Name: Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a cultivar fatias de embrião de galinha para manter o desenvolvimento normal de neurônios motores espinhais por 24 horas. Este método utiliza microscopia de imunofluorescência para visualizar estruturas neuronais em neurobiologia do desenvolvimento.

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Gostaríamos de agradecer a Boast Sharon para discussões perspicazes e muitos Novitch B. para o presente tipo de anticorpos de FOXP1. Este trabalho como financiado por uma bolsa de estudo do Wellcome Trust para KCT e uma subvenção projeto do Wellcome Trust para SRP (Grant número de referência 094399/B/10/Z).

1. Faça soluções necessárias <ol><li> 1 M de tampão fosfato:. Pesar 109,4 g de Na 2 HPO 4 e 32 g de NaH 2 PO 4 H 2 0, misturar e dissolver em água a um volume total de 1 litro. </li><li> Tampão fosfato salino (PBS): Preparar tampão fosfato 0,1 M, 0,15 M NaCl. 100 ml de PBS deve ser suficiente para o processamento de lâminas a partir de 10 embriões. </li><li> Agarose: Aquecer uma solução de PBS para cerca de 70 ° C e adicionar sólida baixa temperatura de fusão agarose lentamente sob agitação contínua. Tornar a solução para uma concentração final de 4% (w / v) de agarose. Fazer um stock de 50 ml desta solução. Deixar a solução em um banho de água mantido a 48 ° C até serem necessárias. Qualquer solução de agarose não utilizada após a experiência pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas. </li><li> A solução de anticorpo de bloqueio: Adicionar soro fetal de vitelo e triton X-100 a uma Concentr definitivação de 1% (v / v) de soro fetal de vitelo, 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS. 10 ml de solução de bloco é suficiente para a imunocoloração de 5 lâminas de corte no criostato. </li><li> Fixador: Preparar 0,75 milímetros NaOH, paraformaldeído a 4% (w / v) (CUIDADO). Para preparar quantidade de calor necessária fixador de água a 70 ° C, adicionar NaOH concentrado a concentração final desejada, adicionar paraformaldeído sólido e mistura-se até dissolver. Arrefecer em gelo a 4 ° C. 10 ml desta solução é suficiente para 20 poços de fatias de embriões. </li><li> Solução de sacarose: Preparar 10 ml de uma solução de sacarose a 30% (w / v) contendo 0,1 M de tampão fosfato. 10 ml desta solução é suficiente para 10 poços de fatias de embriões. </li><li> 70% (v / v) de etanol. Diluir 70 ml de etanol absoluto com 30 ml de água. </li><li> Meio de Cultura: Prepara-se uma solução de extracto de embrião de galinha a 1%, 1% Penicilina / Estreptomicina, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoethAnol, 4% de soro de galinha, 2% de suplemento B27 e 100 ng / ml de factor de crescimento ciliaryneurotrophic (CNTF) diluídos em meio neurobasal, preparada em gelo e usados ​​no mesmo dia. 10 ml de meio de cultura é necessário para 20 poços de fatias de embriões. </li></ol> 2. Preparação embrião de galinha <ol><li> Colocar ovos fertilizados de galinhas com o lado mais comprido na horizontal de tiragem forçada incubadora a 38 ° C até que elas se desenvolvem para a fase 15 24. Isto geralmente requer cerca de 4 dias de incubação. </li><li> No segundo dia de incubação, esterilizar a casca do ovo, limpando com um lenço de papel embebido em etanol a 70%. Cuidadosamente perfure a extremidade plana da casca do ovo usando uma agulha de calibre 21 ligada a uma seringa de 5 ml e 5 ml de remover da albumina. Isso diminui o embrião para longe do reservatório de modo que o embrião não é prejudicado quando o reservatório é aberto. Retornar os ovos na incubadora e incubar durante mais 2 dias. </li><li> Usando embotado Dumont # 5 fórceps carefully perfurar a parte superior central da casca e retire cerca de 9 cm 2 de shell. Corte em torno do embrião e, cuidadosamente, retire o embrião e local em HBSS durante a dissecção. Os embriões devem ser encenadas de acordo com Hamburger e Hamilton (1992) 15. Todos os embriões devem ser utilizadas no próximo a etapa 24. Quaisquer embriões que mostram quaisquer sinais de anormalidade deve ser descartada. </li><li> Remover a membrana âmnio, cório-alantóide membrana, a cabeça, e alantóide usando dois Dumont # 5 fórceps. Eviscerar o embrião para remover todos os órgãos internos. Para fazer isso, cortou a linha média ventral do embrião com micro tesoura de dissecção, manter o embrião em torno da região do tronco rostral com um par de fórceps, pegue a parte rostral do intestino e do coração e puxe caudalmente. É importante que isto seja feito de forma limpa. Você deve ser capaz de ver o embrião somitos claramente. Cortar o embrião ao meio, transversalmente entre o buds.Now membro superior e inferior do corpo aparar torácicaparede com uma tesoura microdissecção. </li></ol> 3. Preparação Slice embrião <ol><li> Remover a solução de agarose a partir do banho de água. Cortado a 5 cm do fundo de um plástico descartável 3 ml pipeta de Pasteur. </li><li> Remova cuidadosamente o meia lombar do embrião dissecadas de duas pinças para embalar o embrião da solução de dissecção e colocar em uma placa de Petri e seco. Utilizando a pipeta de Pasteur, remover cerca de 2 ml de agarose, pipeta de aproximadamente 0,5 ml por cima do embrião e depois aspirar a fatia de embrião para a pipeta. Transferir o embrião e uma casca de agarose para molde de plástico descartável tomar cuidado para não introduzir quaisquer bolhas no agarose. Diminuir suavemente o embrião para a parte inferior da agarose no molde de plástico com a secção torácica virada para baixo. O embrião deve ser posicionado para ser linear, utilizando uma agulha de calibre 21. As fatias conterá também parte do membro em desenvolvimento e é importante que a orientação do embrião no agarose vai permitir isso. Coloque o barco no gelo para definir a agarose. Tome cuidado para que o embrião não alterar a orientação durante este período (cerca de 2 min). </li><li> A Leica VT1000S vibratome (Velocidade 3, freqüência 4, 400 m de espessura) deve ser criado com a câmara de corte cheio de HBSS e cercado por água gelada. O bloco de agarose é então preso à plataforma vibratome com supercola. O bloco de agarose é aparado com uma lâmina de barbear para deixar a peça embrião com 1-3 mm de agarose que o rodeiam. As fatias, que incluem secções de brotos de membros com uma clara apical ectodérmico rebordo são seleccionados e as fatias são então colocados em HBSS. Geralmente, há apenas 1-2 fatias apropriadas por embrião. Remover suavemente a agarose em torno das fatias de tecido usando duas agulhas. É essencial que isso seja feito cuidadosamente e com cuidado. </li></ol> 4. Embrião Fatias de cultura <ol><li> Adicionar 500 ml de solução de cultura (descrita acima) para a proteced número de poços de um 24 bem baixo placa de fixação de ultra cultura tratada tecido. Transferir as fatias cuidadosamente a partir da solução de HBSS para o poço. Em geral, tentar ter 2-3 fatias em cada poço. Colocar a placa de 24 poços na incubadora de cultura de tecido a 37 ° C com 5% de CO2 durante 24 hr. </li></ol> 5. A secção dos Fatias de imunocoloração <ol><li> Após o período de cultura, adicionar 500 ul de solução não tamponada a cada poço de fatias de embriões e deixar em gelo durante 20 min. A solução total é então removido com cuidado e três lavagens de PBS são realizadas, com 5 min de intervalo. As fatias são então deixados em solução de sacarose a 4 ° C, até que o dissipador de fatias, de cerca de 6 horas, mas pode ser deixada durante mais tempo (por exemplo durante a noite). </li><li> Remover as fatias e dab largo solução de sacarose extra e equilibrar em cerca de 1 ml de outubro de cerca de 5 min a 20 ° C. Monte cada apartamento fatia em um molde de outubro cheio de casca de plástico descartável.Após a montagem, colocar os moldes verticalmente em gelo seco para solidificar. </li><li> Montar os blocos de outubro no criostato e equilibrar os blocos a -24 ° C durante cerca de 20 min. Corte cada fatia com 15 seções montadas em milímetros Superfrost-Plus slides. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 6. Imunofluorescência <ol><li> Pipetar 1-2 ml de PBS nas lâminas horizontais realizadas numa câmara humidificada com as lâminas colocadas a partir do fundo da câmara (usamos 1 ou 2 ml de pipetas de plástico fixados com fita de autoclave). Incubar as secções em PBS durante 5 min a 20 ° C para remover o excesso de outubro Remover a solução de PBS a partir do slide e adicionar 500 ml de uma solução de bloqueio ao longo das secções, incubar durante 30 min a 20 ° C. Remover a solução de bloqueio e imediatamente adicionar 500 ml de anticorpo primário diluído adicionado para as lâminas, incubar a 4 ° C por 18-22 horas. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário, e imediatamente foih as lâminas com 1 ml de PBS durante 5 min, três vezes a 20 ° C para remover o excesso de solução de anticorpo primário. Adicionar 500 ml de anticorpo secundário diluído ao longo das secções. As lâminas são, em seguida, deixada a 20 ° C durante 30 min. A solução de anticorpo secundário foi então removido e a corrediça lavadas 3 vezes 5 minutos em PBS a 20 ° C. </li><li> Seguindo estas lavagens, remover a última lavagem PBS, dab a borda da lâmina para remover o excesso de PBS, adicionar duas gotas de Vectashield nas lâminas e deite cuidadosamente uma lamela de vidro sobre as secções, evitando a formação de bolhas. Remover o excesso de Vectashield por blotting da borda das lâminas antes de imagiologia. </li></ol> 7. Imagem <ol><li> Imagem dos imunoistoquímica. Nós usamos uma Nikon Eclipse E80i microscópio de fluorescência equipado com um ER ORCA Hamammatsu câmera digital e 10 X, 20X e 40 X lentes objetivas. </li></ol>

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</ol>

Nenhum dos autores concorrência de interesses ou conflitos de interesse.

O protocolo aqui descrito permite uma fatia de embriões de galinha a ser incubadas durante mais de um dia, mantendo simultaneamente os neurónios motores vivo e continua a migrar durante o período de cultura. Em elucidar as condições para manter os neurônios motores vivo, nós identificamos várias características-chave necessários. Parece que o soro de pinto até 4% é crítica para a sobrevivência de neurónios motores e a sua substituição com soro a partir de uma espécie diferente não é tolerado. Curiosamente, verificou-se que a presença de maiores concentrações de soro eram prejudiciais para as fatias em que promoveu o crescimento excessivo do tecido conduzindo a grandes distorções em forma de fatia. Mais importante ainda, a presença do factor neurotrófico ciliar também provado crítica. Mantém-se uma possibilidade distinta que as fatias podem ser capazes de ser cultivadas por períodos consideravelmente mais longos do que apenas 24 horas, talvez mesmo permitindo a visualização de entrada de aferentes sensoriais para a medula espinhal. Além disso, a culcondições tura aqui também pode ser útil para cortar culturas do tronco cerebral desenvolvimento e mesencéfalo / cerebelo. Talvez a maior vantagem potencial na utilização destas condições de cultura fatia é que eles facilitam a possibilidade de manipulação farmacológica da função da proteína, enquanto minimiza o potencial de efeitos adversos sobre o resto do embrião, tais como o coração. Um grande número de inibidores e agonistas de diferentes vias de sinalização pode ser utilizado para avaliar a migração de diferentes subtipos de neurónios espinais e, potencialmente, o seu efeito na formação de circuitos locais durante o desenvolvimento da coluna vertebral. Além disso, algumas perturbações genéticas da expressão da proteína, tais como aqueles que fazem uso de siRNAs e oligonucleótidos morfolino, sofrem do facto de que eles só podem ser introduzidas no início do desenvolvimento (devido às limitações de electroporação em procedimentos in ovo) e os efeitos duram apenas um curto período de time (tipicamente de um dia). Nossa cultura fatia é iniciada em fases posteriores e oferece a possibilidade de utilizar essa tecnologia ainda em desenvolvimento na fase de corte para ver os seus efeitos durante o período da cultura da fatia. O protocolo de cultura fatia poderia também permitir a visualização de ambos neurônio motor espinhal, assim como a migração interneurônio dorsal em tempo real através de lapso de tempo microscopia de vídeo. Isto poderia ser alcançado utilizando microscopia de contraste de fase, sob luz branca ou através da utilização de imagiologia por fluorescência. Se a última técnica foi para ser usado, em seguida, a introdução de marcadores fluorescentes é necessário. Isto poderia ser conseguido quer por introdução de corantes fluorescentes, tais como DiI DiO ou através de qualquer marcação retrógrada do membro ou a rotulagem anterógrada do ventrículo ou electroporação in ovo de construções para dirigir proteínas fluorescentes em um subconjunto de neurónios.

Durante o desenvolvimento embrionário normal, muitos tipos de células diferentes que são gerados devem migrar do seu ponto de origem até onde eles eventualmente funcionar no organismo maduro. No interior da medula espinal em desenvolvimento, as células progenitoras estão localizados na zona ventricular na linha média e gerar muitos subtipos de neurónios pós-mitóticos e células gliais, que deve migrar para integrar em circuitos neuronais funcionais necessários para o processamento sensorial e saídas do motor 1. Os neurónios motores espinais que controlam a contração dos músculos do membro ter sido extensivamente estudada e é conhecida tanto das moléculas e de mecanismos que conduzem à formação de suas subclasses diferentes. No entanto, muito pouco se sabe dos mecanismos pelos quais os neurônios motores migrar, segregar e receber entradas sinápticas. Motor identidade subtipo neurônio é adquirida durante o desenvolvimento de uma forma hierárquica. Subtipos do neurônio motor pode ser amplamente classificada into colunas distintas, divisões e piscinas que são definidas por suas projeções de axônio. Colunas de motor axônios projeto para axiais, músculos viscerais ou membro. Divisões Motor subdividir o membro projetando neurônios motores da coluna do motor lateral (LMC) em aqueles projetando para os músculos ventral ou dorsal 2. Dentro das divisões, grupos de neurônios motores denominado projeto piscinas do motor para os músculos individuais no membro 2, 3. Neurónios projectam-Limb motor é definido pela sua expressão do factor de transcrição FOXP1 4, 5, enquanto que a identidade de divisão é caracterizada pela expressão dos factores de transcrição homeodomain Islet-1 (ventralmente projectando) ou LHX-1 (dorsal projectando) 6. Com efeito, LHX-1 é necessária para a expressão das projecções apropriadas dorsais dos neurónios motor 7. Cada um desses subtipos ocupam posições distintas dentro da medula espinhal; ventral neurônios motores projetando venham a residir medial dorsal projectineurônios ng motor. Isto resulta na LMC sendo segregados em LMCmedial dita (LMCm) e (LMCl) LMClateral divisões. Organização piscina divisional e motor é adquirido em duas fases 8. Na primeira fase, a segregação da divisão é obtida por meio de uma migração de neurónios motores de uma forma característica medial para lateral. As células LMCl são gerados após as células e assim LMCm LMCl migra através da LMCm para atingir a sua posição de sedimentação final. A segunda fase leva neurónios motores dentro de uma divisão e de aglomerados os em pools de neurónios motores, presumivelmente através de uma triagem dorsal-ventral dos neurónios motores. Os membros da família da caderina-catenina dependente clássica foram mostrados como sendo crucial para ambas as fases de 8-10 organização dos neurónios motores. No entanto, como a função caderina controla o movimento da célula é mal compreendida. A aquisição de identidades colunar, de divisões e piscina requer sinais extrínsecos que o padrão intrinc expressão dos fatores de transcrição 11. Além disso, cerca de 50% de todos os neurônios motores morrem por apoptose durante o desenvolvimento normal de um processo que requer sinais extrínsecos do membro, principalmente através do apoio do motor neurotrófico sobrevivência dos neurônios. Assim, o desenvolvimento motor neuron requer um ambiente adequado para ser mantida ao longo de um timecourse relativamente longo. Por esta razão, os aspectos práticos da obtenção de culturas de fatias de medula espinal de manter a sobrevivência de neurónios motores exigem a elucidação de condições de cultura adequadas. Cultura de lâminas anteriores de embriões foram usadas para seguir o comportamento das extrinsecamente adicionado purificado populações neuronais 12-14. No entanto, as nossas condições de cultura de conhecimento que facilitam a sobrevivência neuronal in situ do motor e migração dentro do segmento em si não foram publicados. Nós modificada uma condição de cultura padrão que facilita a sobrevivência de purificado, dissociadas neurónios motores cranianos para facilitar motor desenvolvimento neurônio dentro de um sistema de cultura de embriões fatia. Nós também monitorizados o posicionamento dos neurónios motores sobreviventes e demonstram que as posições em grande parte normal do neurónio motor divisões é adquirida durante o período de cultura.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ovos </td><td> Henry Stewart Farms, Reino Unido </td><td></td><td> Os ovos fertilizados de galinha Brown Bovan Gold Farms (Henry Stewart, Reino Unido), armazenados a 14 ° C até a incubação </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 21 </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de 5 ml </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> º 5 Dumont fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tesoura Dissecando </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 em linha reta) </td></tr><tr><td> Embrião moldes de incorporação: descascar moldes </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> Piramidal de 22 mm a 12 mm em forma </td></tr><tr><td> Super cola </td><td></td><td></td><td> Poder Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio di-hidrogénio, mono-hidrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Sódio Di-hidrogénio mono </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sódio </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plásticos descartáveis ​​pipetas pasteur </td><td> Elkay Precision laboratório consumíveis </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml de volume </td></tr><tr><td> Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrogenocarbonato de sódio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Extrato de embrião de galinha </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina Estreptomicina / solução </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina solução </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Sul do Grupo Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Meio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> Fator CilliaryNeurotrophic (CNTF) </td><td> R e D Systems </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Pintainho Soro </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Os anticorpos primários </td><td></td><td></td><td> foram adquiridas de Desenvolvimento Estudos Hibridoma Banco, com exceção do anti-FOXP1 anticorpos, que foram um presente tipo de Bennett Novitch da UCLA. Diluições primárias de anticorpos anti-coelho foram FOXP1 (1/32000), de ratinho anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), anti-cobaia FOXP1 (1/1000). Todos os anticorpos foram armazenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpos secundários </td><td></td><td></td><td> Donkey anti-cobaia (Cy3) (1:1000) comprado de Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-coelho (Alexa Fluor 594) (1:1000) comprado de Invitrogen Todos os anticorpos foram armazenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Corning COSTAR </td><td> 3473 </td><td> fixação ultralow placa de 24 poços </td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura de corte óptima </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescente meio de montagem </td></tr><tr><td> Slides </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> SuperFrost-Plus lâminas carregadas positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 milímetros </td></tr><tr><td> Forçado projecto incubadora: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> mantido úmido, garantindo sempre os níveis de água suficientes, mantida a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, no Reino Unido </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubator </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> NuAire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscópio de fluorescência </td></tr><tr><td> Câmera Digital </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M e Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

embrião de galinha spinal cord protocolo cultura slice

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Cultura de lâminas podem facilitar a manipulação do desenvolvimento embrionário, tanto farmacologicamente e através de manipulações genéticas. Neste sistema reduzido, os potenciais efeitos colaterais fatais devidos a aplicações farmacêuticas sistémicas podem ser superados. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento prossegue normais dentro do ambiente reduzido da fatia. Temos focado no desenvolvimento da espinal medula, em particular a de neurónios motores espinais. Nós sistematicamente variadas condições de cultivo de fatias de embrião de galinha a partir do ponto em que os neurônios motores mais coluna havia nascido. Analisamos o número e tipo de neurónios motores que sobreviveram durante o período de cultura e a posição destas neurónios motores em comparação com a in vivo. Descobrimos que tipo de soro e os factores neurotróficos foram necessárias durante o período de cultura e foram capazes de manter os neurónios motores vivo durante pelo menos 24 horas e permitir que os neurónios motores a migrar para as posições apropriadas nomedula espinal. Apresentamos estas condições de cultura e a metodologia de preparação das culturas de embriões de fatia utilizando embriões de galinha evisceradas incorporados em agarose e cortado utilizando um vibratome.

A utilização de culturas de fatias para seguir o desenvolvimento de neurónios de projecção e interneurônio foi influente em progredir a nossa compreensão da geração de organização no interior do córtex 16. Na espinal medula, neurónios motores do desenvolvimento foi seguido utilizando as culturas de embriões de peixes-zebra integrais 17. No entanto, espinal motor neuron organização no peixe-zebra é relativamente simples (devido à falta de músculos dos membros grandes em peixes). Os mecanismos moleculares que conduzem uma hierarquia de espinal organização neurónio motor durante o desenvolvimento dos vertebrados superiores são actualmente mal compreendidos. As condições de cultura que facilitam a sobrevivência neuronal e da migração das células do corpo, em culturas de embriões de fatia de vertebrados superiores estão assim requerido. Actualmente, as culturas de medula espinal de fatia de vertebrados superiores têm sido usadas para os neurónios dissociados de sementes em cima das fatias 12-14, investigar os axônios marcadas com fluorescência na periferia da fatia18, ou de comportamento de células progenitoras no desenvolvimento precoce do cordão espinal 19. Fatie condições de cultivo para cordas depois da coluna vertebral, especialmente aqueles que mantêm neurônio motor de desenvolvimento não existem actualmente. Para tentar acompanhar o desenvolvimento neuronal espinhal, particularmente a de neurônios motores espinhais, investigou várias condições de cultura que pode promover a sobrevivência do neurônio motor de e aquisição de ordem inicial na organização motora por meio da migração lateral dos neurônios. Testes iniciais utilizando fase 18 para o estágio 20 de embriões de pintos fatias de medula espinhal foram infrutíferas; que não foram capazes de manter os neurônios motores vivo por mais tempo do que algumas horas e foram incapazes de demonstrar a geração de um número significativo de células LMCl durante o período de cultura (dados não mostrados). Nós, portanto, investigado culturas fatia de estágio 24 embriões, um ponto no tempo, quando a maioria dos LMCl e neurônios LMCm foram gerados, mas quando LMCl neurônio migração ainda está em sua infancy (Figura 1a-c). Esta migração lateral de neurônios LMCl está amplamente completo por etapa 27, por volta de 24-36 horas mais tarde (Figura 1 df). O nosso ensaio pode assim ser simplificada para ser capaz de manter os neurónios vivos e para facilitar a sua migração lateralmente no corno ventral. Iniciamos nossas experiências com condições de cultura relativamente simples, contendo apenas Hank solução salina balanceada com ou sem soro frango ou extrato de embrião de galinha. Em todos os casos, mas foram capazes de manter os neurônios LMC na fatia, encontramos pouca evidência de neurônios LMCl sendo mantida (pelo menos por expressão de LHX-1). Além disso, observou-se expressão inapropriada de genes, tais como HB9 na medula espinal dorsal, uma situação que não ocorre in vivo (dados não mostrados). Assim, estas condições de cultura simples não são adequados para a investigação da aquisição da organização motora neurónio. Nós, portanto, procurou conditio mais complexons e como base utilizada uma formulação que foi publicado para facilitar a sobrevivência da dissociadas embrionárias frango neurônios motores cranianos. Esta condição 20 (extracto de embrião de pinto de 1%, 1% Pen Strep, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoetanol, 2% de soro de cavalo, 2% de suplemento B27 e 50 ng / ml de factor de crescimento ciliaryneurotrophic (CNTF) em meio neurobasal (aqui chamado Guthrie médio) manteve mais neurônios motores vivos do que os meios de comunicação mais simples. Além disso, não resultou na expressão de fatores de transcrição espúria na medula espinhal dorsal. entanto, a sobrevivência de neurônios LMCl era pobre (Figura 1 gi, p). Portanto, o que variaram considerados factores essenciais para o meio Guthrie, a saber, o animal de origem do soro, a concentração do soro e a concentração de CNTF no meio. Nós descobrimos que a mudança do soro a partir de soro de cavalo para pintainho soro e um aumento na concentração de CNTF a partir de 50 ng / ml a 100 ng / ml aumentou substancialmente tele sobrevivência das células e LMCl LMCm e permitiu também a sua migração no corno ventral em relação ao hr 24 das condições de cultura (Figura 1 jl, p). O número total de neurónios motores, a razão entre a LMCm LMCl e, de facto, a migração das células LMCl no corno ventral pareceu muito semelhante às secções de embriões que foram autorizados a desenvolver in ovo, em vez de na cultura fatia (Figura 1 ko, p). Assim, acreditamos que com base no número de células de expressão factor de transcrição, e na posição de neurónios motores, as nossas condições de cultura normais fatia recapitular o desenvolvimento motor espinal neurónio pelo menos ao longo de um período de 24 horas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Situação da geração de LMC (FOXP1 coloração emb) e LMCl (LHX-1 coloração em a) na fase 24. c é uma fusão dos dois canais. A linha média é mostrada como uma linha tracejada e em D, V mostra a orientação do eixo (D, V) dorsoventral da medula espinhal d -. F. . Status de LMC (FOXP1 coloração em d) e LMCl (LHX-1 em coloração e) organização na fase 27 f é uma fusão dos dois canais g -. I. Lhx-1 (g) e FOXP1 (h) a expressão em secções de uma fatia cultivadas num meio que suporta cranial do motor sobrevivência celular neuronal (Guthrie meio, o nosso &quot;meio inicial&quot; ver referência 20). Lhx-1 já não é expresso em neurónios motores, embora haja alguma sobrevivência de células de LMC evidenciadas por FOXP1 expressão. D, V em (g) mostra a orientação do eixo (D, V) dorsoventral da medula espinhal. ML mostra a orientação dos eixos (M, L) mediolateral do sj cabo de Pinal - l. Células LMCl (LHX-1 no corno ventral em j) e a LMC em geral (em FOXP1 k) pode ser observada em fatias cultivadas em meio contendo 4% de soro de pinto e de 100 ng / ml de CNTF. Note-se que algumas células LMCl são encontrados numa posição lateral no corno ventral. A seta em (j) mostra a posição lateral de uma parte das células dos LMCl. (L) é uma fusão dos dois canais m -. O. Estado de expressão de LHX-1 (m) e FOXP1 (n) em secções de um embrião mantida in ovo durante a cultura do embrião fatia mostrado na j - l. (O) é uma fusão dos dois canais. P. A determinação quantitativa da percentagem de LMCl (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) contra células de LMC (FOXP1 + ve /-ve Lhx1) células encontradas na cultura de lâminas de diferentes condições compared para controlar embriões mantidos in ovo (que representam 100%). *** Teste t de Student-representa p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Cultura de lâminas de facilitar a manipulação do gene de desenvolvimento do embrião e perturbações farmacológicas. No entanto, as condições de cultura devem assegurar que o desenvolvimento normal pode prosseguir dentro do ambiente reduzido da fatia. Ilustramos um protocolo que facilita o desenvolvimento normal, medula espinhal prosseguir durante pelo menos 24 horas.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar fatias de embrião de galinha para manter o desenvolvimento neuronal normal, particularmente dos neurônios motores espinais. Isso é realizado primeiramente dissecando o embrião de galinha para remover os órgãos viscerais. O segundo passo é preparar e fatiar o embrião embutido em um bloco de agarose.Em seguida, a fatia do embrião é cuidadosamente removida do agarro. O passo final consiste em transferir a fatia do embrião para um meio de cultura, que é incubado por 24 horas a 37 graus Celsius. Por fim, a microscopia de imunofluorescência em cortes finos da fatia do embrião é utilizada para demonstrar a presença e localização de neurônios motores espinais após o período de cultura.Portanto, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurobiologia do desenvolvimento. Por exemplo, os mecanismos e moléculas envolvidos na migração de neurônios motores espinais. Em geral, pessoas novas neste método terão dificuldades porque é necessário muito cuidado durante as etapas de dissecação do protocolo.Coloque 10 ovos fertilizados com o lado mais longo na posição horizontal em uma incubadora com circulação forçada de ar a 38 graus Celsius até que desenvolvam até o estágio de hambúrguer e Hamilton 24. Isso geralmente requer aproximadamente quatro dias de incubação. No segundo dia de incubação, esterilize a casca do ovo limpando-a com um papel-toalha embebido em Etanol 70%, perfure cuidadosamente a extremidade plana da casca do ovo usando uma agulha de calibre 21 acoplada a uma seringa de cinco mililitros e remova cinco mililitros de albúmina.Isso afasta o embrião da casca, de modo que o embrião não seja danificado quando a casca for aberta. Devolva os ovos ao incubador e incube-os por mais dois dias. Após transcorridos os dois dias, use uma ponta romba.Faça mais. Número cinco, utilize uma pin&ccedil;a para perfurar cuidadosamente o centro superior da casca e remover um quadrado de cerca de nove cent&iacute;metros de casca. Corte ao redor do embri&atilde;o e retire-o com cuidado, colocando-o em HBSS.Para dissecção. Todos os embriões utilizados devem estar próximos do estágio 24. Quaisquer embriões que apresentem sinais de anormalidade devem ser descartados.Coloque a placa contendo o embrião sob um microscópio de dissecação. Use duas pinças número cinco para remover a membrana amniótica. A membrana coriônica, o alantoide e a cabeça; em seguida, eviscere o embrião para remover todos os órgãos internos, utilizando tesouras de dissecação microcirúrgicas para cortar a linha média ventral do embrião.Em seguida, segure o embrião ao redor da região do tronco rostral com um par de pinças. Agarre a parte rostral do intestino e do coração e puxe. Trimestral. Você deverá ser capaz de visualizar claramente os somitos do embrião.Agora, corte a parede corporal torácica usando tesoura de microdissecação. Em seguida, corte o embrião ao meio transversalmente entre as bolsas das extremidades superior e inferior. Remova suavemente a metade lombar do embrião dissecado usando duas pinças para segurar o embrião fora da solução de dissecação e coloque-o em uma placa de Petri seca usando uma pipeta descartável de pasta com cerca de cinco centímetros.Corte pela parte inferior, aspire aproximadamente dois mililitros da solução fundida de 4% peso por volume. Em PBS, pipete aproximadamente 0,5 mililitro de aros sobre o embrião e, em seguida, aspire o fragmento do embrião para dentro da pipeta. Transfira o embrião e o aros para uma forma plástica descartável sem introduzir bolhas no aros.Abixe suavemente o embrião até o fundo dos aros no molde plástico com a seção torácica voltada para baixo e use uma agulha de 25 gauge para garantir que o embrião esteja reto. Os aros também conterão parte do membro em desenvolvimento, e é importante que os embriões sejam posicionados verticalmente nos aros para permitir isso; coloque o molde plást combustível por cerca de dois minutos. Para fixar os aros, tenha cuidado para que o embrião não mude de orientação durante esse período.Monte um aparato semelhante ao VT 1000 S de forma que a câmara seja preenchida com HBSS e cercada por gelo. Água fria. Use cola de contato para fixar o bloco de ágar ao plataforma Vibram e, em seguida, corte o bloco com uma lâmina de barbear para deixar o fragmento do embrião com um a três milímetros de ágar ao seu redor.Inicie o vibratomo e comece a fatiar o embrião. As fatias que incluem seções do botão de membro com uma crista ectodérmica apical bem definida são selecionadas e então transferidas para uma placa com HBSS. Geralmente, há apenas uma a duas fatias adequadas por embrião.Remova cuidadosamente a agarose ao redor das fatias de tecido usando duas agulhas. É essencial que isso seja feito de forma completa e cuidadosa. Adicione 500 microlitros de solução de cultura ao número necessário de poços de uma placa de cultura de tecidos com aderência ultrabaixa de 24 poços.Transfira cuidadosamente as fatias da solução HBSS para o poço, colocando duas ou três fatias em cada poço; em seguida, coloque a placa de 24 poços na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após o período de cultura, adicione 500 microlitros de fixador não tamponado a cada poço de fatias de embrião e deixe no gelo por 20 minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente toda a solução e lave três vezes com PBS em intervalos de cinco minutos. Depois, adicione 30% de sacarose em PBS aos poços e coloque a placa a quatro graus Celsius por cerca de seis horas ou mais, até que as fatias afundem.Após as fatias terem afundado, transfira-as para uma placa de Petri limpa de 10 centímetros e remova o excesso de solução de sacarose. Em seguida, adicione um mililitro de OCT e deixe as fatias equilibrarem por cinco minutos a 20 graus Celsius. Monte cada fatia plana em um molde plástico descartável preenchido com OCT após o montagem.Coloque as moldes verticalmente sobre gelo seco para solidificar, monte os blocos de OCT no criostato e equilibre os blocos a menos 24 graus Celsius por cerca de 20 minutos. Em seguida, corte cada fatia em seções de 15 mícrons e monte em lâminas super frosts plus. As lâminas podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias para coloração por imunofluorescência conforme descrito na parte textual do protocolo; esta imagem mostra o estágio de formação da coluna motora lateral no estágio 24 de Hamburger e Hamilton.A divisão lateral da coluna motora lateral é visualizada pela coloração com LH X um no painel esquerdo. A coluna motora lateral é visualizada pela coloração com Fox P um no painel central e o painel direito é uma fusão dos dois canais. A linha média é mostrada como uma linha tracejada e DV denota o eixo dorsal-ventral aqui.O status da divisão lateral da coluna motora lateral é novamente mostrado pela coloração com LH X um no painel esquerdo e pela coluna motora lateral pela coloração com Fox P um no painel central, com a imagem sobreposta à direita. Essas imagens mostram o desenvolvimento na fase 27. As imagens mostram a expressão de LH X um à esquerda e a expressão de Fox P um no painel central em seções de um corte cultivado em um meio que suporta a sobrevivência de neurônios motores cranianos dissociados.LH X um não é mais expresso em neurônios motores, embora haja alguma sobrevivência de células do CML evidenciada pela expressão de Fox P um. DV representa a orientação do eixo dorsoventral da medula espinhal, e ML representa a orientação do eixo médio-lateral da coluna motora lateral da medula espinhal. Células da divisão lateral, novamente coradas para LH X um no corno ventral no painel esquerdo e o CML em geral corado para Fox P um no painel central, podem ser observadas em fatias cultivadas em meio contendo 4% de soro de pintinho e 100 nanogramas por mililitro de CNTF.Observe que algumas células da divisão lateral da coluna motora lateral são encontradas em posição lateral no corno ventral, conforme indicado pela seta no painel esquerdo. Esta imagem mostra o estado da expressão de LHX1 e FoxP1 em seções de um embrião mantido em OVO durante a cultura de fatias do embrião previamente mostrado. Este histograma mostra os resultados da quantificação da porcentagem de células da divisão lateral da coluna motora lateral que são positivas para FoxP1 e LHX1 em relação às células da coluna motora lateral que são positivas para FoxP1 e LHX1.Dados negativos são mostrados para células encontradas em culturas de fatias em diferentes condições em comparação com embriões controle mantidos in ovo, que representam 100%. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student. Os três asteriscos representam um nível de significância inferior a 0,01. Ao tentar este protocolo, é importante ter cuidado ao dissecar o embrião e ao remover os agros das fatias, porque é essencial manter a integridade dos axônios motores no botão do membro.

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Research

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Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

O vídeo demonstra a regeneração funcional das conexões proprioespinhais usando um ensaio baseado em matriz de múltiplos eletrodos (MEA). As fatias da medula espinhal são colocadas no MEA e podem se fundir. As fatias fundidas são separadas mecanicamente criando uma lesão, induzindo os neurônios proprioespinhais a crescer sobre a lesão e conectar as fatias. A atividade elétrica das fatias é avaliada para identificar a regeneração das conexões funcionais.

Estudando a regeneração de conexões funcionais entre fatias da medula espinhal usando um arranjo de múltiplos eletrodos

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de fatias de tronco cerebral auditiva não coronal do embrião de frango para a investigação de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento dentro de uma fatia de tronco cerebral. Essas fatias incluem seções sagita, horizontal e horizontal/transversal que abrangem regiões tonotópicas maiores dentro de um plano de fatia individual que as seções coronais tradicionais.

Fatiando o tronco auditivo de frango embrionário para avaliar gradientes tonotópicos e microcircuitos

Aprenda a cultivar fatias de embrião de galinha para manter o desenvolvimento normal de neurônios motores espinhais por 24 horas. Este método utiliza microscopia de imunofluorescência para visualizar estruturas neuronais em neurobiologia do desenvolvimento.

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

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