Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

O objetivo do experimento a seguir é gerar tecido miocárdico funcional alinhado por meio de micro impressão de contato. Isso é conseguido pela primeira impressão de fibronectina por microcontato em substratos de poli dimetil siloxano. Como segundo passo, transgênico duplo.

As linhagens de células-tronco embrionárias são diferenciadas in vitro e isoladas por meio de classificação celular ativada por fluorescência, o que permite a obtenção de populações altamente purificadas de progenitores fortemente cardiogênicos. Em seguida, progenitores cardíacos isolados são semeados em substratos PDMS micropatenteados para torná-los malignos e assumir a forma de um miócito cardíaco como uma haste. Obtém-se resultados que mostram o sucesso do isolamento e um crescimento isotrópico dos progenitores cardíacos com base em fatos e análise de imunofluorescência.

A geração de um tecido miocárdico isotrópico pode ajudar a avançar nos campos da biologia de células-tronco e bioengenharia de tecidos, aumentando a possibilidade de desenvolver doenças específicas E lançando as bases para a medicina regenerativa cardíaca. Primeiro protetor IL, 180 4 elastômero poli dimetil alano em uma proporção de agente acuring de 10 para um e misture bem.

Desgaseifique o conjunto usando um dessecador para eliminar quaisquer bolhas de ar. Despeje o PDMS em um mestre previamente fabricado com 20 mícrons de largura e duas cristas de ferramentas de mícron separadas por espaçamento de 20 mícrons, depois cure por dois dias em um dessecador à temperatura ambiente para obter carimbos PDMS microtexturizados. Depois de renderizar as superfícies do carimbo PDMS hidrofílicas com um limpador de plasma.

Esterilize os selos com etanol 70% por um minuto. Em um armário de segurança biológica, seque rapidamente com ar comprimido. Cubra as superfícies estéreis do carimbo com solução de fibronectina para absorver por pelo menos 10 minutos após a absorção.

Sacuda a solução de fibronectina dos selos e seque rapidamente com ar comprimido. Estabeleça contato isolante entre o carimbo e as lamínulas de vidro revestidas com PDMS previamente preparadas, conforme descrito no protocolo de texto, por dois minutos e pressione com firmeza. Enxágue os substratos de micro padrão com água destilada.

Armazene-os em água destilada por no máximo duas semanas de quatro graus Celsius, a menos que sejam usados imediatamente. Cubra seis placas de poços com gelatina estéril a 0,1% em água destilada e deixe absorver por 15 minutos a 37 graus Celsius Durante esse tempo, prepare os fibroblastos embrionários de camundongo a partir de uma alíquota adicionando-os a 50 mililitros de PBS em um tubo cônico. Centrifugue a metanfetamina a 1000 RPM por cinco minutos e suspenda-a novamente em meio de metanfetamina.

Decorrido o tempo de incubação, aspire o excesso de gelatina e adicione o mes nos poços. Permita que o MES um dia se conecte. Prepare as células-tronco embrionárias ou células ES a partir de uma alíquota de pensamento, adicionando-as a 50 mililitros de PBS em uma centrífuga de tubo cônico.

As células ES 1000 RPM por cinco minutos e Resus suspendê-los em meio ESC. Adicione as células E ES aos poços contendo mitos e mantenha em meio ESC até que a confluência seja alcançada para massagear as células ES cofluentes. Aspire primeiro o meio ESC e lave as células uma vez com PBS estéril.

Em seguida, aspire o PBS e adicione 500 microlitros de viagens no, poço. Incube a placa por três minutos e meio a 37 graus Celsius. Pipetar a solução de TRIPSIN várias vezes.

Primeiro a quebrar as colônias de células E es. Em seguida, neutralize a solução de tripsina adicionando 500 microlitros de meio ESC ao poço. Massageie as células ES de acordo com a proporção necessária, aqui as células E ES são passadas na proporção de um para 30, o que permite que elas atinjam a confluência em três dias.

Inicie a diferenciação in vitro quando as células ES atingirem a confluência. Primeiro cubra as placas de cultura de 10 centímetros com gelatina estéril a 0,1% em água destilada e deixe absorver por 15 minutos a 37 graus Celsius. Durante esse tempo, colha as células ES como antes.

Decorridos os 15 minutos, aspirar o excesso de gelatina e adicionar cerca de um terço a metade da suspensão de células E ES em placas cultivadas contendo meio de adaptação. Depois de cultivar as células em meio de adaptação por dois dias, colha as células ES adaptadas em um tubo cônico de 50 mililitros contendo PBS usando 1,5 mililitros de tripsina. Centrifugá-los a 1000 rpm durante cinco minutos e suspendê-los novamente em meio de diferenciação.

Faça corpos embrionários ou EBS de aproximadamente 1000 células por gota de 10 microlitros de meio de diferenciação em placas de cultura de 15 centímetros. Usando uma pipeta multicanal, inverta as placas e a cultura. O EBS está pendurado por gotículas por dois dias e meio a 37 graus Celsius.

Após dois dias e meio, puxe o EBS de seis a oito pratos de 15 centímetros em um usando meio de diferenciação e cultive-os por mais três dias e meio. Após mais três dias e meio, colete o EBS em um tubo cônico de 50 mililitros e lave a placa uma vez com PBS estéril para coletar todo o ebs. Em seguida, deixe-os afundar por aproximadamente cinco minutos.

Em seguida, remova o supinato e lave o EBS com PBS estéril. Deixe o EBS afundar novamente por aproximadamente cinco minutos. Dissocie o EBS adicionando 2,5 mililitros de tripsina e agite o tubo suavemente em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos.

Em seguida, adicione 2,5 mililitros de PBS estéril à solução de tripsina e pipete para cima e para baixo com a pipeta sorológica de 10 mililitros aproximadamente oito a 10 vezes para quebrar os aglomerados de células. Neutralize a tripsina com 10 mililitros de tampão fax contendo 7,5% de célula ES ou grau de diferenciação FBS e 0,01% DPI na centrífuga PBS, EBS dissociado a 1000 RPM por cinco minutos. Em seguida, remova o supinato e adicione aproximadamente um mililitro de pipeta tampão de fax para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro aproximadamente oito a 10 vezes para quebrar os aglomerados de células.

Transfira as células para um tubo inferior redondo estéril com um filtro de células de 35 mícrons para obter uma suspensão de célula única. Classifique as células ES diferenciadas usando um citômetro de fluxo aria e obtenha populações purificadas de progenitores ventriculares comprometidos. Consulte a parte de texto do protocolo para obter a estratégia detalhada de gating.

Comeu os substratos de micro padrão com 1% de F1 27 onic em água destilada por 10 minutos. Em seguida, lave-os três vezes com PBS estéril. Prenda as juntas PDMS ao redor da região do padrão e pressione com firmeza.

Em seguida, semeie progenitores cardíacos em substratos de micropadrão de fibronectina. As imagens a seguir são de um gráfico de citometria de fluxo representativo do sexto dia de células ES diferenciadas in vitro. Esta imagem mostra o gating na amplitude de dispersão direta FSCA e na amplitude de dispersão lateral SSCA.

Isso permite a separação de células inteiras dos detritos celulares. Aqui, o bloqueio no FSCA e a largura de dispersão direta FSCW são vistos. Isso permite o isolamento de singlets celulares de dupletos e outros agregados celulares.

Esta imagem mostra o gating no SSCA e a dispersão com o SSCW. Isso aumenta a pureza das camisetas celulares. Esta imagem mostra o bloqueio na coloração FSCA e DPI que permite o isolamento de células negativas de DPI viáveis de células não viáveis.

Aqui gating para fico, rine, PE e PE ciano em DI sete PE SI sete é visto. Isso permite que os glóbulos vermelhos positivos verdadeiros e os vermelhos negativos verdadeiros sejam obtidos e os glóbulos vermelhos negativos autofluorescentes sejam excluídos. Essas imagens mostram o bloqueio de CA e PEA de ajuste de amplitude de isotiocianato de fluoresceína que permite que as células verdes verdadeiras positivas e verdes negativas verdadeiras dentro das populações vermelhas positivas e vermelhas negativas sejam classificadas.

A purificação por fax de células ES diferenciadas in vitro revela quatro populações distintas de progenitores, como visto neste gráfico de citometria de fluxo. As quatro populações distintas de progenitores são vermelho, verde positivo, vermelho positivo, verde positivo, vermelho negativo, verde negativo positivo e vermelho verde negativo negativo. Esta imagem representativa de microscopia de imunofluorescência mostra substratos de fibronectina micropadronizados.

A barra de escala representa 80 mícrons. Esta imagem mostra microscopia de imunofluorescência representativa de fatos derivados de embriões, progenitores isolados nos painéis superiores e fatos derivados de ESL, progenitores isolados nos painéis inferiores após mais cinco dias de cultivo em núcleos de micropadrões de fibronectina corados de azul. A alfa actinina sarcomérica vermelha manchada de S-M-M-H-C-A aparece em verde.

A barra de escala é de 40 mícrons. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar tecido miocárdico funcional anisotrópico a partir de uma fonte celular renovável de prótus cardíaco.