Name: Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a purificar exossomos do sangue e meios de cultura por centrifugação diferencial e isolar microRNAs para análise quantitativa. Este método permite identificar biomarcadores em vesículas extracelulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado por fundos de Rita Allen doação da Fundação para Seena Ajit. Os autores gostariam de agradecer Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy da Universidade da Carolina do Sul Centro de Microscopia Eletrônica para o uso do instrumento, assistência técnica e científica.

Todos os experimentos com amostras de sangue de humanos e roedores foram executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Seres humanos foram registrados após o consentimento informado aprovado pela Drexel University College of Medicine Institutional Review Board e todos os procedimentos de estudos realizados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Drexel. 1. Purificação exossomo de sangue (~ 5,5 h) DICAS <ul><li class="jove_content"> Nós ressuspender exossomos a partir de um tubo de sangue (~ 10 ml de sangue humano e ~ 2 ml de sangue mouse) em 300 mL de tampão de lise RNA a partir do kit de isolamento miRNA miRvana. </li><li class="jove_content"> Para purificar exosomes de meios de cultura de células, o meio é centrifugado a 500 xg durante 10 min para remover as células e também filtrada através de um filtro de 0,22 um, após centrifugação a 12.000 x g. A purificação exosome de meios de cultura celularnão necessita de diluição em PBS, PBS ou a solução de lavagem do segundo passo de ultracentrifugação. </li><li class="jove_content"> Se forem utilizados os exosomes purificadas para estudos de proteómica, a adição de um passo de centrifugação em gradiente de sacarose após o passo de ultracentrifugação vai diminuir a quantidade de agregados de proteína e contaminantes 15. </li><li class="jove_content"> A morfologia observada de exosomes pode variar de acordo com a fonte e as etapas de processamento para a ETM. Não observamos a morfologia em forma de copo para exossomos, que foi anteriormente atribuído a diferenças no processamento da amostra 9,15. Nossas imagens TEM, incluindo a rotulagem immunogold são semelhantes aos relatos anteriores de diferentes fontes, incluindo sangue, biliar e cultura cortical derivado exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Inverter EDTA tubo de revestimento que contém o sangue de 5x e coloque na posição vertical à temperatura ambiente por 10-60 min. </li><li> Centrifugar a 2.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Recolher a fase superior, o plasma, em tubos de 15 ml e guardar em gelo. </li><li> Dilui-se fluido com um volume igual de PBS. Centrifugar 30 min a 2000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transferir para tubos de centrífuga, adicionar 1X PBS, para um volume total de 24 ml e centrifugar 45 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transfira para os tubos de ultracentrifugação e centrifugar 2 horas a 110.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o pellet em PBS e centrifugar 1 hora a 100.000 x g a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão apropriado (tampão de lise de ARN). </li><li> Ressuspender em PBS ou tampão RIPA para microscopia eletrônica e análise de western blot, respectivamente. </li></ol> 2. Purificação de RNA usando um kit de isolamento miRvana miRNA modificação (~ 1 hora) DICAS <ul><li class="jove_content"> Preparar a área para isolar RNA, usando equipamentos de proteção individual (EPI), limpando superfícies e pipetas com RNase Zap, e usando pontas com filtro estéreis e tubos. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora o protocolo do fornecedor dá a opção de purificação só miRNA, sempre isolar RNA totais, incluindo mRNA e miRNA para que possamos estudar tanto a partir da mesma amostra. </li><li class="jove_content"> Adicionando um passo de tratamento de DNase na coluna remove vestígios de ADN que podem estar presentes. Dependendo da fonte de exosomes, o DNA foi relatado que estavam ausentes em exosomes purificadas a partir de algumas fontes, incluindo o rato e as linhas de mastócitos humanos 8 mas as sequências de ADN cromossómico foram detectados em exosomes purificadas a partir de meios de cultura de cardiomiócitos 18. </li><li class="jove_content"> Nós reduziu o volume de solução de lavagem de 1-350 ul (Passo 2.4), porque o fornecedor disponibiliza apenas suficiente uma solução de lavagem para uma adição de 700 ul. Se o volume não seja reduzido, não há solução suficiente deixada para utilizar todo o conteúdo do kit. Demais etapas foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. </li></ul><ol><li> Adicione 1/10 volume de aditivo miRNA homogeneizado (30 uL) e incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Extrai-se com um volume de ácido-fenol: clorofórmio, igual ao volume de lisado inicial. Centrifugar e recuperar a fase superior num novo tubo. </li><li> Adicionar 1,25 volumes de etanol a 100% (375 ul). Vortex. Aplicar para filtro de cartucho e centrifugar 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicione metade do volume de miRNA solução de lavagem recomendado 1 (350 mL) e centrifugar 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicionar 10 ul de DNase 1 a 70 ul de tampão de RDD (Qiagen) para cada amostra. Adicionar 80 ul para a coluna e incubar 15 min temperatura ambiente. </li><li> Adicionar uma solução de lavagem (350 ul) e de centrifugação de 15 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adicionar solução de lavagem de 2/3 (500 mL) e centrifugar 15 s a 10.000 x g. REPEAT. </li><li> Eluir com 40 ul de 95 ° C sem nuclease H2O </li><li> Determinar a concentração de ARN e diluir o ARN a 100 ng / mL. </li></ol> 3. miRNA Profiling de Exosomes de Blood Usando Taqman Low Density Array (TLDA) Cartões (~ 6,5 hr) DICAS <ul><li class="jove_content"> Preparar a área para isolar RNA, vestindo PPE, limpando superfícies e pipetas com RNase Zap, e usando pontas com filtro estéreis e tubos. </li><li class="jove_content"> Pré-amplificação passo (pré-amplificador) é recomendado para 1-350 ng de RNA (350-1,000 amostras ng não requerem passo de pré-amplificador, após a síntese de cDNA). É importante determinar se o pré-amplificador é necessário para a sua amostra porque você deve tratar todas as amostras em condições de igualdade. Passo para pré-amplificador adiciona custo e os valores de Ct mais baixo tem um cut off aceitável (32 em vez de 40). </li><li class="jove_content"> É útil para preparar a reacção de cDNA em tubos em vez de uma tira de chapa de acordo com o número de cartas que pode ser executado num único dia. Isto irá minimizar a congelação-descongelação de amostras de cDNA que não serão processados ​​no mesmo dia. </li><li class="jove_content"> Exossomos provenientes de diferentes fontes têm difealugar quantidades de RNA. Este protocolo permite que um máximo de 3 ul de molde de ARN para a reacção de síntese de cDNA. Dependendo da fonte, a quantidade de RNA exosomal que pode ser isolado talvez limitada. Enquanto um tecido típico renderia o suficiente RNA que cDNA seria feito a partir de 100 ng de RNA em 3 mL de volume, exossomos de sangue humano ou de meios de cultura de células humanas, muitas vezes contêm menos RNA e cDNA deve ser feita a partir de material menos de partida. Rato exosomes sangue contêm níveis mais elevados de RNA e de pelo menos 100 ng em 3 ul pode ser obtida. </li></ul><ol><li> Para preparar cDNA a partir de RNA usando Pools Megaplex purificada primers da transcriptase reversa (Grupo A e Grupo B contêm primers para os miRNAs em cartões microfluídicos matriz A e B), descongelar os componentes de reação no gelo. </li><li> Rótulo dois tubos de 1,5 ml RNase para reação de RT com tanque primers ou Grupo B primários e adicionar componentes a fim gráfico. Adicionar pelo menos um volume adicional de componentes de dois ou mais reacções ou fazer uma mistura principal, tal como recomendado por tele fornecedor. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componentes da reacção RT </td><td> Concentração Componente </td><td> Volume de uma amostra (total V / amostra = 4,5 mL) </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td></td><td> 0,20 mL </td></tr><tr><td> Megaplex tampão RT (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 mL </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 4,4 mM </td><td> 0,20 mL </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 5mM </td><td> 0,90 mL </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 mL </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers A ou B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 mL </td></tr><tr><td> MultiScribe transcriptase reversa </td><td> 75 U </td><td> 1,50 mL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Inverter tubos de 6 vezes e centorifuge brevemente. Em seguida, pipeta de 4,5 ul da mistura de reacção de RT em 8 MicroAmp Tiras de tubo ou uma placa de reacção óptica de 96 poços MicroAmp. </li><li> Adicionam-se 100 ng de RNA e ajustar o volume para 3 mL de água tratada com DEPC ou adicionar 3 ul de RNA total, misture com a ponta da pipeta, e fechar os tubos ou de placas. Girar rapidamente e incubar no gelo por 5 min. </li><li> Carregar a reacção para dentro da máquina de PCR e executá-la sob as seguintes condições (como recomendado pelo protocolo da Applied Biosystems Megaplex Piscinas): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapa </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> Ciclo (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 seg </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 4 ° C, </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Armazenar de cDNA a -20 ° C (boa durante pelo menos uma semana), ou continuar a etapa de pré-amplificação que podem ser armazenadas durante uma semana. </li><li> Descongele primers pré-amplificador para o Grupo A e Grupo B no gelo e inverter para misturar. Swirl Taqman Pré-Amp mestre misturar e manter em gelo também. </li><li> Seguir o gráfico de adição de pelo menos um volume adicional de componentes de dois ou mais reacções ou fazer uma mistura principal, tal como recomendado pelo fornecedor. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente Reação Pré-Amp </td><td> Volume de uma amostra </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7,5 mL </td></tr><tr><td> Taqman Mix Master PreAmp (2X) </td><td> 12,5 mL </td></tr><tr><td> Primers pré-amplificador Megaplex A ou B (10x) </td><td> 2,5 mL </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipetar 2,5 mL RT product MicroAmp em tiras de 8-tubo ou uma placa de reacção óptica de 96 poços e dispensar MicroAmp 22,5 ul da mistura de reacção PreAmp para cada poço. </li><li> Selar a placa, incubar no gelo 5 min e em seguida, coloque a amostra na máquina de PCR. Executar sob as seguintes condições. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapa </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Ciclo (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 seg </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Manter </td><td> 4 ° C, </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Após a reacção do pré-amplificador é terminado, centrifugar brevemente os tubos ou as placas e, em seguida, adicionar 75 ul de 0,1 x TE pH 8,0 a cada poço ou tubo. </li><li> Seal e misture e girar rapidamente. Armazenar o produto diluído durante uma semana a -20 ° C, ou continuar a carregar a placa. </li><li> Combinar o seguinte num tubo de 1,5 ml RNase em gelo. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume de um cartão </td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 mL </td></tr><tr><td> Produto pré-amplificador diluído </td><td> 9 mL </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 441 mL </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Inverter o tubo de misturar e centrifugar brevemente. Pipetar 100 ul da mistura de reacção de PCR em cada porta do cartão de matriz MicroRNA Taqman. </li><li> Centrifugar o cartão de 2 x 1.000 xg por 1 min. Selar a placa e executá-lo usando o modelo fornecido com os primers no manual da Applied Biosystems e os Taqman configurações de matriz densidade 384 bem baixa. Usamos Applied Biosystems 7900HT Rápido Real-Time PCR System. </li></ol> 4. Análise por ARNm Taqman (~ 1,5 h) <ol><li> Para preparar a reacção de qPCR, misturar os componentes da reacção, no fim do gráfico. Todas as amostras serão analisados ​​com sondas de iniciadores para o gene de interesse, bem como rRNA 18S como normalizador do gene. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Reacção de componentes Taqman </td><td> Volume de uma amostra </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7 ul (ajuste com base na amostra individual) </td></tr><tr><td> Taqman rápido Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Sondas Taqman iniciadores (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> cDNA a partir de 100 ng de ARN </td><td> 2 &amp; mu, L (ajuste com base na amostra individual) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Executar a placa de 96 poços utilizando o bloco de 96 poços rápida, tal como recomendado pelo fabricante (Applied Biosystems 7900HT Rápido Real-Time PCR System). </li></ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148(2008).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282(2011).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+RNAs%3A+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev.+RNA%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li>
<li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).</li>
<li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li>
<li>Fauré, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li>
<li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA%2FRNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653(2012).</li>
<li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+proteomic+insights+and+diagnostic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li>
<li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li>
<li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNA%3A+A+new+source+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li>
<li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li>
<li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta+2012%3A+database+of+exosomal+proteins%2C+RNA+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, vamos mostrar a quantificação dos miRNAs e mRNAs de exossomos purificados por centrifugação diferencial dos meios de sangue e cultura. Exosomes têm diversos componentes que dependem da sua origem e estão envolvidos em várias funções biológicas, incluindo a resposta imunológica, a apresentação de antigénio, a comunicação intracelular, bem como a transferência de RNA e proteínas 9,11,12,19,20. Embora a forma e tamanho é um determinante de pureza exossomo, uma série de artigos que mostram dados ...

MiRNAs noncoding Curtas modular a expressão do gene por ligação ao ARNm alvo. Semente sequência complementaridade de pares de bases ~ 7 permite miRNA se liguem ao ARNm alvo, resultando na inibição da tradução ou na redução na estabilidade do mRNA, o que pode resultar na diminuição da expressão da proteína alvo 1. Pesquisas na última década tem se mostrado inequivocamente um papel fundamental para miRNAs em mediar funções celulares. Também tem havido considerável esforço dirigido para dissecar miRNA alterações moleculares subjacentes a diversas doenças mediadas por 2,3. Além disso, a recente identificação de miRNAs estáveis ​​em fluidos corporais 4-6 pavimentou o caminho para a sua utilização como novos biomarcadores passíveis de diagnóstico clínico. Um modo de transporte miRNA em fluidos corporais é via exossomos, pequenas vesículas que transportam mRNAs, proteínas, mediadores lipídicos e miRNAs em células receptoras via cir arterial sistêmicaion 7-14. Isto resulta na modulação da expressão de genes em células do receptor e representa um novo mecanismo de comunicação celular. Por exemplo, as células são capazes de modular processos de imuno-regulação através da secreção e / ou absorventes exosomes contendo biomoléculas envolvidas na inflamação, tais como a interleucina-1β (IL1β), factor de necrose tumoral α (TNF), factor de crescimento transformante-β5 (TGFβ5) e os miRNAs que regulam estes genes 13. Como expressão de miRNA aberrante é uma característica comum em uma variedade de doenças humanas, estas moléculas oferecem novas oportunidades para a descoberta e validação de novos alvos terapêuticos 2. Circulating miRNAs estão presentes em todos os fluidos corporais e é sabido que a composição do exosomes é diferente baseada nas células de origem a partir do qual eles foram libertados. Assim, eles oferecem um caminho para estudar o estado fisiológico das células e como as células alteram a sinalização atéts em resposta ao estresse, incluindo doenças. Estudar as alterações na composição exosome pode fornecer insights sobre a transdução de sinal e investigar a sua utilidade potencial como biomarcadores ou rotas de intervenção terapêutica. Aqui vamos demonstrar a purificação de exossomos a partir de várias fontes baseadas em protocolos publicados. Estes exosomes será usado para o isolamento de ARN seguida por qPCR para identificar e medir os níveis de miRNAs presentes nas exosomes.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer revestido com EDTA (tubos de 10 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>Para purificação de exossomos de sangue humano</td></tr><tr><td>Vacutainer revestido com EDTA (tubos de 2 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Para purificação de exossomos de sangue de camundongo Tubo de</td></tr><tr><td>RNA de sangue PAXgene</td><td>BD Diagnostics</td><td>762165</td><td>Para isolamento de miRNA de sangue total kit de</td></tr><tr><td>isolamento de microRNA miRVana</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-fenol: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, Sem AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4326614</td><td>Para cartões TLDA</td></tr><tr><td>Conjunto de piscina de roedores Megaplex RT v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de piscina de roedores de pré-amplificador Megaplex v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Conjunto de</td></tr><tr><td>MicroRNA A+B para roedores 4444747 Taqman Array V3.0</td> Conjunto <td>de</td> piscina humana 4444909 <td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT da Applied Biosystems V3.0</td> Conjunto <td>de</td> piscina humana de pré-amplificador 4444745 <td></td><td></td></tr><tr>Megaplex da <td>Applied Biosystems</td><td>v3.0</td> Conjunto <td>de</td> cartões A+B de microRNA humano Taqman Array da Applied Biosystems 4444748 <td></td></tr><tr><td>v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Kit MicroRNA RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman fast universal PCR master mix </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>Para mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fator de necrose tumoral (sonda de primer)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento endotelial vascular A (sonda de primer)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima First Strand cDNA Kit de síntese para RT-qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>para anticorpo de mRNA</td></tr><tr><td>HSP70</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>para western blot</td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Para microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>Coelho-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Níquel 300 malha de carbono formvar grades</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Grades formvar de carbono de cobre 300 mesh</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>FCF300-</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Tabela de reagentes específicos.</td></tr></tbody></table>

purificação e microrna profiling de exosomes derivados do sangue e meios de cultura

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

MiRNAs estáveis ​​estão presentes em todos os fluidos do corpo e em alguns miRNAs circulantes são protegidos da degradação por sequestração em pequenas vesículas chamadas exosomes. Exosomes podem fundir com a membrana plasmática que resulta na transferência de RNA e proteínas da célula-alvo. As suas funções biológicas incluem resposta imune, a apresentação de antigénio, e a comunicação intracelular. Entrega de miRNAs que podem regular a expressão do gene em células receptoras através do sangue, abriu novas possibilidades para intervenção alvo. Além de oferecer uma estratégia para a entrega de medicamentos ou agentes terapêuticos RNA, o conteúdo exosomal podem servir como biomarcadores que podem ajudar no diagnóstico, determinar as opções de tratamento e prognóstico. Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para exosmarcadores Omal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse. Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal em pacientes, modelos de roedor e meios de cultura de células antes e após a intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostrar variations em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas. Aqui vamos descrever o procedimento para analisar quantitativamente miRNAs e RNAs mensageiro (mRNA) de exossomos secretados no sangue e meio de cultura de células. Purificados exosomes será caracterizado através da análise de western blot para marcadores exosomal e PCR para mRNAs de interesse. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e immunogold rotulagem será usado para validar exosomal morfologia e integridade. O RNA total será purificada a partir destes exosomes para assegurar que podemos estudar tanto mRNA e miRNA partir da mesma amostra. Depois de validar a integridade do RNA por Bioanalyzer, vamos realizar um meio de transferência quantitativa PCR em tempo real (qPCR) para identificar o miRNA exosomal usando Taqman Matriz de Baixa Densidade (TLDA) cartas e estudos de expressão gênica de transcrições de interesse. Estes protocolos podem ser utilizados para quantificar as alterações na miRNAs exosomal in pacientes, modelos de roedores e meios de cultura de células antes e depois da intervenção farmacológica. Conteúdo exosomal variar devido à fonte de origem e as condições fisiológicas de células que secretam exossomos. Essas variações podem fornecer uma visão sobre como as células e os sistemas de lidar com o estresse ou perturbações fisiológicas. Nossos dados representativos mostram variações em miRNAs apresentam em exossomos purificados a partir do sangue mouse, sangue humano e os meios de cultura de células humanas

Após o isolamento exosomes de meios de cultura de sangue ou de células, a pureza das exosomes pode ser testado por microscopia electrónica (ME) e Western blot (Figuras 1A e 1B). Confirmámos a nossa preparação exosome partir de várias fontes com EM e western blot utilizando anticorpos múltiplos. Figura 1A mostra imagens EM confirmando que exosomes estão intactas com um diâmetro de 30 ~ -100 nm e contêm CD81 por imuno rotulagem. Marcadores exosomal comumente utilizados sã...

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar e quantificar microRNAs presentes em exossomos obtidos de sangue ou meio de cultura celular. Isso é realizado primeiramente purificando exossomos de sangue ou meio de cultura celular por meio de centrifugação diferencial. O segundo passo consiste em purificar o RNA exossomal total, utilizando um kit de isolamento de microRNA Nirvana.Após confirmar a integridade e a concentração do RNA purificado, este é convertido em CDNA utilizando reagentes do kit de reação de transcriptase reversa Megaplex. Em seguida, realiza-se um passo de pré-amplificação utilizando os iniciadores Megaplex de pré-amplificação e a mistura mestra de pré-amplificação Attack Man. Para amplificar os microRNAs, o passo final consiste em realizar uma reação de PCR em tempo real utilizando 2 cartões microfluídicos de 384 poços ou cartões de matriz de baixa densidade TAC Man, contendo os iniciadores marcadores TAC MAN liofilizados.Em última análise, este procedimento permitirá a detecção de até 758 microRNAs conhecidos. Esta técnica mede variações no conteúdo de microRNAs exossomais que dependem da fonte e das condições fisiológicas nas quais são secretados. As implica

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo demonstra métodos para o isolamento, purificação e detecção de exossomos, bem como técnicas para análise de seu conteúdo molecular. Estes métodos são adaptáveis ​​para o isolamento exossomo de ambos os meios de cultura celular e fluidos biológicos, e podem além da análise de conteúdo molecular também ser útil em estudos funcionais.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Aqui, descrevemos dois protocolos de isolamento de vesículas extracelulares, centrifugação de ultrafiltração e ultracentrifugação com centrifugação gradiente de densidade, para isolar vesículas extracelulares de amostras de fluido de lavagem broncoalveolar murino. As vesículas extracelulares derivadas do líquido de lavagem broncoalveolar murino por ambos os métodos são quantificadas e caracterizadas.

Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Um exossomo é uma nova geração de portadores de entrega de drogas. Estabelecemos um protocolo de isolamento do exossomo com alto rendimento e pureza para a entrega de siRNA. Nós também encapsulados fluorescente etiquetado siRNA inespecífico em exosomes e investigou a absorção celular de siRNA-carregado exosomes em células cancerosas.

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Aprenda a purificar exossomos do sangue e meios de cultura por centrifugação diferencial e isolar microRNAs para análise quantitativa. Este método permite identificar biomarcadores em vesículas extracelulares.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Explorar mais vídeos