de tampão de ensaio de vaga-lume em cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para cada placa de biblioteca a ser analisada.

Da mesma forma, dispense 122 microlitros de tampão de ensaio de baunilha em cada poço de outra placa de fundo em V de 96 poços. Para cada placa a ser analisada, reserve os dois tampões de ensaio. Coloque uma caixa de ponteiras de pipeta, um reservatório de resíduos e duas placas de células transfectadas da mesma placa de biblioteca no deck do robô, aspire 60 microlitros de meio de cada placa e descarte no reservatório de resíduos parcialmente preenchido com placas de cobertura de etanol 70% e reserve.

Em seguida, coloque duas caixas de pontas de pipeta. A placa de três x tampão de ensaio de vaga-lume e um conjunto de placas de células no convés do robô. Aspire 40 microlitros de três x tampão de ensaio de vaga-lume e adicione-o à primeira placa de células, misturando bem.

Mudando para novas ponteiras de pipeta. Repita para a segunda placa celular. Coloque as células em temperatura ambiente por 10 minutos para completar a lise.

Registre a luminescência de cada poço de cada placa de célula no luminômetro registrando por um segundo por poço. Retorne as placas para o convés do robô. Coloque duas caixas de pontas de pipeta, a placa de três x tampão de ensaio e um conjunto de placas de células no deck do robô.

Aspire 60 microlitros de três x tampão de ensaio de baunilha e adicione-o à primeira placa de células. Misturando bem. Mudar para uma nova caixa de ponteiras de pipeta.

Repita para a segunda placa celular. Registre a luminescência de todas as placas em um luminômetro. Gravando cada poço por um segundo.

Os valores típicos de luciferase para uma única meia placa são mostrados nessas tabelas. A razão de vaga-lume para luminescência de renovação ou razão F dois R para cada poço é calculada dividindo as contagens do sinal de vaga-lume pelas contagens do sinal de renovação executado e os resultados são mostrados no Painel C. O Painel D mostra o valor de indução para cada poço calculado dividindo a razão F dois R do poço pela razão média F dois R da placa, excluindo os 25% mais altos e mais baixos dos poços. Os valores de indução devem ser calculados em média entre as réplicas para uma única placa de biblioteca transfectada.

E genes que induzem ou reprimem a alfa-sinucleína mais de três vezes são considerados hits. Observe que o indutor de 32 vezes no poço H dois neste resultado representativo mostrado aqui é uma representação gráfica dos valores de indução para a placa única com o poço H dois destacado em azul. Hi.H dois é um fator de transcrição neuronal não associado anteriormente à expressão de alfa-sinucleína.

É importante verificar se a triagem é realizada dentro da faixa linear dos ensaios repórter para que os clones que causam aumento da expressão sejam medidos à medida que o aumento da atividade da luciferase para este final as células foram transfectadas com quantidades crescentes de plasmídeos de vaga-lume e luciferase de baunilha sob o controle do forte promotor e ensaio H-C-M-V-I-E um. Com este protocolo, observou-se que a atividade dos vaga-lumes permanece linear através de uma ampla gama de valores. Enquanto a curva para a atividade de baunilha se achata acima de 15 nanogramas por poço.

Também é importante realizar os ensaios imediatamente após a etapa de incubação para evitar a não linearidade devido à depleção do substrato. Um curso de tempo do sinal de decaimento para o ensaio de luciferase de vaga-lumes revelou atividade significativa de luciferase de vaga-lumes até uma hora após a adição de reagentes usando este protocolo, 7.670 genes humanos foram rastreados e 68 novos reguladores de alfa-sinucleína foram finalmente identificados nos resultados representativos mostrados aqui. Cada linha horizontal representa a taxa de indução de um único gene atingido em comparação com um indutor neutro GFP controlado.

As linhas azuis representam indutores positivos, enquanto a única linha vermelha representa um supressor Os valores de indução são calculados como a razão entre o promotor de alfa-sinucleína que conduz a atividade de luciferase do vaga-lume para o promotor de CMV que conduz a atividade de luciferase de cada acerto normalizado para o mesmo ensaio de construções de luciferase usando um indutor de GFP Seguindo este procedimento. Outros métodos, como PCR quantitativo em conjunto com ensaios adicionais de superexpressão e knockdown, podem ser realizados para garantir que os acertos identificados regulem o alvo endógeno.