Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

O objetivo geral deste procedimento é cultivar fatias de embrião de galinha para manter o desenvolvimento neuronal normal, particularmente dos neurônios motores espinais. Isso é realizado primeiramente dissecando o embrião de galinha para remover os órgãos viscerais. O segundo passo é preparar e fatiar o embrião embutido em um bloco de agarose.

Em seguida, a fatia do embrião é cuidadosamente removida do agarro. O passo final consiste em transferir a fatia do embrião para um meio de cultura, que é incubado por 24 horas a 37 graus Celsius. Por fim, a microscopia de imunofluorescência em cortes finos da fatia do embrião é utilizada para demonstrar a presença e localização de neurônios motores espinais após o período de cultura.

Portanto, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurobiologia do desenvolvimento. Por exemplo, os mecanismos e moléculas envolvidos na migração de neurônios motores espinais. Em geral, pessoas novas neste método terão dificuldades porque é necessário muito cuidado durante as etapas de dissecação do protocolo.

Coloque 10 ovos fertilizados com o lado mais longo na posição horizontal em uma incubadora com circulação forçada de ar a 38 graus Celsius até que desenvolvam até o estágio de hambúrguer e Hamilton 24. Isso geralmente requer aproximadamente quatro dias de incubação. No segundo dia de incubação, esterilize a casca do ovo limpando-a com um papel-toalha embebido em Etanol 70%, perfure cuidadosamente a extremidade plana da casca do ovo usando uma agulha de calibre 21 acoplada a uma seringa de cinco mililitros e remova cinco mililitros de albúmina.

Isso afasta o embrião da casca, de modo que o embrião não seja danificado quando a casca for aberta. Devolva os ovos ao incubador e incube-os por mais dois dias. Após transcorridos os dois dias, use uma ponta romba.

Faça mais. Número cinco, utilize uma pinça para perfurar cuidadosamente o centro superior da casca e remover um quadrado de cerca de nove centímetros de casca. Corte ao redor do embrião e retire-o com cuidado, colocando-o em HBSS.

Para dissecção. Todos os embriões utilizados devem estar próximos do estágio 24. Quaisquer embriões que apresentem sinais de anormalidade devem ser descartados.

Coloque a placa contendo o embrião sob um microscópio de dissecação. Use duas pinças número cinco para remover a membrana amniótica. A membrana coriônica, o alantoide e a cabeça; em seguida, eviscere o embrião para remover todos os órgãos internos, utilizando tesouras de dissecação microcirúrgicas para cortar a linha média ventral do embrião.

Em seguida, segure o embrião ao redor da região do tronco rostral com um par de pinças. Agarre a parte rostral do intestino e do coração e puxe. Trimestral. Você deverá ser capaz de visualizar claramente os somitos do embrião.

Agora, corte a parede corporal torácica usando tesoura de microdissecação. Em seguida, corte o embrião ao meio transversalmente entre as bolsas das extremidades superior e inferior. Remova suavemente a metade lombar do embrião dissecado usando duas pinças para segurar o embrião fora da solução de dissecação e coloque-o em uma placa de Petri seca usando uma pipeta descartável de pasta com cerca de cinco centímetros.

Corte pela parte inferior, aspire aproximadamente dois mililitros da solução fundida de 4% peso por volume. Em PBS, pipete aproximadamente 0,5 mililitro de aros sobre o embrião e, em seguida, aspire o fragmento do embrião para dentro da pipeta. Transfira o embrião e o aros para uma forma plástica descartável sem introduzir bolhas no aros.

Abixe suavemente o embrião até o fundo dos aros no molde plástico com a seção torácica voltada para baixo e use uma agulha de 25 gauge para garantir que o embrião esteja reto. Os aros também conterão parte do membro em desenvolvimento, e é importante que os embriões sejam posicionados verticalmente nos aros para permitir isso; coloque o molde plást combustível por cerca de dois minutos. Para fixar os aros, tenha cuidado para que o embrião não mude de orientação durante esse período.

Monte um aparato semelhante ao VT 1000 S de forma que a câmara seja preenchida com HBSS e cercada por gelo. Água fria. Use cola de contato para fixar o bloco de ágar ao plataforma Vibram e, em seguida, corte o bloco com uma lâmina de barbear para deixar o fragmento do embrião com um a três milímetros de ágar ao seu redor.

Inicie o vibratomo e comece a fatiar o embrião. As fatias que incluem seções do botão de membro com uma crista ectodérmica apical bem definida são selecionadas e então transferidas para uma placa com HBSS. Geralmente, há apenas uma a duas fatias adequadas por embrião.

Remova cuidadosamente a agarose ao redor das fatias de tecido usando duas agulhas. É essencial que isso seja feito de forma completa e cuidadosa. Adicione 500 microlitros de solução de cultura ao número necessário de poços de uma placa de cultura de tecidos com aderência ultrabaixa de 24 poços.

Transfira cuidadosamente as fatias da solução HBSS para o poço, colocando duas ou três fatias em cada poço; em seguida, coloque a placa de 24 poços na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após o período de cultura, adicione 500 microlitros de fixador não tamponado a cada poço de fatias de embrião e deixe no gelo por 20 minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente toda a solução e lave três vezes com PBS em intervalos de cinco minutos. Depois, adicione 30% de sacarose em PBS aos poços e coloque a placa a quatro graus Celsius por cerca de seis horas ou mais, até que as fatias afundem.

Após as fatias terem afundado, transfira-as para uma placa de Petri limpa de 10 centímetros e remova o excesso de solução de sacarose. Em seguida, adicione um mililitro de OCT e deixe as fatias equilibrarem por cinco minutos a 20 graus Celsius. Monte cada fatia plana em um molde plástico descartável preenchido com OCT após o montagem.

Coloque as moldes verticalmente sobre gelo seco para solidificar, monte os blocos de OCT no criostato e equilibre os blocos a menos 24 graus Celsius por cerca de 20 minutos. Em seguida, corte cada fatia em seções de 15 mícrons e monte em lâminas super frosts plus. As lâminas podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até que sejam necessárias para coloração por imunofluorescência conforme descrito na parte textual do protocolo; esta imagem mostra o estágio de formação da coluna motora lateral no estágio 24 de Hamburger e Hamilton.

A divisão lateral da coluna motora lateral é visualizada pela coloração com LH X um no painel esquerdo. A coluna motora lateral é visualizada pela coloração com Fox P um no painel central e o painel direito é uma fusão dos dois canais. A linha média é mostrada como uma linha tracejada e DV denota o eixo dorsal-ventral aqui.

O status da divisão lateral da coluna motora lateral é novamente mostrado pela coloração com LH X um no painel esquerdo e pela coluna motora lateral pela coloração com Fox P um no painel central, com a imagem sobreposta à direita. Essas imagens mostram o desenvolvimento na fase 27. As imagens mostram a expressão de LH X um à esquerda e a expressão de Fox P um no painel central em seções de um corte cultivado em um meio que suporta a sobrevivência de neurônios motores cranianos dissociados.

LH X um não é mais expresso em neurônios motores, embora haja alguma sobrevivência de células do CML evidenciada pela expressão de Fox P um. DV representa a orientação do eixo dorsoventral da medula espinhal, e ML representa a orientação do eixo médio-lateral da coluna motora lateral da medula espinhal. Células da divisão lateral, novamente coradas para LH X um no corno ventral no painel esquerdo e o CML em geral corado para Fox P um no painel central, podem ser observadas em fatias cultivadas em meio contendo 4% de soro de pintinho e 100 nanogramas por mililitro de CNTF.

Observe que algumas células da divisão lateral da coluna motora lateral são encontradas em posição lateral no corno ventral, conforme indicado pela seta no painel esquerdo. Esta imagem mostra o estado da expressão de LHX1 e FoxP1 em seções de um embrião mantido em OVO durante a cultura de fatias do embrião previamente mostrado. Este histograma mostra os resultados da quantificação da porcentagem de células da divisão lateral da coluna motora lateral que são positivas para FoxP1 e LHX1 em relação às células da coluna motora lateral que são positivas para FoxP1 e LHX1.

Dados negativos são mostrados para células encontradas em culturas de fatias em diferentes condições em comparação com embriões controle mantidos in ovo, que representam 100%. Os dados foram analisados utilizando o teste t de Student. Os três asteriscos representam um nível de significância inferior a 0,01. Ao tentar este protocolo, é importante ter cuidado ao dissecar o embrião e ao remover os agros das fatias, porque é essencial manter a integridade dos axônios motores no botão do membro.