Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios In vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é ativar ou silenciar rapidamente populações neuronais geneticamente definidas em uma escala de tempo fisiologicamente relevante. Isso é conseguido entregando um vetor viral que transporta transgenes que codificam o neurônio da luz azul ativando a opsina do canal ou o neurônio da luz verde silenciando a opsina hall para neurônios geneticamente definidos. Como segundo passo, é construída uma estrada de operação emissora de luz que consiste em uma fibra óptica afixada a um eletrodo de gravação, que permite o fornecimento simultâneo de luz e gravação elétrica.

Em seguida, o TRO é posicionado e abaixado na região cerebral transduzida por Opsina. Para evocar respostas mediadas por opsina de canal e opsina ha, são obtidos resultados que mostram ativação e inibição induzida por luz de neurônios transduzidos por canal redsin e ha hallin com base na técnica de gravação de unidade única que permite o registro de neurônios individuais. Este método atende a uma necessidade fundamental da neurociência, permitindo-nos determinar exatamente o quão eficaz a luz pode ser na condução da atividade neuronal com resolução de tempo de milissegundos e em subtipos neurais específicos e demonstrando isso será Chin Nakamura.

Um pós-doutorado em meu laboratório Garantir que os procedimentos de nível um de biossegurança sejam seguidos durante a preparação e manuseio do vírus e que todas as diretrizes locais e governamentais relativas aos animais sejam observadas. Antes da injeção estereotáxica, permita que uma alíquota do vírus descongele no gelo e, em seguida, gire brevemente para baixo. Em uma centrífuga de bancada, encha lentamente uma seringa de vidro Hamilton e uma agulha com uma pequena quantidade de silicone ou óleo mineral.

Certifique-se de que não haja bolhas de ar visíveis no corpo da seringa. Insira a seringa em uma bomba microinjetora e conecte a bomba diretamente ao braço estereotáxico vertical. Depois de colocar o tubo de alíquota de vírus em uma posição estável, abaixe o braço estereotáxico até que a ponta da agulha toque o fundo do tubo de alíquota de vírus.

Use o controlador da bomba microinjetora para retirar o volume desejado de vírus. Depois de anestesiar um rato com cetamina e xilazina, verifique a resposta reflexa a uma pitada no dedo do pé para garantir uma profundidade adequada de anestesia usando métodos assépticos padrão. Coloque o animal em um aparelho estereotáxico depois de fazer uma incisão na linha média através da pele no topo do crânio do animal com uma pequena tesoura cirúrgica ou bisturi.

Separe suavemente o tecido conjuntivo e limpe a parte superior do crânio com um pequeno raspador ósseo. Abaixe a agulha e verifique se as coordenadas Z para bgma e lambda são iguais para estabelecer que a cabeça está nivelada. Em seguida, mova o braço estereotáxico para as coordenadas correspondentes à estrutura cerebral de interesse.

Marque o local pretendido da injeção com uma caneta cirúrgica. Use uma broca manual para afinar cuidadosamente o crânio sobre a área-alvo. Pare quando a broca atingir a parte inferior do crânio e use uma pinça extra fina para remover o osso afinado.

Depois que a dura-máter for exposta, posicione a agulha da seringa sobre a área-alvo e abaixe a agulha até que ela toque a dura-máter. E use este ponto para calcular o z. Coordene agora muito lentamente, abaixe a agulha de injeção no cérebro até que a posição Z adequada seja alcançada.

Neste protocolo, a região pré-límbica do córtex pré-frontal medial é direcionada. Injete o vírus a uma taxa de 0,1 microlitros por minuto. Após a conclusão da injeção, aguarde 10 minutos antes de retirar a agulha para evitar o refluxo do vírus para a superfície do cérebro.

Depois de usar uma sutura de costura com agulha anexada para selar a pele, aplique antibióticos na ferida. Primeiro, conecte um eletrodo de tungstênio de um a 1,5 mega ohm a um tubo capilar de vidro usando supercola. Em seguida, use uma ferramenta de decapagem de fibra para expor a extremidade nua de uma fibra óptica multimodo e limpe a ponta da fibra com etanol levemente.

Marque a ponta da fibra com uma faca de diamante em forma de cunha e use uma pinça fina para remover cuidadosamente o excesso de fibra. A fibra deve clivar facilmente na pontuação. Use um medidor de potência óptica para medir a intensidade do laser na ponta da fibra óptica.

Para gravações in vivo, a intensidade da luz de apenas 20 a 100 miliwatts por milímetro quadrado pode evocar de forma confiável a ativação ou silenciamento mediado por canal redsin ou hallin, respectivamente, da atividade neuronal. Em seguida, insira a fibra óptica no tubo capilar. Posicione a ponta da fibra aproximadamente 500 mícrons acima da ponta do eletrodo de tungstênio e amarre um fio de sutura fino duas vezes em alguns pontos próximos à ponta para que o eletrodo e a fibra fiquem retos.

Certifique-se de que a distância entre a ponta do eletrodo e o nó mais próximo seja longa o suficiente para a inserção na região alvo, como visto aqui. Prepare o animal para a cirurgia como antes. Em seguida, use a craniotomia inicial como guia para fazer uma janela nova, limpa e pequena no crânio.

Para posicionar o tro. Use uma agulha fina para fazer uma pequena incisão na dura-máter. Abaixe cuidadosamente o TRO através da janela do crânio e no cérebro para a região transduzida usando um manipulador de micrómetro.

Em seguida, avance o offroad lentamente em passos de 10 a 50 mícrons até o surgimento de uma célula responsiva à luz. Aqui, uma interface de usuário de software personalizada escrita em exibição de laboratório é usada para controlar o laser de diodo único e para visualizar e registrar a atividade neural contínua. Os sinais gravados são capturados com uma passagem de banda do amplificador ex AMP 20 K filtrada de 0,3 a oito kilohertz e uma placa analógica para digital de um instrumento nacional.

A interface de usuário do neuro lux Pro permite a escolha de entradas analógicas e saídas digitais. Escolha dois canais analógicos para a lógica do transistor neuronal e transistor ou sinal TTL. Defina a taxa de amostragem em 20 kilohertz, o período de pré-luz da linha de base para dois segundos e o período pós-luz para dois segundos.

Em seguida, defina a largura de pulso, a frequência e o período de estimulação da estimulação a laser TTL. Aqui a frequência é de 20 hertz e o período de estimulação é de 500 milissegundos, o que significa que são fornecidos 10 pulsos de laser com largura de pulso definida. O usuário pode escolher entre a entrega contínua de luz ou para gravações repetidas.

Eles podem escolher o intervalo entre os pulsos e o número de tensões de pulso. Os dados podem ser adquiridos com ou sem gravação em disco Após a gravação. O animal é sacrificado de acordo com procedimentos aprovados e o tecido cerebral é processado para verificar a colocação da erosão e a expressão da opsina, conforme mostrado aqui.

Esta captura de tela da interface do software Neuro LX Pro configurada para entrega simultânea de luz e gravação eletrofisiológica mostra o silenciamento induzido por Hall Rod Dobson da atividade espontânea da célula parametálica pré-límbica do rap em resposta a 10 segundos de entrega contínua de luz de 532 nanômetros. Esta fotografia mostra a expressão representativa de hallo redsin no ulu dorsal. O esquema à direita representa o local onde a fotografia foi tirada.

A ponta da seta indica a posição do eletrodo de tungstênio e a seta indica a posição da fibra óptica. Esta fotografia mostra a expressão representativa da opsina do canal no córtex pré-límbico. Novamente, o esquema à direita representa o local onde a fotografia foi tirada.

A ponta da seta indica a posição do eletrodo de tungstênio e a seta indica a posição da fibra óptica. Este traço de exemplo registrado do córtex pré-límbico de rato mostra o canal redsin dois potenciais de ação acionados em resposta à entrega de 20 hertz de 473 nanômetros azuis, pulsos de luz por 10 milissegundos cada, conforme indicado pela barra azul. Abaixo. O gráfico raster mostra o pico induzido pela redsina do canal em seis neurônios representativos.

Cada atividade unitária é plotada como um ponto. Este traço de exemplo mostra a supressão induzida por opsina hall da atividade espontânea durante a iluminação contínua da luz verde de 532 nanômetros por 10 segundos, conforme indicado pela barra verde na mesma região do cérebro. O gráfico raster mostra o silenciamento induzido por Haller dosin em seis neurônios representativos.

Cada atividade unitária é plotada como um ponto. Esta imagem mostra o pico repetitivo de 20 hertz de um neurônio parametálico pré-límpico de rato in vivo traços de voltagem da luz evocada, cravada, adquirida nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90 e 120 minutos após o início das gravações são exibidos no lado esquerdo. No lado direito, o gráfico raster mostra todas as 61 repetições da ativação induzida pela luz.

Cada atividade unitária é plotada como um ponto. Aqui in vivo, registros eletrofisiológicos de Haller Dossin transduzido em ratos O traço de exemplo demonstra que a iluminação contínua de 532 nanômetros de 10 segundos indicada pela barra verde do subm dorsal que expressa Hall Dobson elimina a atividade espontânea.

Abaixo estão as formas de onda médias das duas unidades registradas do traço acima. O limiar de amplitude foi usado para identificar dois neurônios distintos. Finalmente, o gráfico raster mostra cinco repetições de silenciamento induzido por dossina de Haller dessas unidades.

Cada atividade unitária é plotada como um ponto. Finalmente, esta imagem mostra o pico repetitivo de opsina do canal de 20 hertz de um neurônio subular dorsal de rato traços de voltagem in vivo da luz evocada, cravada, adquirida nos pontos de tempo 0, 30, 60, 90 e 120 minutos. Depois que o início das gravações for mostrado à esquerda, a inserção abaixo mostra a atividade de bursting típica desta célula.

O gráfico raster à direita mostra todas as 61 repetições da ativação induzida pela luz. Cada atividade unitária é plotada como um ponto. Essa técnica é importante porque demonstra que subtipos neurais específicos podem ser ativados ou silenciados por longos períodos de tempo.

Na verdade, demonstramos que podemos ativar neurônios por mais de duas horas e aplicá-los. Em última análise, o objetivo seria aplicar isso ao animal que se comporta em animais que estão realizando tarefas de atenção ou memória, para que possamos ativar circuitos específicos e ver como isso controla diferentes funções de memória.