Name: Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina de alta qualidade para ChIP-seq, identificando regiões de ligação proteica-DNA em linhas celulares. Este método demonstra o uso do fator de transcrição TCF7L2.

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O trabalho é apoiado por uma concessão do Instituto de Desenvolvimento do Hospital Infantil da Filadélfia.

1. Cruz-link Chromatin <ol><li> Cultivar células em placas de cultura de 100x20mm celulares. A quantidade de células pode variar de 1 a 10 milhões de células por placa, dependendo do tipo de célula. Aproximadamente 2 milhões de células é suficiente para uma imunoprecipitação. </li><li> Células de ligação cruzada em formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente com agitação ocasional. </li><li> Quench de reticulação por adição de uma concentração final de glicina 125 mM e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com solução salina tamponada de fosfato 1X (PBS) duas vezes, decantar PBS e, em seguida, adicionar 0,2 ml de PBS. </li><li> Células de colheita com um raspador de células de plástico dentro de um tubo de microcentrífuga. </li><li> Girar as células a 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em tampão de lise (SDS a 1% de SDS, 10 mM de EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) para a célula lisado ou mantê-los como uma pastilha para a extracção nuclear. </li><li> As células podem ser guardadas a -80 ° C, ou pode-se proceder immédiately com sonicação. </li></ol> 2. Prepare Núcleos (Avance para o Passo 3.5 para lisado celular inteiro) <ol><li> Suplemento de Lise Celular (5 mM de PIPES, pH 8,0, KCl 85 mM, 0,5% de NP-40) com 1X Inibidor de Protease de cada experimento. </li><li> Ressuspender pellet celular descongelado em cerca de 10 vezes o volume de pelotas com Tampão de Lise Celular. </li><li> DOUNCE-homogeneizar 10 vezes com pilão, em seguida, incubar no gelo por 10 min. </li><li> Centrifugar amostra a 4000 rpm durante 5 min a 4 ° C, rejeitar o sobrenadante e guardar pelete nuclear. </li></ol> 3. Sonication * <ol><li> Aqueça SDS Tampão de Lise e quantidade de suplemento de tampão a ser utilizado com inibidor de proteinase. </li><li> Ressuspender pellet nuclear em SDS Lysis Buffer (aproximadamente 0,5 ml de tampão por 1-10.000.000 células) </li><li> Incubar no gelo por 10 min. </li><li> Adicionar 0,5 mL de alíquotas de amostras para tubos de microcentrífuga. </li><li> Sonicar em gelo húmido utilizando ultra-sons Misonix com 30 segundos ligado e 45 segundosfora com uma definição de amplitude de 2. O número de ciclos de tamanho ideal fragmento pode ser determinada pela primeira experimentar vários números de ciclo (ex. 2, 4, 8, 12, 16, e 20 ou mais ciclos). Um tipo diferente de ultrassons pode ser usada, no entanto, as condições podem variar. Experimentação com o número de ciclos e da quantidade de tempo ligado e desligado devem ser realizadas a fim de determinar as condições ideais. </li><li> Coletar 20 ml de cada amostra para verificar os resultados sonicação e fazer a quantificação,. O restante da amostra pode ser armazenada a -80 ° C. </li><li> Dilui-se a 20 uL da amostra por adição de 30 ul de 0,1 x tampão TE. </li><li> Tratar amostra com 1 ml de RNase A a 37 ° C durante 1 hora, em seguida adicionar 1 ul de proteinase K, e incubar a 62 ° C durante 2 horas. </li><li> Executar 20 ul da amostra num gel de agarose a 2%. </li><li> Purificar o restante da amostra com QIAquick kit de purificação de PCR, em seguida, quantificar usando espectrofotômetro NanoDrop. </li></ol> * Para ChI nativaP, microccocal nuclease de digestão pode ser usado como alternativa ao corte do DNA. 4. Bloco de agarose * <ol><li> Se contas já estão bloqueadas, vá para o passo 5.1. </li><li> É uma proteína ou Proteína G agarose. Por 5 imunoprecipitações (IPs), use 600 ml de 50% chorume talão (300 ml talão pellet) </li><li> Para lavar as contas, colocá-los para baixo a 800 rpm por 1 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Adicionar um pouco mais do que 2 ml de Tampão de Diluição do chip (0,01% de SDS, EDTA 1,2 mM, NaCl 167 mM, 1,1% de Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1) e misturar lentamente invertendo o tubo de 10X. Spin-se novamente a 800 rpm durante 1 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Repetir a lavagem duas vezes mais. </li><li> Bloquear a grânulos rodando a 4 ° C durante a noite em solução de bloqueio. Consulte a Tabela 1 para a receita da solução de bloqueio. </li></ol> 5. Cromatina pré-clear <ol><li> Thaw sonicado cromatina no gelo. </li><li> Girar a 12.000 rpm fou 10 min a 4 ° C, em seguida, colocar no gelo imediatamente para remover o SDS (bolinha branca). </li><li> Recolher o sobrenadante, descarte da pelota, e combinar as amostras, se necessário. </li><li> Retire os montantes necessários para o experimento com base em cálculos (1-10 ug da cromatina por IP). </li><li> Diluir cromatina 10X em Chip tampão de diluição suplementada com inibidor de protease. </li><li> Adicionam-se 100 ul de contas bloqueadas por IP. </li><li> Girar a 4 ° C durante 1 hora. </li></ol> 6. Immunoprecipitation <ol><li> Girar as amostras a 800 rpm durante 1 min, e transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Girar o sobrenadante a 800 rpm durante 1 min e transferência para outro tubo limpo. </li><li> Guardar 20 ul de sobrenadante, para servir como controlo de entrada, a -20 ° C. </li><li> Alíquota da cromatina com o número de IPs a serem feitas no experimento. </li><li> Adicionam-se 2 ug de anticorpo por 1-10 ug de cromatina para cada amostra. </li><li> Incubar durante a noite de 4 ° C com rotação. </li><li> Adicionam-se 100 ul de contas bloqueadas para cada amostra de IP. </li><li> Incubar durante 1 hora a 4 ° C com rotação. </li><li> Agregar as esferas para baixo, girando a 800 rpm durante 1 min e descartar tanto do sobrenadante quanto possível. </li><li> Lavar contas uma vez com Low tampão de lavagem complexo imunológico sal. Adicionar 1 ml de tampão para cada tubo, girar à temperatura ambiente durante 5-8 minutos; girar para baixo a 800 rpm durante 1 min, em seguida, descartar o sobrenadante. Repita a lavagem uma vez com tampão de sal elevado complexo imune de lavagem e o tampão de lavagem complexo imunológico LiCl e duas vezes com tampão TE para um total de cinco lavagens (Tabela 2). </li></ol> 7. Eluição <ol><li> Descongelar amostras de entrada a partir do dia anterior a ser processadas com os eluentes. </li><li> Faça eluição tampão fresco (Tabela 3). </li><li> Faça uma mistura de mestre suficiente tampão de eluição necessário para IPs e amostras de controle de entrada mais 1-2 amostras extras. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de eluição para cada uma das amostras de IP e incubar à temperatura ambiente durante 15 mcom rotação. </li><li> Girar a 800 rpm durante 1 min e adicionar o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Adicionar mais 100 ul de tampão de eluição a cada tubo de esferas e incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação. </li><li> Vortex durante 15 segundos após a incubação; girar a 5000 rpm, durante 1 min, depois combinar o sobrenadante com o sobrenadante da primeira eluição. (Certifique-se que não há sobra contas no sobrenadante. Caso de dúvida, girar sobrenadante novamente a 5.000 rpm por 1 min e recolher o sobrenadante em um novo tubo. </li><li> Adicionar 180 ul de tampão de eluição à 20 ul das amostras de controlo de entrada. </li></ol> 8. Cross-link reverso <ol><li> Para a 200 ul de eluentes e controles de entrada, adicionar 8 mL de 5 M de NaCl. </li><li> Tubos de vedação com parafilme e incubar em banho-maria a 65 ° C durante a noite. </li></ol> 9. Purificação de DNA <ol><li> Tratar cada amostra com 1 ml de RNase A durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Adicionar 4 μl de EDTA 0,5 M, 8 ul de 1M Tris-HCl, misturar, adicionar 1 ml de Proteinase K a cada amostra e incubar a 45 ° C durante 2 horas. </li><li> Purifica-se as amostras usando o kit de purificação de PCR QIAquick. As amostras podem ser guardadas a -20 ° C e a PCR de verificação pode ser feito numa data posterior. </li></ol> * Alternativamente, as esferas magnéticas ChIP grau pode ser usado em lugar de agarose para a porção de imunoprecipitação. 10. PCR cheque <ol><li> Para a verificação de PCR, use primers para regiões conhecidas em se comprometer com a proteína de interesse. Além disso, use primers para regiões não-vinculativos como controles negativos. </li><li> Misturar os reagentes para a reacção. Diluir a amostra de entrada a 1:100 (Tabela 3). </li><li> Executar reação. Programa de PCR: </li></ol> Passo 1: 94 ° C 3 min Passo 2: 94 ° C 20 seg 59 ° C 30 seg 72 ° C 30 seg (Repita a Etapa 2, pelo menos, 30 cycles) Passo 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Executar amostras em gel de agarose a 1%. </li><li> O enriquecimento pode também ser determinada quantitativamente, por PCR em tempo real. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
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<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
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<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
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<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

É agora possível realizar um perfil de todo o genoma de ADN-proteína utilizando as interacções associação ChIP seq, como foi recentemente demonstrado com outros factores de transcrição de 2,3. A chave para um resultado bem sucedido de sequenciação é a geração de um modelo de alta qualidade de ADN de cromatina imunoprecipitação. Uma vez que o molde de ADN foi gerado e verificado ser adequadamente enriquecida, pode-se, em seguida, levá-lo na preparação de biblioteca para a sequencia...

Durante muitos anos, tem havido uma necessidade não satisfeita para identificar o grupo de genes ligados e regulada por um genoma proteína dada largura, em particular os da classe factor de transcrição. Odom et al. 1 usado cromatina imunoprecipitação (CHIP), combinado com o promotor de microarrays para identificar sistematicamente os genes ocupados por órgãos reguladores de transcrição pré-especificados em ilhotas pancreáticas fígado humano e. Subsequentemente, Johnson et ai. Dois desenvolveram um ensaio de imunoprecipitação da cromatina em larga escala com base em ultra-sequenciação de DNA de alto rendimento directo (ChIP seguintes), a fim de mapear de maneira abrangente interacções proteína-ADN em toda genomas de mamíferos. Tal como um caso de teste, eles mapearam in vivo a ligação do factor de silenciador neurónio restritiva (NRSF) para 1946 locais no genoma humano. Os dados exibidos sharp resolução da posição de ligação (+ 50 pares de bases), o que facilitou tanto o isolation de motivos ea identificação dos motivos NRSF vinculativas. Estes dados do chip-seq também teve alta sensibilidade e especificidade e confiança estatística (P &lt;10 -4), propriedades que são importantes para inferir novas interações candidatos. Robertson et al. 3 também usado ChIP seq para mapear STAT1 alvos no interferão-γ (IFN-γ)-estimuladas e não estimuladas As células HeLa S3 humanas in vivo. Por Chip-seq, com 15,1 e 12,9 milhões seqüência mapeada unicamente lê, e uma taxa de falsa descoberta estimada em menos de 0.001, eles identificaram 41.582 e 11.004 STAT1 regiões de ligação putativos em células estimuladas e não estimuladas, respectivamente. Dos 34 loci conhecidos para conter STAT1 interferon-responsive ligação 4-8 locais, Chip-seq encontrados 24 (71%). Alvos ChIP-seq foram enriquecidos em sequências semelhantes aos conhecidos STAT1 motivos de ligação. Comparações com dois dados do chip-PCR existentes define sugeridoque a sensibilidade ChIP seq situou-se entre 70% e 92% e especificidade de, pelo menos, 95%. Além disso, ficou claro que o chip-seq oferece baixa complexidade analítica e sensibilidade que aumenta com a profundidade de seqüenciamento. Como as tecnologias de seqüenciamento tal, genoma &quot;next-generation&quot; fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser custo-benefício gerado sobre as tecnologias mais velhos 9. Métodos ChIP-seq, portanto, fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interações DNA-proteína 3. Em 2006, uma forte associação de variantes do fator de transcrição 7-like 2 (TCF7L2) gene com diabetes tipo 2 foi descoberto 10. Outros pesquisadores já replicado de forma independente este achado em diferentes etnias e, curiosamente, desde os primeiros estudos de associação ampla do genoma de diabetes tipo 2 publicados na revista Nature 11,12 </saté&gt;, Ciência 13-15 e em outros lugares 16,17, a associação mais forte foi de fato com TCF7L2, o que é agora considerado o mais importante descoberta genética na diabetes tipo 2 até à data 18-20. Além disso, TCF7L2 tem sido associada a risco de cancro 21,22; facto, esta ligação tornou-se mais evidente quando o locus 8q24 revelado pelos estudos genoma amplo associação de um certo número de cancros, incluindo os carcinomas colorrectais, foi demonstrado ser devido a um extremo a montante TCF7L2 elemento de ligação dirigir a transcrição de MYC 23,24. Como tal, há um grande interesse em determinar os genes a jusante regulados por este factor de transcrição chave. Com base na experiência com TCF7L2 como um exemplo do método, este documento descreve como gerar o molde de ADN de chip de alta qualidade. Chip foi realizada na linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, para sequenciação subsequente, a fim construir uma alta resolmapa buição dos genes vinculados por TCF7L2 25 em um esforço para produzir mais conhecimento para o seu papel fundamental na patogênese de características complexas.

<table><tbody><tr><td>Kit de Purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit EZ-ChIP </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Hot Start Polimerase </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Espectrofotômetro </td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sequências de primers de controle positivo (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Sequências de primers de controle negativo (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

geração de alta chromatin template dna immunoprecipitation qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (chip-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Microplaqueta-seqüenciamento (Chip-seq) métodos diretamente oferecer cobertura de todo o genoma, onde a combinação de cromatina imunoprecipitação (CHIP) e sequenciamento massivamente paralelo pode ser utilizado para identificar o repertório de sequências de DNA de mamíferos vinculados por fatores de transcrição in vivo. &quot;Próxima geração&quot; tecnologias de seqüenciamento do genoma fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser rentável gerou mais de tecnologias mais antigas permitindo métodos ChIP-seq para fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interacções proteína-ADN. Para o sucesso abordagens ChIP-seq, deve-se gerar modelo de DNA chip de alta qualidade para obter os melhores resultados de sequenciamento. A descrição é baseada em experiência com o produto de proteína do gene mais fortemente implicado na patogénese da diabetes de tipo 2, a saber, o factor de transcrição do factor de transcrição 7-like 2 (TCF7L2). Este factor também tem sido implicado em vários cancros. Descritos é como ADN molde para gerar chip de alta qualidade derivada da linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, a fim de construir um mapa de alta resolução através de sequenciação para determinar os genes ligados por TCF7L2, dando uma visão mais para o seu papel chave na patogénese de características complexas.

Uma vez que a cromatina foi sonicada e foram tratados com RNase e Proteinase, as amostras são executados em gel de agarose a 2%, devem apresentar um esfregaço com a maior parte do ADN com o tamanho desejado. Se vários ciclos diferentes são testadas, uma redução gradual no tamanho deve ser visto como aumentar o número de ciclos (Figura 2). Depois de completar a porção de imunoprecipitação do protocolo do enriquecimento pode ser verificada por PCR, ou PCR em tempo real. Para a...

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar regiões de ligação proteica por meio da cromatina. Isso é realizado primeiramente reticulando a proteína ao DNA. O segundo passo é fragmentar o DNA.Em seguida, a proteína alvo ligada ao DNA é imunoprecipitada e depois eluída. O passo final consiste em reverter a ligação cruzada e isolar o DNA. Em última análise, a imunoprecipitação de cromatina é utilizada para demonstrar a localização do ligante proteico ao longo do genoma.Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de genômica funcional, como a identificação e mapeamento de interações proteína-DNA em um determinado tecido ou linhagem celular. As células para este procedimento são cultivadas em placas de cultura celular de 100 por 20 milímetros. A quantidade de células pode variar de um a dez milhões de células por placa, dependendo do tipo celular. Aproximadamente dois milhões de células são suficientes para uma imunoprecipitação para promover a reticulação entre proteína e cromatina nas células.Adicione formaldeído até 1% e incube por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação ocasional. Interrompa a reticulação adicionando glicina até uma concentração final de 125 milimolares e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente, lave as células duas vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato) 1x; após a segunda lavagem, remova o PBS e adicione 0,2 mililitros de PBS fresco. Recolha as células com uma espátula de plástico em um tubo de microcentrífuga. Centrifugue as células a 2000 RPM por cinco minutos a quatro graus Celsius.Aspire o sobrenadante para extração nuclear. Mantenha as células como um pellet para o preparo de um lisado celular completo, que será demonstrado no próximo segmento. Resuspenda as células em tampão de lise SDS; os lisados celulares completos são preparados a partir das células reticuladas por sonicação em gelo úmido.Usando um meu ator Para obter o tamanho ideal do fragmento de DNA, este procedimento deve ser otimizado testando diferentes condições de sonicação. As amostras devem permanecer sobre gelo durante todo o procedimento. Sonique cada amostra nessas condições: 30 segundos ligado e 45 segundos desligado, com ajuste de amplitude em dois.Neste exemplo, são necessários 12 ciclos para obter o tamanho ideal de fragmento. Colete 20 microlitros de cada amostra para verificar os resultados da sonicação e para quantificação. O restante da amostra pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius.Dilua a amostra de 20 microlitros adicionando 30 microlitros de tampão 0,1 XTE. Em seguida, trate a amostra com um microlitro de RNAsa A a 37 graus Celsius por uma hora. Depois, adicione um microlitro de proteinase K e incube a 62 graus Celsius por duas horas.Após o tratamento com proteinase K, aplique 20 microlitros da amostra em um gel de agarose a 2%. As amostras devem apresentar uma faixa difusa, com a maior parte do DNA no tamanho desejado. Se forem testados vários ciclos diferentes, deve-se observar uma diminuição gradual no tamanho.À medida que o número de ciclos aumenta, a quantidade remanescente de amostra será purificada com um kit de purificação rápida de PCR kaya e quantificada utilizando um espectro NanoDrop de TER para iniciar este procedimento. Fava amostras de cromatina sonicadas em gelo centrifugadas a 12.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Coloque imediatamente em gelo.Para remover o SDS, que aparece como um pellet branco. Colete o sobrenadante e descarte o pellet de cada amostra. Combine as amostras se necessário, separando as quantidades necessárias para o experimento com base nos cálculos anteriores.De um a 10 microgramas de cromatina são necessários por imunoprecipitação. Dilua a cromatina em uma proporção de um para 10 em tampão de diluição suplementado com inibidor de proteinase. Adicione 100 microlitros de agarose bloqueada por imunoprecipitação e incube em rotação a quatro graus Celsius durante uma hora.Inicie o procedimento de imunoprecipitação da cromatina centrifugando as amostras a 800 RPM por um minuto a quatro graus Celsius e transferindo cada sobrenadante para um tubo novo. Centrifugue o sobrenadante a 800 RPM por um minuto e transfira para outro tubo limpo. Guarde 20 microlitros do sobrenadante a menos 20 graus Celsius para servir como controle de input.Posteriormente, alíquotar o restante da cromatina para o número de imunoprecipitações necessárias no experimento. A cada amostra, adicionar dois microgramas de anticorpo por um a 10 microgramas de cromatina e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com rotação. Na manhã seguinte, adicionar 100 microlitros de microesferas de aros bloqueadas a cada amostra de imunoprecipitação. Incubar por uma hora a quatro graus Celsius com rotação após uma hora.Pelotize as esferas centrifugando a 800 RPM durante um minuto. Descarte o máximo possível do sobrenadante. Lave as esferas.Uma vez com tampão de lavagem de complexo imune de baixa salinidade, adicione um mililitro do tampão a cada tubo. Incube em rotação à temperatura ambiente por cinco a oito minutos e, em seguida, centrifugue a 800 RPM por um minuto após descartar o sobrenadante. Lave os beads uma vez com tampão de lavagem de complexo imune de alta salinidade, uma vez com tampão de lavagem de complexo imune de cloreto de lítio e duas vezes com tampão TE, totalizando cinco lavagens. Posteriormente, o DNA é eluído de cada amostra de imunoprecipitação, bem como das amostras de input.Para reverter a ligação cruzada, adicione oito microlitros de cloreto de sódio 5 M a 200 microlitros de cada eluato e controle de entrada. Feche os tubos com parafina e incube-os em banho-maria a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, trate cada amostra com um microlitro de RNase A por uma hora a 37 graus Celsius.Após uma hora, adicione quatro microlitros de EDTA 0,5 molar e oito microlitros de tris HCl 1 molar a cada amostra e misture. Em seguida, adicione um microlitro de proteinase K e incube a 45 graus Celsius por duas horas. Purifique as amostras utilizando o kit de purificação PCR Kaya Quick.As amostras podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius até serem analisadas por PCR. O enriquecimento por imunoprecipitação de cromatina pode ser verificado por PCR ou PCR em tempo real. Para amostras de PCR, realizar eletroforese em gel de agarose; devem ser observadas bandas nas amostras de entrada e nos fragmentos imunoprecipitados (chip), utilizando um anticorpo contra a proteína de interesse, que neste caso é o fator de transcrição TCF7L2. Em contraste, não deve haver nada ou, no máximo, uma banda muito fraca na amostra controle negativo com IgG na região de ligação positiva.Para a região de ligação negativa. Deve haver uma faixa muito fraca ou nenhuma faixa para as amostras controle de IgG e para as pistas do chip. Deve haver uma faixa na pista de entrada.Esta figura mostra os resultados das mesmas amostras analisadas por PCR em tempo real. Conforme o resultado anterior, deve haver um enriquecimento considerável da região de ligação positiva na amostra de chip em relação ao controle de IgG.Além disso, deve haver muito pouca, ou nenhuma, enriquecimento na região de ligação negativa. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como realizar a reticulação da proteína de ligação à cromatina em um tecido ou linhagem celular, imunoprecipitar sua proteína de interesse e, em seguida, isolar o DNA para análises adicionais.

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JoVE Journal

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Biologia

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.

Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa

Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) metodologia para a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico de nucleossoma densidade ChIP-seq integrando acessibilidade nuclease micrococcal (MNase) com medidas de modificação de histona.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Aqui nós apresentamos um protocolo que visa analisar todo o genoma ligação do factor de transcrição do oligodendrocyte 2 (Olig2) em agudamente purificada oligodendrocyte precursor as células do cérebro (OPCs) através da realização de imunoprecipitação da cromatina de baixo-celular (ChIP) , preparação de biblioteca, elevado-throughput sequenciamento e análise de dados de bioinformatic.

Identificar Sites de Factor de transcrição Olig2 vinculação genômica em agudamente purificado PDGFRα + células por imunoprecipitação da cromatina Low-célula sequenciamento análise

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

Este artigo descreve um protocolo chip-seq semiautomado e microescalado de regiões de DNA associadas a uma modificação de histona específica (H3K27ac) usando uma plataforma de manipulador de líquidos ChIP, seguido de preparação da biblioteca usando tagmentação. O procedimento inclui avaliação de controle para fins de qualidade e quantidade e pode ser adotado para outras modificações de histona ou fatores de transcrição.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina de alta qualidade para ChIP-seq, identificando regiões de ligação proteica-DNA em linhas celulares. Este método demonstra o uso do fator de transcrição TCF7L2.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

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