Name: Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a gerar culturas dispersas de mesoderme pré-somítico de Danio rerio para imagem de oscilações do relógio de segmentação em nível de célula única. Este método permite monitorar dinâmicas de expressão gênica cíclica em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado por uma EMBO companheirismo de longo prazo (ABW), a Science Foundation Internacional de Pós-Doutorado Bolsa de Investigação Nacional (ABW), a Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), uma bolsa CAVE-BB (AO), eo Conselho Europeu de Investigação de acordo com as Comunidades Europeias Sétimo Programa-Quadro STG-207634 (DS, ACO). Agradecemos Ravi Desai pelos comentários úteis sobre o manuscrito. Gostaríamos também de agradecer a facilidade de expressão de proteínas MPI-CBG para a produção do fragmento de peixe-zebra Fibronectin1, o MPI-CBG pessoal instalação de peixe para o cuidado e manutenção das nossas linhas de peixe e a facilidade de microscopia de luz MPI-CBG para suporte de imagem.

1. Antes Dissecção <ol><li> No dia antes da dissecação, obter embriões a partir de um dos pares de peixe-zebra incross heterozigóticas para o alelo transgénico. <ol><li> Levante embriões em meio E3 sem azul de metileno a 28 o C até o estágio de blindagem (6 horas pós-fertilização). </li><li> Transferência de embriões em meio E3 sem azul de metileno a 20 o CO / N. Aos 20 o C, os embriões formarão um somite por hora, uma vez que eles atinjam fase tailbud. Após 17-20 h de O / N a 20 ° C, os embriões devem ser em 5 a 8 somito fase na manhã seguinte ao início do protocolo de dissecção. </li></ol></li><li> Montar ferramentas e reagentes necessários para dissecção. <ol><li> Pipeta de vidro polido-Fire para a transferência de embriões e tecido </li><li> Par de uma pinça fina para remoção de córions de embriões </li><li> Sylgard-revestido de 35 mm de prato de dissecação - Pour Sylgard polímero num prato de 35 mm e curar S / N a 37 ° C. Faça a dissecção bem usandouma ponta de agulha para remover uma pequena quantidade de polímero curada. O prato pode ser limpa e subsequentemente reutilizado. </li><li> Afiadas, ferramentas de fio de tungstênio achatadas para manipulação de tecidos PSM </li><li> Micro-bisturi para cortar pedaços desejados de PSM para a cultura </li><li> 35 mm prato de plástico para tripsina incubação </li><li> Meio L15 contendo 10% de soro fetal bovino </li><li> Solução de tripsina / EDTA a 0,25% </li><li> Sigmacoted dicas gel de carregamento para a dispersão </li><li> Placas de Petri de plástico contendo meio E3 sem azul de metileno. </li></ol></li><li> Cubra a assadeira de imagens com fundo de vidro com substrato Fibronectin1 (10 mg / ml em PBS). Deixe prato no banco para cobrir durante a dissecção. </li><li> Use estereoscópio com filtros de fluorescência apropriadas para identificar e embriões transgênicos tipo positivos (fase 5-8 somite). <ol><li> Identificar os embriões transgénicos por análise de mesoderme presomitic (PSM) para expressão YFP sob canal de fluorescência (Figura 1A). Fluorescência shoULD ser visível na região desde o último somite formada para o tailbud. Selecione embriões com sinal mais brilhante; 25% de descendência devem ser embriões portadores homozigóticos 2 cópias do transgene. O número de embriões identificados necessário varia de acordo com a experiência. Um pedaço tailbud dissecados produzirá 1.000 células, em média. Normalmente, alguns embriões positivos adicionais são úteis no caso são feitos erros durante a dissecção. </li><li> Use luz transmitida como uma referência de posicionamento para distinguir qualquer autofluorescência, particularmente na gema de célula, a partir do sinal. </li><li> Transferência de embriões positivos para uma placa de Petri contendo meio de plástico separado E3 sem azul de metileno. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissecção e Dispersão <ol><li> Prepare embriões para dissecção. <ol><li> Sob um microscópio de dissecação, usando uma pinça fina, retire cuidadosamente o córion de cada embrião no meio E3. Cuidado para não danificar o embrião ou interromper o celular gema. </li&gt; <li> Encha Sylgard revestido dissecando prato com meio L15 com soro. Utilizando uma pinça ou outra ferramenta plana, remova as bolhas de ar da superfície do Sylgard. </li><li> Transferência de embriões dechorionated utilizar o vidro pipeta-fogo polido para o prato dissecção. </li><li> Usando as ferramentas de arame, mover todos os embriões para um lado do prato de dissecação. </li></ol></li><li> Dissecar PSM a partir de um único embrião. <ol><li> Orientar um único embrião no seu lado lateral, na pequena bem feito na camada de Sylgard dentro do prato de dissecação (Figura 1B). </li><li> Usando o micro-bisturi, fatia através do embrião e das células gema apenas anterior ao cérebro posterior e pelo pólo ventral do embrião (Figura 1B, pontilhada linha vermelha). </li><li> Retire a peça anterior do embrião a partir do bem, transferindo-o para o lado do prato, e, em seguida, usar as ferramentas de arame para raspar restantes grânulos celulares gema da seção posterior, incluindo o PSM. </li><li>Uma vez que a gema tem sido raspado, achatar e orientar o PSM com a extremidade anterior que aponta para longe do experimentador e posterior que aponta para o experimentador (Figura 1C). </li><li> Se a fina camada de ectoderma não tem puxado para fora por este ponto, use as ferramentas de arame para descascá-lo longe do topo do tecido PSM. </li><li> Usando o micro-corte do bisturi tailbud, a ponta mais posterior da PSM para além da extremidade da notocorda, afastado do resto do tecido (Figura 1C, linha pontilhada vermelha). NOTA: outros pedaços de tecido a partir do PSM, para o PSM exemplo anterior mais perto do último somito formado, pode também ser feita em cultura, dependendo da questão experimental. </li><li> Mova a peça tailbud para um canto do prato longe da área de dissecação. Use as ferramentas de arame para limpar todos os detritos e tecido embrião indesejado do campo de dissecação. </li><li> Repita com a próxima embrião. </li></ol></li><li> Peças Piscina tailbud de múltiplas embryos, dependendo do número de células vai ser necessária para o ensaio. Em média, um único pedaço de tecido tailbud rende 1.000 células. </li><li> Encha vazio de 35 mm de prato plástico com um pequeno volume de tripsina-EDTA. </li><li> Utilizar o vidro pipeta-fogo polido, transferir peças tailbud de dissecar prato em prato contendo tripsina / EDTA. Incubar peças tailbud em tripsina / EDTA durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto o tecido está a ser incubado em tripsina, remover a solução Fibronectin1 da imagiologia prato de fundo de vidro. <ol><li> Lava-se a solução de vidro 3 vezes com água MilliQ. Use sucção para remover cada lavagem e garantir o prato esteja completamente seco. </li></ol></li><li> Dispersar peças tailbud em meio para a imagem latente. <ol><li> Pipetar 100 mL de meio L15 com soro em imagens prato. </li><li> Utilizando uma ponta de gel revestida, remover os pedaços tailbud de tripsina / EDTA em que um volume pequeno quanto possível. </li><li> Pipetar as peças tailbud para o meio noprato de imagem. Pipetar as peças para cima e para baixo várias vezes para separá-las e suspender as células no meio. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar. Verifique a existência de aglomerados de células ao microscópio e dispersar mais, conforme necessário. </li><li> Permitir que as células dispersas na suspensão assente em cima do vidro Fibronectin1 revestido durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Adicionar um volume pequeno de meio L15 adicional com soro para as células antes do início de imagem. Tenha cuidado para não perturbar as células resolvido. </li><li> Dada a questão experimental, adicionar qualquer suplemento ou tratamentos com drogas para a cultura. </li></ol> 3. Imagem latente de células dispersas PSM <ol><li> Configure imagem prato em câmara de temperatura na imagem microscópio time-lapse. Definir Warner câmara até à temperatura desejada para a experiência. Permitir prato a equilibrar durante pelo menos 30 min antes de iniciar a aquisição de imagem. Temperatura Crosscheck com sonda de temperatura externa colocada no prato, se necessário. NOTA: Devido aa relação entre a temperatura ea taxa de somitogenesis 21 controle de temperatura estável é essencial para medições precisas de período em células PSM individuais. </li><li> Adquirir imagens de teste do canal de fluorescência para verificar que o tempo de exposição e ganho de fornecer uma grande gama dinâmica das intensidades, sem saturação para assegurar um bom sinal de níveis de ruído. A imagem típica fluorescência adquiridos a partir de células dispersas gerados a partir de nossas linhas usando este protocolo requer 400 ms e 40 ms para uma imagem de luz transmitida com uma câmera EMCCD operando com um ganho EM de 85. Além disso, o ganho de pré-amplificador e velocidade de leitura do câmera também são essenciais para maximizar o sinal sobre o ruído. </li><li> Usando o canal de luz transmitida, escolher campos de células para a aquisição de lapso de tempo. </li><li> Executar protocolo de aquisição de lapso de tempo para período de tempo desejado. <ol><li> Adquirir uma imagem de fluorescência por um campo de luz transmitida e. NOTA: Defina um intervalo entre ro de aquisiçãounds que irá capturar dinâmica temporal sem foto-branqueamento sobre imagem ampliada ou toxicidade induzindo nas células. Este protocolo utiliza um intervalo de 2 min. </li></ol></li><li> Verifique lapso de tempo set-up de vez em quando durante a gravação para garantir que as células permanecem em foco, nenhum software ou hardware erros, etc </li></ol> 4. Processamento de Imagens de Adquiridas Time-lapse Filmes <ol><li> Abrir arquivo de filme para um campo adquirida em um software de processamento de imagem. NOTA: Fiji foi usado para todo o processamento neste protocolo. <ol><li> Dividir transmitida quadros de luz e de fluorescência de um campo para criar 2 pilhas de imagens. </li></ol></li><li> Acompanhe uma única célula no canal de luz transmitida. <ol><li> Coloque um ROI circular (região de interesse) em torno da célula selecionada no primeiro quadro no canal de luz transmitida. NOTA:.. Apenas as células que são saudáveis ​​1 no final da gravação, 2 não se mover para fora do campo, e 3 não entram em contacto com a outra ce.lls são rastreadas. </li><li> Salvar um ROI cada poucos quadros para o gerente de ROI. Acompanhe célula até que o último quadro. </li></ol></li><li> Medir a intensidade usando os ROIs salvos no canal de fluorescência. <ol><li> Selecione a pilha de fluorescência e com o ROIs salvo, use o círculo personalizado interpolador plug-in e macro para medir a intensidade da célula monitorado ao longo do tempo. </li><li> Confira o traço saída da macro. Se o traço qualitativamente captura características da fluorescência de lapso de tempo, exportar os valores para uma planilha do Excel. </li><li> Salvar a lista de ROI para a célula. </li></ol></li><li> Repita rastreamento no canal transmitido e medir no canal de fluorescência para outras células no campo. </li><li> Repita todas as etapas para campos adicionais do experimento. </li></ol>

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</ol>

Autor Contribuições: ABW desenvolveu e refinou a dispersão, cultura, imagem e protocolos de rastreamento de celular. DS gerou as linhagens transgênicas e supervisionou o projeto do microscópio de fluorescência de lapso de tempo utilizado neste protocolo. AO pioneira iniciais experimentos de prova de princípio para dissociar e células imagem PSM em cultura. JS escreveu a ferramenta plugin do círculo interpolador em Fiji usado para medir a intensidade de fluorescência de filmes de lapso de tempo. ABW e ACO escreveu o manuscrito.

Para estudar um processo celular que ocorre ao longo do desenvolvimento embrionário, os biólogos normalmente utilizam uma abordagem no contexto de todo o embrião. No entanto, para entender completamente como uma única célula se comporta dentro de um período de desenvolvimento, um método para examinar e perturbar as células individuais em isolamento também é altamente benéfico. Ao gerar culturas de células dispersas PSM usando embriões de peixes-zebra transgénicos agora temos uma ferramenta para estudar diretamente a natureza autônoma da célula de oscilações genéticas no relógio da segmentação de uma forma quantitativa. É possível medir a dinâmica das oscilações no nosso repórter fluorescente em centenas de células sob uma variedade de condições. O período observado de células isoladas em cultura é mais longo do que o período somitogenesis no embrião intacto. Observa-se que um explante PSM intactas em cultura também apresenta oscilações mais lentas do que o embrião intacta (dados não apresentados), sugerindo that o período de tempo observado em células isoladas não é simplesmente devido a danos causados ​​por dispersão. Um período variável e amplitude é observado na maior parte de nossa série de tempo de uma única célula. A fonte dessa variabilidade é desconhecida, mas deve revelar detalhes importantes sobre circuitos de ritmo fazendo do relógio da segmentação. Com esse método, podemos estudar os componentes genéticos de segmentação no nível celular e dirigir perguntas que são um desafio para examinar em todo o embrião. Por exemplo, por adição controlada de moléculas sinalizadoras conhecidas encontradas no embrião em desenvolvimento para as culturas, pode-se examinar os efeitos sobre o único oscilador celular PSM em um ensaio robusto e reprodutível. Nosso sistema de cultura PSM abre a porta a uma rigorosa avaliação de quais os fatores que, isoladamente ou em combinação promover oscilações nessas células, quais os fatores que inibem essas oscilações, e para testar a interação entre essas moléculas. Com essas ferramentas em mãos, pretendemosavaliar os modelos existentes das somitogénese que são baseadas em dados de nível de tecido publicados, assim como os resultados de utilização em células individuais para gerar previsões que podem ser testadas em todo o embrião. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo de cultura de células primárias de peixe-zebra para a gravação de lapso de tempo aguda de fluorescência em células individuais; maior desenvolvimento e refinamento deste protocolo é sem dúvida possível. Outros protocolos usam frequentemente embriões de peixes-zebra para gerar linhas celulares estáveis, que podem ser transfectadas com os repórteres e utilizados para imagiologia de longo prazo 27-29. Enquanto linhas estáveis ​​são úteis para a imagem de um processo que não está vinculado ao tempo de desenvolvimento, como o relógio circadiano, a questão da segmentação embrionária requer imagiologia imediato, enquanto as células ainda estão em sua oscilatório, estado progenitor. Uma vez que as células param de oscilação, que assumem um destino celular diferenciada, e quando no tecido, poderá ser incorporado em um somito. É possible que com o fator ou fatores presentes in vitro direito poderíamos gerar PSM-como linhas de peixe-zebra de cultura de células que permanecem oscilatório, permitindo significativamente observações de longo prazo, vários perturbações seqüenciais, ou high-throughput screening. Espera-se que este método de preparação de culturas primárias de células dispersas para imagiologia de lapso de tempo é bem apropriado para o estudo de qualquer processo celular que ocorre dentro de um período de desenvolvimento que não é acessível através de linhas celulares estáveis ​​de peixe-zebra. O isolamento de células-tipos distintos em estágios de desenvolvimento diferentes das linhas repórter transgênicos apropriadas, quer através de dissecação ou através FACS após dissociação embrionário, poderiam fornecer as células iniciais. Alguns otimização das condições de cultivo, guiados pela origem embrionária das células, pode ser necessária. Ao combinar este protocolo flexível e sensível, com o rápido crescimento da coleção de peixes-zebra transgénicoslinhas, esperamos facilitar uma abordagem de desenvolvimento in vitro biologia que é complementar aos métodos genéticos e embriológicas clássicas.

A formação contínua de segmentos ao longo do eixo do corpo de vertebrados, ou somitogénese, é uma evidência de um oscilador espacial e temporal no embrião em desenvolvimento. O mecanismo favorecido controlando somitogenesis é conceitualmente descrito por um &quot;relógio e frente de onda&quot; modelo 1, em que o &quot;relógio&quot;, que consiste de osciladores celulares, agora pensado para ser intracelularmente impulsionada pela expressão rítmica de um conjunto de genes cíclicos 2, carrapatos fora da formação de somitos a partir da mesoderme presomitic (PSM). À medida que o embrião se desenvolve, um amadurecimento &quot;de frente de onda&quot; na PSM se move em conjunto com o tecido regredir para a parte posterior, retardando e prendendo osciladores celulares que passa 3. Em conjunto, este sistema espaçotemporalmente dinâmico é denominado o relógio da segmentação. As abordagens atuais para estudar o relógio período segmentação três níveis crescentes de organização do oscilador genético em células individuais a dia acoplamento locaisa ocorrer entre células e, finalmente, a regulação global da informação posicional no tecido PSM coletiva 4. Estudos anteriores sugerem que a célula-autônoma segmentação oscilador no peixe-zebra é composto de genes e produtos de proteína do her / hes transcrição factorfamily, que são pensados ​​para formar um loop de feedback negativo através da repressão transcricional 5-7. A via de sinalização Delta / Notch sincroniza oscilações entre células vizinhas e regula o período colectiva da população 8-10. Moléculas fgf sinalização produzidas na tailbud aparecem para construir um gradiente entre os PSM do peixe-zebra, e são, assim, a hipótese de contribuir para abrandar e prendendo as células que oscilam na face anterior 11. Até agora, os papéis funcionais de cada uma destas moléculas em somitogénese foram investigados por mutação genética, injecção morfolino, choque térmico sobre-expressão, e antagonista trea drogatamento de componentes de relógio e de sinalização entre as células 5,7,10,12. Usando estas perturbações, função relógio da segmentação foi inferida a partir de descrições de nível de tecido de defeitos somito ea perda de oscilações uniformes na expressão de genes cíclicos como HER1, her7 e delta C. No entanto, quase todos estes dados são a partir de embriões fixas e não conseguem captar com precisão as mudanças que são inerentes à função dinâmica do relógio da segmentação. Mais recentemente, de vários embriões de lapso de tempo de imagem revelou os primeiros mutantes com período oscilador alterada, mas essas observações também foram feitas no nível do tecido 7,13. Assim, não foi observado o comportamento do oscilador de células-autônoma hipótese durante somitogenesis. Instantâneos estáticos de somitogenesis dar uma imagem incompleta, porque, por natureza, o processo é conduzido por um sistema oscilatório. Trabalhos anteriores em células de camundongo e de bico mostrou que os níveis de transcriçãoe aumento de proteína e cair, mas a amostragem uma oscilação de aproximadamente 2 horas a cada 30 ou 45 min necessariamente restringe os dados coletados e, portanto, as conclusões que podem ser extraídas 14,15. Estudo de outros osciladores biológicos, principalmente, relógios circadianos, afastou-se das medições encenadas de expressão gênica e protéica de monitoramento em tempo real usando fluorescente e repórteres bioluminescentes 16,17. Estas ferramentas são essenciais para demonstrar propriedades de clock de 18 células individuais. Um repórter bioluminescente do gene cíclico HES1 foi desenvolvido e brevemente caracterizado nas células do rato PSM individuais 19. O período médio e variação foram calculados para um pequeno número de células, que mostra que as oscilações persistir durante vários ciclos in vitro. No entanto, esses estudos não quantitativamente abordar a estabilidade e robustez da freqüência de oscilação e amplitude, se as células podem entrar espontaneamente ou oscilações de saída,e como as células mantêm as suas relações de fase. Além disso, os efeitos de moléculas de sinalização encontrados no embrião no relógio célula-autónoma não foram directamente testados. Por conseguinte, estas propriedades fundamentais do oscilador de célula única permanecem completamente desconhecido. Recentemente, desenvolveu linhas de peixes transgênicos utilizando BAC recombineering 20 para dirigir Venus (YFP) repórteres de fluorescência de expressão HER1 30. Tais linhas explorar as pistas de regulação do locus cromossômico intacto em que estão inseridas e recapitular a dinâmica temporal e padrão espacial de HER1. Esta descoberta permite o monitoramento em tempo real da expressão do gene no embrião de peixe-zebra desenvolvimento in vivo. Para estudar as propriedades fundamentais das oscilações celulares-autônoma e como tal expressão é regulada ao longo do tempo, que recentemente desenvolveu um método confiável para isolar e gravar a partir de células PSM in vitro. Este protocol descreve como nós utilizamos nossas linhas repórter transgênicos para gerar culturas de células dispersas, a partir do qual podemos caracterizar as oscilações do relógio da segmentação zebrafish em células individuais. Podemos, assim, resolver questões pendentes no campo que não eram acessíveis com a análise de nível de tecido ou estática, bem como manipular diretamente o relógio da segmentação no nível de uma única célula com moléculas de sinalização e inibidores.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Olympus</td><td>Modelo: SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>X-cite Illumination</td><td>Series: 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Olympus</td><td>Modelo: SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina nº 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de vidro</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 35 mm</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico de 60 mm</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Polímero Sylgard</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de manipulação</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td>Para descrição das ferramentas de manipulação Ref. 22</td></tr><tr><td>Faca microcirúrgica</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15 médio</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomiocina</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>0,05% tripsina / 0,02% EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>Dicas de carregamento de gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de micropipetas</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish Fibronectina1 fragmento de 70 kD</td><td>Instalação</td><td></td> de proteína MPI-CBG <td>Gerado internamente a partir de uma construção baseada em trabalhos publicados anteriormente Ref. 23-25</td></tr><tr><td>Placas de imagem de fundo de vidro</td><td>Mattek (poço único)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de imagem de fundo de vidro</td><td>Greiner (CellView -multi-poço)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>Meio E3 sem azul</td><td>de</td><td></td> metileno Feito internamente <td>Do The Zebrafish Book, 5ª Ed. Ref. 26 </td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de aquecimento/resfriamento Warner</td><td>Instruments</td><td>TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td>Câmera EM-CCD</td><td>Andor</td><td>Modelo: iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo com conjunto</td> <td>de filtros Venus</td><td>Zeiss Modelo: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo com conjunto</td><td></td> de filtros Venus <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo com conjunto de filtros Venus</td><td>Lumencor Light Engine</td><td>Modelo: Spectra X</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo com conjunto de filtros Venus</td><td>BrightLine HC 575/15</td><td>F39-575</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de disperso presomitic mesoderme culturas de células for imaging da segmentação relógio zebrafish em células individuais

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

A segmentação é um processo morfogenético periódica e sequencial em vertebrados. Esta formação rítmica de blocos de tecido chamados somitos ao longo do eixo do corpo é a evidência de um oscilador genético padronização do embrião em desenvolvimento. No peixe-zebra, o relógio intracelular segmentação de condução é composta por membros da família de fator de transcrição Ela / Ele é organizado em ciclos de feedback negativo. Geramos linhas recentemente repórter fluorescentes transgénicos para o gene de HER1 cíclico que recapitular o padrão espacio-temporal de oscilações na mesoderme presomitic (PSM). Utilizando estas linhas, foi desenvolvido um sistema de cultura in vitro que permite a análise em tempo real do relógio oscilações de segmentação, dentro de células de PSM individuais isolados. Ao remover o tecido PSM de embriões transgênicos e dispersar as células de oscilação regiões em placas com fundo de vidro, geramos culturas apropriadas para lapso de tempo de imagem de sinal de fluorescência decélulas-relógio individual. Esta abordagem fornece uma estrutura experimental e conceitual para a manipulação direta do relógio da segmentação, com resolução de uma única célula sem precedentes, permitindo que suas propriedades de células-autônoma e em nível de tecido a ser distinguido e dissecados.

Este protocolo produz culturas de células, dispersos, PSM únicos viáveis ​​para lapso de tempo de imagem de sinal de fluorescência (Figura 2). Nossa transgene gera um repórter cujo ciclo de produção e degradação ocorre com dinâmica semelhante ao do gene endógeno de proteína e no embrião, no fim de meia hora. Devido ao seu volume de negócios rápido, o sinal YFP em células individuais devem ser detectados rapidamente para minimizar branqueamento e com uma resolução temporal alta para capturar as características de cada ciclo oscilatório. Além disso, dada a imprecisão relativa do sinal, as condições de cultura e de aquisição ter sido cuidadosamente ajustada para assegurar resultados sensíveis e robustos. Nós encontramos os seguintes fatores a ser importantes na geração de culturas de células ótimas PSM para a imagem: 1. Um substrato ECM usado para o revestimento das placas de cultura com fundo de vidro. 2. Adição de soro para a dissecção e meio de imagem. 3. Dissecção do PSM de embriões identificados tomadas após o acasalamento hetepares rozygous, cuja descendência potencialmente levar 2 cópias do transgene. 4. Aquisição de imagens dentro de uma gama de ampliação óptima, utilizando uma objectiva de maior NA para assegurar a captura eficiente do sinal de fluorescência. 5. Iluminação com uma fonte de luz de estado sólido para minimizar flutuações de intensidade que possam contribuir para o ruído de fundo. 6. Detecção de sinal com uma câmara de alta sensibilidade EM-CCD para maximizar o sinal de leitura. Culturas sub-óptimas irão conter células que não permanecem arredondada e saudável durante a gravação. Colocámos a hipótese de que o substrato de ECM, um fragmento de fibronectin1 zebrafish mantém as células num estado indiferenciado PSM semelhante, em comparação com outros substratos normalmente utilizados como poli-lisina ou laminina. Outros substratos testadas causada células para achatar no vidro e a perda de sinal fluorescente oscilante ao longo da gravação. Nós também descobrimos que a adição de soro para o meio durante a dissecção, dispersãoea gravação foi importante não só para saciar a tripsina usada para dissociação, mas também aumentou a intensidade de fluorescência ao longo do fundo, provavelmente devido à melhoria da viabilidade celular. Para garantir a captação do sinal ideal de células individuais foi utilizada uma objetiva de 40x projetada especificamente para imagens de fluorescência (Zeiss Plano série NeoFluor) com uma NA alto. Descobrimos também que uma fonte de luz de estado sólido, desde a iluminação mais estável do que as lâmpadas de mercúrio tradicionais, o que é fundamental para minimizar as flutuações de fundo que contribuem para imagens ruidosas. Essas modificações são importantes para garantir resultados robustos. Usando este protocolo, esperamos culturas em que a maioria das células de um determinado campo são fluorescentes, em algum momento durante a gravação. Descobrimos que as células fluorescentes normalmente permanecem arredondado e às vezes são bastante móveis durante as gravações. Algumas células, incluindo as células fluorescentes, podem tornar-se apoptótico durante a gravação. Estas células são excluídos de qualquer umnálise. Também excluir as células que entram em contato com outras células ou se mover para fora do campo de visão. Em média, vemos uma redução de 12% no número de células por campo pelo fim da gravação 10 horas tal como medido por contagem do número de células saudáveis ​​no canal de luz transmitida. Esta perda inclui tanto a morte das células e células que foram movidos para fora do campo. Dadas essas ressalvas, podemos, em média, faixa 5 células fluorescentes por campo que permanecem viável e visível, e tipicamente gravar seis campos por condição. Por exemplo, um experimento com 4 condições terá 24 campos de total adquirido e, normalmente, cerca de 30 células rastreadas por condição. Sob condições normais de imagem com meio L15 contendo 10% de soro fetal bovino, descobrimos que as células PSM (n = 101 células de quatro experiências em replicado) pode produzir entre 2 e 7 picos, com a média e o desvio padrão de 3 ± 1 (2 picos ciclos -3). O número de pico média, bem como o percentil 25%, é de 2 picos e o percentil 75% de is três picos. Usando o nosso acompanhamento e análise semi-automatizada, podemos gerar rapidamente intensidade de fluorescência sobre traços de tempo para as células PSM individuais, com um traço representativo célula mostrada na Figura 2C. Estes vestígios matérias pode ser usado para fazer medições quantitativas de propriedades das células PSM oscilatórios, tais como a frequência, a amplitude, o número de ciclos e tempo de picos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Figura 1. Identificação de embriões transgênicos e esquemas de sua dissecção. (A) Vista lateral de um embrião de peixe-zebra transgênico expressando YFP fluorescência em fase ~ 5 somite. Imagem é uma sobreposição de luz transmitida e canal de fluorescência. As setas indicam áreas de sinal a partir da ponta da tailbud, durante todo o PSM, em relação a l<html> ast formado somite. Inset mostra um esquema do transgene repórter (para mais informações sobre o seu desenvolvimento e comportamento in vivo referem-se a 30 Soroldoni et al.. (B) Esquema de vista lateral do embrião antes do primeiro corte durante a dissecção. Pontilhada linha vermelha indica o primeiro corte feitos em toda a parte posterior do cérebro, embora a célula gema apenas atrás do tailbud. (C) Representação esquemática de achatada PSM após a remoção de grânulos de vitelo e camada epidérmica, orientada ao longo do eixo ântero-posterior. pontilhada linha vermelha indica o segundo corte para remover a ponta do tailbud para a dispersão e cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imagens representativas e os traços de uma única célula em uma cultura PSM dispersa. (A) Montagem de imagens de luz transmitida de uma única célula PSM em uma 6-h de gravação de lapso de tempo. Note-se que a célula permanece arredondada e saudáveis ​​ao longo do curso do registo. (B) correspondente montagem de imagens de fluorescência a partir de uma única célula de PSM. Picos na intensidade da célula são numerados no decurso da gravação. (C) intensidade média ao longo do tempo medido a partir de um ROI colocado nesta célula. Os valores são retirados de cada quadro de um filme com uma taxa de quadros de um por 2 min usando o círculo interpolador plug-in personalizado e macro escrito em Fiji. Picos na intensidade são novamente contados em todo o traçado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas dispersas para a imagem de longa duração de oscilações em repórteres de fluorescência da expressão gênica cíclica em células isoladas individuais do relógio de segmentação do peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente por meio da dissecção do mesoderma pré-somítico ou tecido PSM de embriões de peixe-zebra transgênicos. Em seguida, o pedaço mais posterior do PSM, o andótipo caudal, é dissecado de múltiplos embriões e os fragmentos são reunidos em tripsina.Em seguida, os fragmentos do embrião são dispersos manualmente com uma pipeta, gerando uma suspensão celular. Por fim, a suspensão celular é semeada em placas de cultura revestidas com fibronectina para imageamento de longo prazo. Como resultado, podem ser obtidos dados que mostram múltiplas oscilações na intensidade ao longo do tempo em células individuais do mesoderma presomítico, por meio de microscopia de fluorescência com lapso de tempo.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a hibridização em C de expressão gênica em tecido de MPE, é que nosso repórter fluorescente permite o monitoramento em tempo real da dinâmica das oscilações no relógio de segmentação ao nível de células individuais. Este método pode fornecer informações únicas sobre o relógio de segmentação, mas também pode ser utilizado em outros sistemas, como organogênese ou modelos de doenças, onde pode nos fornecer dados sobre o comportamento em nível de célula única, desde que as linhagens transgênicas apropriadas estejam disponíveis. No dia anterior à dissecação, obtenha embriões de um cruzamento em peixes-zebra heterozigóticos para o alelo transgênico.Cultive os embriões em meio E3 sem azul de metileno a 28 graus Celsius até o estágio de escudo, cerca de seis horas após a fertilização (HPF), ou transfira os embriões em meio E3 sem azul de metileno para 20 graus Celsius durante a noite a 20 graus Celsius. Os embriões formarão um somito por hora assim que atingirem o estágio de embrião com broto caudal. No início do protocolo de dissecção na manhã seguinte, os embriões devem estar no estágio de cinco a oito somitos. Após montar as ferramentas para a dissecção, cubra uma placa de vidro para imagem com fibronectina como substrato.Deixe a placa sobre a bancada para revestimento durante a dissecação sob um microscópio estereoscópico fluorescente. Identifique embriões transgênicos mediante a análise do mesoderma pré-somítico ou MPS. Para expressão de YFP.A fluorescência deve ser visível na região desde o último somito formado até a massa caudal. Selecione embriões com o sinal mais intenso. 25% da prole deve ser composta por embriões homozigotos que carreguem duas cópias do transgene, utilizando luz transmitida como referência posicional.Para distinguir qualquer autofluorescência, transfira os embriões positivos para um prato de Petri plástico separado contendo meio E3 sem azul de metileno. Para preparar os embriões para dissecação sob um microscópio estereoscópico usando pinças finas, remova cuidadosamente o córion de cada embrião no meio E3. Tenha cuidado para não danificar o embrião nem perturbar a célula óvulo.Cubra uma placa de dissecação com cilindro protetor com meio L-15 contendo soro, utilizando pinças ou outra ferramenta plana. Remova todas as bolhas de ar da superfície do protetor S com uma pipeta de vidro polida ao fogo. Transfira os embriões revestidos para a placa de dissecação e, com as ferramentas de arame, mova todos os embriões para um dos lados.Em seguida, no pequeno orifício feito na camada de sard dentro da placa de dissecação, posicione um único embrião em seu lado lateral. Então, usando o bisturi microscópico, corte através do embrião e da célula do vitelo logo anterior ao cérebro posterior e através do polo ventral do embrião. Remova a parte anterior do embrião do orifício, deslocando-a para o lado da placa.Em seguida, utilize as ferramentas de arame para remover os grânulos restantes das células do vitelo da região posterior, incluindo o MPE. Depois, aplaneie e oriente o MPE com a extremidade anterior voltada para longe e a posterior voltada para frente. Se a fina camada de ectoderma ainda não tiver se soltado até este ponto, use as ferramentas de arame para destacá-la da parte superior do tecido do MPE utilizando o microescalpelo, cortando a ponta mais posterior do MPE além da extremidade da notocorda ou do botão caudal, separando-a do restante do tecido.Transfira o fragmento do embrião para um canto da placa, longe da área de dissecação, e use as ferramentas de arame para remover detritos e tecido embrionário indesejado da poça no campo de dissecação. Fragmentos do embrião de múltiplos embriões, dependendo da quantidade de células necessárias para o experimento. Em média, um único fragmento de tecido do embrião fornece 1000 células.Encha um recipiente plástico vazio de 35 milímetros com um pequeno volume de tripsina EDTA e, utilizando a pipeta de vidro polida a fogo, transfira os fragmentos do botão caudal para o recipiente. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Enquanto o tecido estiver incubando na tripsina, adicione água milli Q à solução de fibronectina no recipiente de imagem com fundo de vidro.Remova a solução e lave o vidro três vezes com água Milli Q. Utilize sucção para remover cada lavagem e assegure-se de que o recipiente esteja completamente seco. Para imagens dos fragmentos do botão caudal, pipete 100 microlitros de L-15 com soro em um recipiente para imagem.Usando uma ponta de gel revestida, transfira os fragmentos do embrião em um volume tão pequeno quanto possível de tripsina-EDTA para o recipiente de imagem. Pipete os fragmentos para cima e para baixo várias vezes para separá-los e suspender as células no meio. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar.Deixe as células sedimentarem sobre o vidro recoberto com fibronectina por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione um pequeno volume de meio L-15 adicional com soro às células. Antes de iniciar a aquisição de imagens.Use cuidado para não perturbar as células sedimentadas. Para imaginar as células, comece colocando a placa na câmara de temperatura no microscópio de lapso de tempo.Defina a temperatura desejada e aguarde pelo menos 30 minutos para que a placa atinja o equilíbrio antes de iniciar a aquisição de imagens. Uma temperatura estável é essencial para medições precisas do período. Em células PSM individuais, adquira imagens fluorescentes de teste para verificar o tempo de exposição.Tempo e ganho. Forneça uma ampla faixa dinâmica de intensidades sem saturação para garantir bons níveis de sinal em relação ao ruído. Uma imagem de fluorescência típica adquirida de células dispersas geradas a partir das nossas linhagens.Utilizar este protocolo exige 400 milissegundos e 40 milissegundos para uma imagem de luz transmitida com uma câmera E-M-C-C-D operando em um ganho EM de 85. Além disso, o ganho do pré-amplificador e a velocidade de leitura da câmera também são essenciais para maximizar o sinal em relação ao ruído utilizando o canal de luz transmitida; escolha um campo de células para a aquisição em lapso de tempo. Execute um protocolo de aquisição em lapso de tempo adquirindo uma imagem de luz transmitida e uma imagem de fluorescência por campo com um intervalo de, por exemplo, dois minutos, que capture a dinâmica temporal sem provocar fotodesvanecimento ou induzir toxicidade nas células.Para processar filmes com lapso de tempo, abra um arquivo e separe os quadros de luz transmitida e fluorescentes para criar duas pilhas de imagens. Para rastrear uma única célula no canal de luz transmitida, escolha uma região circular de interesse ou ROI ao redor de uma célula que ainda estava saudável ao final da gravação, que não se mova para fora do campo e que não entre em contato com outras células.Salve uma ROI a cada poucas imagens no gerenciador de ROI e acompanhe a célula até a última imagem. Selecione a pilha fluorescente e, com as ROI salvas, utilize o plugin e macro personalizados do INTERPOLADOR circular para medir a intensidade da célula rastreada ao longo do tempo. Verifique o traçado de saída da macro para confirmar se ela captura qualitativamente as características da aquisição temporal de fluorescência.Exporte os valores para uma planilha do Excel. Salve a lista de ROI para a célula. São mostradas aqui imagens representativas de uma única célula PSM em um registro de lapso de tempo de 10 horas.O transgênico utilizado aqui gera um repórter cujo ciclo de produção e degradação ocorre com dinâmica e níveis de expressão semelhantes aos do gene endógeno e da proteína no embrião, usando condições padrão de imagem com meio L 15 contendo 10% de soro bovino fetal. Observamos que as células da MPE podem produzir entre dois e sete picos, com média e desvio padrão de três mais ou menos um pico. O número mediano de picos, bem como o percentil 25%, é de dois picos, e o percentil 75% é de três picos.Utilizando nosso rastreamento e análise semi-automatizados, podemos gerar rapidamente gráficos da intensidade de fluorescência ao longo do tempo para células individuais do MSP. Esses gráficos brutos podem então ser utilizados para realizar medições quantitativas de propriedades das células oscilantes do MSP, como frequência, amplitude, número de ciclos e momento dos picos. Após este procedimento, outros métodos, como a adição de moléculas sinalizadoras ou inibidores, podem ser realizados para responder à pergunta de como o oscilador de célula única responde a fatores presentes no exterior do embrião. Esperamos que esta técnica permita aos pesquisadores na área de cementogênese estudar o comportamento de células individuais do relógio de segmentação de maneira simples, afastando as células da complexidade das interações célula-célula e dos fatores em nível tecidual, o que torna este um trabalho realmente difícil no embrião intacto.

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a gerar culturas dispersas de mesoderme pré-somítico de Danio rerio para imagem de oscilações do relógio de segmentação em nível de célula única. Este método permite monitorar dinâmicas de expressão gênica cíclica em tempo real.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

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