Name: Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a técnica de rastreamento seletivo de fibras auditivas no nervo vestibulococlear de embriões de galinha usando microinjeção de corante fluorescente. Este método permite visualizar projeções do gânglio acústico com alta resolução.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Candace Hsieh para sugestões e assistência com técnicas de imagem e Doris Dr. Wu para a perícia no pinto anatomia do ouvido interno durante a embriogênese. Este trabalho foi financiado pela NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, e GAANN DOE P200A120165.

1. Preparar os instrumentos de dissecação seguinte e Reagentes <ul><li> Fluido cerebrospinal artificial (aCSF; 130 mM de NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de NaHCO3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4) infundida continuamente com 95% de O 2/5% CO 2, à temperatura ambiente. Para a perfusão, encher a 2/3 de 500 ml de boca larga frasco Nalgene com um buraco perfurado na tampa. Tanque vai ser ligado a um tubo de um borbulhador de vidro haste, que penetra o aCSF através do orifício na tampa do frasco. Regule a pressão para se obter um fluxo constante de bolhas que alcançam de cerca de 1/3 do líquido, mas não são suficientemente forte para provocar salpicos sobre o aro. Submerge 5 ml frascos de vidro (até 6) para dentro do frasco de Nalgene para separar amostras individuais uns dos outros e da turbulência do fluxo de gás. ACSF oxigenado deve ser, pelo menos, 20 min antes de qualquer incubação de tecidos. </li><li> Prato de dissecação pequeno silicone (35 mm x 10milímetro revestido Petri usando Sylgard elastômeros Kit) com dois pinos de dissecação colocados em poliestireno hexagonal pequena (47 fundo mm) pesam barco. </li><li> Dois ponta fina fórceps, um tip-fórceps curvo, numa proveta de 50 ml, e um recipiente para resíduos de tecidos. </li><li> Puxado micropipeta de vidro (1,2 OD / 0,9 ID) quebrado de aproximadamente 20-50 uM de abertura na ponta e preenchido com rodamina dextran amina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) em uma solução de 6,25% com 0,4% de Triton X-100 em PBS . Anexar por tubos bem para picospritzer e estabilizar a micromanipulador. </li></ul> 2. Micro dissecção para revelar papila basilar no E8 4,5 <ol><li> Com pinças curvas, corte E8 embrião logo abaixo do tronco, colocando a cabeça diretamente sobre silicone revestido prato dissecção dentro pesar barco. </li><li> A utilização de pinos de dissecação, posicionar a cabeça com uma vista ventral de modo que o ouvido do lado de juros é um pouco visível, o cabeça ligeiramente inclinada dorsalmente e apontando 10-30 graus de distância da center (Figura 2A). Imediatamente proteger a cabeça com pinos. Se bilateral traçado é desejada, a cabeça do centro em 0 graus, ou uma visão completa ventral para que ambos os lados podem ser acessados. Da mesma forma, para uma injeção do lado esquerdo, fixar a cabeça de -10 a -30 graus do centro para o lado esquerdo é acessível. </li><li> Usando o copo de 50 ml, transferir 30 ml de aCSF oxigenado para o prato, totalmente submergindo o tecido. </li><li> Agarre cuidadosamente e descascar para baixo a mandíbula inferior utilizando uma pinça de ponta fina, em seguida, remover a pálpebra inferior do lado de interesse. </li><li> Remover o tecido vascular sobrejacente, incluindo qualquer paladar restante e garganta. Estes tecidos moles deverão descascar revelar a superfície lisa de desenvolver chondrocranium com as artérias vertebrais distintas na sua superfície. Até este ponto, a massa branca característica otoconial deve ser visível. </li><li> Dissecar cuidadosamente a pele ao redor do meato externo, cartilagem da articulação da mandíbula e do ouvido médio, deixando o emner ouvido intacto. Use a pinça para gentilmente cortar estas estruturas cartilaginosas. </li><li> Remover artérias vertebrais e acúmulo de sangue através de um movimento de varredura suave com as pontas finas fórceps. Sangue pode obscurecer vista e de coagulação pode ligar a abertura pipeta de injeção. </li><li> O ducto coclear com epitélio sensorial adjacente (papila basilar) e gânglio acústico encontra-se directamente por baixo do chondrocranium 6 e pode ser visualizada como uma projecção semelhante a dedo alongado que se prolonga a partir do ouvido interno ventralmente, com a ponta distal-mais (vértice) próximo do anterior linha média 5. Pode haver um pequeno agrupamento de sangue (vermelho) do dissecação e / ou calcificações otolíticos (branco) no vértice do ducto coclear (Figura 2B), que pode auxiliar na visualização. No ápice é a mácula lagenar, um adesivo sensitivo pensado para ser da função vestibular 7,8. </li></ol> 3. Rotulagem seletiva de CN VIII Auditivo Fibras <ol><li&gt; Coloque a pipeta de injeção perto da superfície do embrião na região da papila do ducto coclear e basilar. </li><li> Lentamente baixar a micropipeta a primeira punção do crânio. Esta região craniana é mais fino do que áreas adjacentes e requer menos força para penetrar. A micropipeta deve agora ser dentro do ducto coclear. Opcional: uma pequena injecção de rastreio corante pode ser feita aqui para ajudar a visualizar a papila basilar. </li><li> Sem reposicionar o micropipeta, continue baixando até ele apenas violações da fronteira profunda do ducto coclear (Figura 1). Realizar uma injecção e repetir em várias regiões ao longo do comprimento da papila basilar (Figuras 2C, 2D), excluindo a extremidade mais proximal onde a lagena vestibular está localizado. Com o picospritzer definido entre 10-30 psi, várias injeções são feitas. O volume do fluido injectado varia de corante, e depende do grau de rotulagem desejada. Cada injecção deverá resultar num corante fluorescente-laponto Beled de aproximadamente 200-400 um de diâmetro (Figura 2D). </li><li> Uma vez que a injecção está completa, utilize uma pinça para transecção da amostra acima do tronco cerebral e da utilização de uma pipeta de transferência para colocar a porção de caudal para um pequeno frasco dentro do recipiente de aCSF continuamente perfundidos com 95% O2 / 5% de CO 2. </li><li> Para cada embrião, 20-30 min para permitir a transferência de corantes, em função da distância do centro de rastreio desejado. </li><li> Remover o tecido e se preparar para cortes histológicos. No exemplo mostrado aqui, o tecido é imerso em paraformaldeído a 4% (em 1X PBS) durante a noite, de sacarose a 30% (em 1X PBS) durante a noite. </li></ol> 4. Contracoloração e Análise <ol><li> Contracoloração é útil para ajudar a orientar o observador a localização anatômica, bem como identificar as regiões de interesse particular. Um contracorante eficaz nesta preparação é de imunomarcação de neurofilamento (Figuras 1, 3B, 3E), o que fortemente l comabels axônios e permite a demarcação de vias axonais no SNC. </li><li> Análise deveria ser realizada por toda a região marcada, tal como as saliências podem estender várias centenas de microns ou mais ao longo do eixo rostro-caudal. Alguns exemplos de análises básicas são: taxas de erro de segmentação de tempo, e / ou alterar os padrões de divergência de projecção. RDA axónios marcados são visualizados no sistema nervoso periférico e central, com alta resolução (Figuras 3A, 3D). </li></ol>

<ol><li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li>
<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
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<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
<li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size%2C+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Estudos sobre o desenvolvimento precoce do nervo VIII têm sido limitada, em parte, devido à dificuldade em identificar os axônios embrionárias resultantes de gânglios distinto múltipla. Vários estudos exploraram os sinais moleculares orientadores auditivo e vestibular célula sensorial e destinos de células ganglionares durante o desenvolvimento precoce, 5,11,12 mas os processos que regulam a inervação central têm ainda a ser determinado. Relatórios de projeções das células ganglionares acústicas normalmente d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Poliestireno Pesar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Prato de Petri, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Use para fazer prato dissecção de silicone </td></tr><tr><td> Sylgard Kit elastômero de silicone </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> SYLG184 </td><td> Brasão Petri para fazer prato dissecção </td></tr><tr><td> Pinos de dissecação </td><td> Vário </td><td></td><td> Embrião mantém no local durante a dissecção </td></tr><tr><td> NaCL </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Vário </td><td></td><td> parte da receita aCSF </td></tr><tr><td> Recipiente para aCSF. Sugerem translúcido boca larga frasco de Nalgene, 500 ml (16 onças) com tampa. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Abertura do orifício na parte superior da tampa para haste de vidro bubling penetrar líquido </td></tr><tr><td> Vazio 5 ml frasco de vidro ou frasco transparente e comparável </td><td> Farmacêutica americana Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Utilização durante a incubação aCSF para manter as amostras separadas umas das outras e do fluxo de borbulhamento </td></tr><tr><td> Tanque de carbogénio (95% O2 / 5% CO 2) ligada a um tubo de borbulhador </td><td> Vário </td><td></td><td> Anexar por tubulação para borbulhador haste de vidro para perfusão aCSF </td></tr><tr><td> Vidro tronco borbulhador </td><td> Vário </td><td></td><td> Para infundir carbogênio em aCSF </td></tr><tr><td> Curvo-ponta fórceps </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 501008 </td><td> Para remover a cabeça do embrião do ovo </td></tr><tr><td> Dois bem-ponta fórceps </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 501985 </td><td> Para micro-dissecção </td></tr><tr><td> 50 ml Proveta </td><td> vário </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Dextran Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> vário </td><td> Fluorescente axônio traçador </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução salina tamponada com fosfato, (1X PBS) </td><td> Vário </td><td></td><td> Reagente de laboratório padrão </td></tr><tr><td> Fina parede capilares de vidro, 1,2 OD, 0,9 ID 4 &quot;(100 mm) de comprimento </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> TW120F-4 </td><td> Carregar com a RDA. Cada capilar faz duas micropipetas de vidro </td></tr><tr><td> Agulha / Pipetar extrator </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 720 </td><td> Configurações usadas: Calor 16,4, 2,2 Solenóide </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> vário </td><td> Anexar por tubos de vidro fino para micropipeta </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Narishige </td><td> vário </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção com fluorescência </td><td> Vário </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Paraformaldeído a 4% </td><td> Vário </td><td></td><td> Reagente de laboratório padrão </td></tr><tr><td> anticorpo anti-neurofilamento, opcional </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Siga o protocolo recomendado pelo fabricante histológica </td></tr><tr><td> Criostato e materiais associados para seccionamento </td><td> Leica </td><td> vário </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência para imagiologia </td><td> Zeiss, vários </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária vestibulococlear

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

O pintainho embrionário é um modelo largamente utilizado para o estudo das projecções periféricas e centrais de células ganglionares. No sistema auditivo, rotulagem seletiva de axônios auditivos dentro do nervo craniano VIII aumentaria o estudo do centro de desenvolvimento circuito auditivo. Esta abordagem é difícil porque múltiplos órgãos sensoriais do ouvido interno, contribuir para o nervo VIII 1. Além disso, os marcadores que distinguem de forma confiável auditivo versus grupos vestibulares de axónios no interior do nervo VIIIth aviária ainda têm de ser identificados. Vias auditivas e vestibulares não podem ser distinguidas funcionalmente em embriões precoces, como sensoriais evocadas respostas não estão presentes antes dos circuitos são formados. Centralmente projetando axônios VIII foram traçadas em alguns estudos, mas auditivo rotulagem axônio foi acompanhada de rotulagem de outros componentes do nervo VIII 2,3. Aqui, nós descrevemos um método para o rastreio anterógrada do gânglio acústico para selectivamente labeaxónios auditivas l dentro do nervo VIIIth desenvolvimento. Em primeiro lugar, após o esvaziamento parcial da região cefálica anterior de um embrião de pinto com 8 dias de imersão em fluido cerebrospinal artificial oxigenado, o ducto coclear é identificado por anatómicas. Em seguida, uma micropipeta de vidro fino puxado está posicionado para injectar uma pequena quantidade de rodamina dextran amina na região adesiva e profunda adjacente onde as células ganglionares acústicos estão localizados. Dentro de 30 minutos após a injeção, os axônios auditivas são rastreados centralmente na parte posterior do cérebro e posteriormente pode ser visualizado a seguir à preparação histológica. Este método proporciona uma ferramenta útil para estudos do desenvolvimento da formação periférica de circuito auditivo central.

Os componentes do nervo VIII e a anatomia do nervo em si são complexas e tortuosas (Figuras 1, 3). Seletivamente o rastreio fibras resultantes a partir de células do gânglio acústicos, os segmentos do nervo VIII, bem como aferentes auditivos primários dentro do tronco cerebral podem ser rastreados de forma limpa e distinguidos dos seus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Do mesmo modo, esta técnica pode ser utilizada para estudar as projecções periféricas das células ganglionares acú...

Aqui descrevemos uma técnica de microdissecção seguido de injeção de corante fluorescente no gânglio acústico de embriões de galinha cedo para rastreamento seletivo das fibras auditivas axônios no nervo e rombencéfalo.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

O objetivo deste procedimento é rastrear seletivamente as fibras auditivas do sistema nervoso periférico ao sistema nervoso central em um embrião. Isso é realizado primeiramente mediante uma secção em microdose para expor o crânio cartilaginoso ventral e identificar o ducto coclear aviano. O segundo passo consiste em realizar uma microinjeção nas células do gânglio acústico subjacente e em seus axônios.Em seguida, a amostra é incubada em LCR artificial oxigenado por 20 minutos para permitir a transferência do DIA. Finalmente, um preparo histológico e o corte do tecido permitem a visualização microscópica das projeções centrais do gânglio acústico. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são que ela possibilita o rastreamento seletivo do nervo oitavo.Fibras auditivas com alta resolução permitem uma rápida transferência de corante em tecido vivo e possibilitam experimentações em estágios precoces de desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa auditiva. Por exemplo, quais são as moléculas que orientam os axônios em direção aos seus alvos centrais?Ou como a circuitaria responde a lesão ou exposição ototóxica? Primeiro, adicione fluido cerebroespinhal artificial a um frasco Nalgene de boca larga de 500 mililitros até que o frasco esteja dois terços cheio. Substitua a tampa, que possui um orifício perfurado, sobre o frasco.Coloque um borbulhador acoplado a um tanque de 95%oxigênio e 5%dióxido de carbono através do orifício na tampa e dentro do LCR A. Ligue o gás e ajuste a pressão para obter um fluxo constante de bolhas que alcance cerca de um terço do líquido, mas que não seja forte o suficiente para causar respingos sobre a borda. Mergulhe até seis frascos de vidro de cinco mililitros no recipiente para separar as amostras individuais umas das outras.E da turbulência do fluxo de gás. Deixe o LCR-A se oxigenar por pelo menos 20 minutos enquanto o LCR-A oxigena; puxe micropipetas de vidro, reenchendo a micropipeta com uma solução de rodina a 6,25% em Dexter e uma solução imune em PBS contendo 0,4% de Triton XX. Fixe a micropipeta ao micromanipulador e quebre a ponta com pinça fina para formar uma abertura de 20 a 50 mícrons. Use tubos finos para conectar o micromanipulador estabilizado ao pico spritzer.Configure o pico spritzer entre 10 e 30 PSI para iniciar a conclusão do restante da montagem. Certifique-se de que há um pequeno recipiente de dissecação de silicone com dois alfinetes de dissecação colocados em uma pequena disposição hexagonal. Tenha duas pinças de ponta fina.Pinceta de ponta curva, um béquer de 50 mililitros e um recipiente para resíduos de tecido na área de dissecação. Após remover o embrião de galinha do ovo, coloque a cabeça sobre o recipiente de dissecação revestido com silicone. No barco de soro, posicione a cabeça com uma visão ventral, de modo que o ouvido do lado de interesse, neste caso, o lado direito, fique visível.Uma vez na posição correta, estabilize o tecido com alfinetes de dissecação, evitando a região do cérebro posterior. Utilize o béquer de 50 mililitros para transferir 30 mililitros do A CSF oxigenado para o recipiente, submergindo completamente o tecido. Em seguida, use pinças de ponta fina para segurar suavemente e puxar para baixo a mandíbula inferior.Em seguida, remova a pálpebra inferior no lado de interesse. A seguir, remova os tecidos vasculares e moles sobrejacentes, incluindo qualquer palato e garganta remanescentes. Após a remoção desses tecidos, a superfície lisa do crânio ventral e as artérias vertebrais distintivas devem ser expostas.Disseque cuidadosamente a pele ao redor do míto externo até a cartilagem da articulação da mandíbula e da orelha média, deixando intacta a orelha interna. Use a pinça para cortar suavemente as estruturas cartilaginosas da mandíbula e da orelha média. Agora, utilize um movimento suave de varredura com as pontas da pinça fina para remover as artérias vertebrais e o sangue acumulado.Isso é importante, pois o sangue pode obstruir a visão e a coagulação pode entupir a abertura da pipeta de injeção. Neste ponto, a massa branca característica do tial deve estar visível. A seta nesta figura indica o ducto coclear com o epitélio sensorial adjacente e o gânglio acústico.Localiza-se diretamente abaixo do crânio cartilaginoso e, como visto aqui, pode ser visualizado como uma projeção alongada, semelhante a um dedo, estendendo-se da orelha interna em direção ventral, com o ápice próximo à linha média anterior, para rotular as fibras auditivas. Primeiro, posicione a pipeta de injeção próximo à superfície do embrião do ducto coclear e na região da pápula baula, abaixe lentamente a micropipeta para perfurar inicialmente o crânio. Esta região do crânio é mais fina do que as áreas circundantes e requer menos força para ser penetrada.A micropipeta agora deve estar dentro do ducto coclear. Se necessário, uma pequena injeção de corante de rastreamento pode ser feita aqui para auxiliar na visualização da base do pilar, sem reposicionar a micropipeta; continue descendo até que ela apenas atravesse a borda profunda do ducto coclear.Esta imagem mostra a posição ideal da pipeta na região apropriada do gânglio acústico. Realize uma injeção neste ponto e repita em múltiplas regiões ao longo do comprimento da papila basal. Dependendo da extensão da marcação desejada e excluindo a ponta mais proximal, onde se localiza a lâmina vestibular.Com o pico spritzer ajustado entre 10 e 30 PSI, cada injeção deve resultar em um ponto marcado com DIA fluorescente de aproximadamente 200 a 400 mícrons de diâmetro, conforme mostrado aqui. Após a conclusão da injeção, use pinças para seccionar a amostra acima do bulbo raquidiano, conforme ilustrado aqui, e utilize uma pipeta de transferência para colocar a porção medular em um dos pequenos frascos dentro do recipiente contendo CSF perfundido.Para cada embrião, permita de 20 a 30 minutos para a transferência do molde, dependendo da distância do traçado central desejada. Após o tempo de incubação, remova o tecido e prepare-o para seccionamento histológico. Neste caso, o tecido é imerso em paraformaldeído a 4% em PBS 1X durante a noite, seguido por uma desidratação durante a noite em sacarose a 30% em PBS 1X.Após o tecido ser equilibrado durante a noite em sacarose a 30%, ele é seccionado coronalmente por criomicrotomia. Após o seccionamento, a marcação imunológica com anticorpos apropriados pode orientar o observador quanto à localização anatômica, bem como identificar regiões específicas de interesse. Esta imagem mostra a vista coronal do tronco encefálico de embrião E seis, com os gânglios acústicos bilaterais intactos.A pipeta vermelha esquematizada ilustra o direcionamento preciso das células do gânglio acústico a partir de um ponto de entrada dorsal lateral. As seções são imunomarcadas com anticorpo antineurofilamento para destacar as projeções axonais. Os órgãos vestibulares estão localizados na região rostral à seção mostrada.O nervo vestibulococlear está identificado, assim como o gânglio acústico e o gânglio vestibular. O lado dorsal está voltado para cima; a escala corresponde a 300 mícrons. A seguir, imagens representativas com aumento baixo e alto do rastreamento seletivo de fibras auditivas em um embrião E8 com corte de 25 mícrons.Seções coronais coletadas do mesmo embrião representam planos diferentes, conforme mostrado aqui. Os axônios marcados com RDA podem ser rastreados a partir do local de injeção, indicado pela cabeça da seta, através do nervo craniano indicado pela seta e posteriormente em direção aos alvos principais dos núcleos auditivos, indicados pela cabeça dupla da seta; a barra de escala equivale a 300 mícrons. A imunomarcação com anticorpo anti-neurofilamento destaca todas as projeções axonais, e as fibras rastreadas com RDA da imagem anterior estão localizadas dentro da via de projeção auditiva.AP e VP indicam respectivamente os componentes auditivo e vestibular periféricos ao ponto de entrada do nervo. A imagem em cores combinadas mostra como os axônios marcados com RDA se encaixam na anatomia local. Uma imagem de maior aumento do mesmo embrião em uma posição mais cordal demonstra a alta resolução das fibras no ponto de entrada do nervo, indicado por uma seta, e ao longo da via central, indicada por uma seta dupla.A coloração com anticorpo contra neurofilamentos de todos os axônios permite a delimitação do P-N-S-C-N-S, bem como das projeções auditivas versus vestibulares putativas. Novamente, AP e VP indicam os componentes auditivo e vestibular respectivos periféricos ao ponto de entrada do nervo, enquanto AC e VC indicam as projeções auditiva e vestibular respectivas centrais ao ponto de entrada do nervo. Mais uma vez, a sobreposição de canais separados é mostrada como uma fusão de cores.O exame histológico do gânglio acústico revela a localização das células do gânglio acústico marcadas a partir do rastreamento anterior e suas projeções periféricas indicadas pelo asterisco, com um rastreamento retrógrado até a papila basilar. Aqui, AG indica o gânglio acústico, bp a papila basilar e lm a mácula lagena. A barra de escala equivale a 100 micrômetros.Por fim, esta ilustração mostra um trajeto de rastreamento de 700 mícrons esperado com marcação específica do oitavo nervo auditivo no estágio E oito. O local da injeção indicado pelo círculo vermelho é cordal em relação ao ponto de entrada do nervo, e as projeções centrais seguem em direção rostral e quartal. Uma vez no cérebro posterior aqui, a barra de escala equivale a 300 mícrons.Ao realizar este procedimento, adapte suas injeções para melhor atender aos seus critérios de análise. E lembre-se de que haverá alguma variabilidade no número exato e na localização dos axônios marcados entre as amostras.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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