Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como obter populações enriquecidas de neurônios do hipocampo e neurônios únicos de seções de tecido congelado por microdissecção por captura a laser para posterior análise de expressão gênica. Isso é feito primeiro anestesiando um rato em uma câmara anestésica. O rato é então intubado, ventilado mecanicamente e colocado em um suporte de cabeça estereotáxico para preparar o rato Para lesão cerebral por percussão fluida, uma craniotomia é realizada.

O segundo passo é administrar a lesão cerebral por percussão fluida. Em seguida, as seções coronais do cérebro são cortadas em um criostato e coradas com um auxílio fluro, um marcador para neurônios degenerados, ou violeta real, uma mancha de míssil. A etapa final é realizar a micro dissecação de captura a laser e coletar neurônios individuais ou pools de neurônios.

Em última análise, o RNA total é isolado das células capturadas, analisado quanto à qualidade e quantificado usando um bioanalisador Agilent e usado em aplicações posteriores, como PCR quantitativo em tempo real e análise de microarray focada em vias ou em todo o genoma. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a microdissecção manual, é que podemos obter populações enriquecidas de neurônios ou outros tipos de células cerebrais, como glia ou células imunomoduladoras, ou neurônios únicos de seções de tecido. Isso nos permite realizar a análise da expressão gênica em distintos tipos de células identificados no cérebro e em outros tecidos heterogêneos compostos por vários tipos de células, demonstrando que este procedimento será perdido.

Debbie Boone, pesquisadora associada sênior em nosso laboratório. Primeiro, recupere o tecido cerebral obtido de ratos com percussão fluida, lesão cerebral traumática ou lesão simulada do freezer de 80 graus Celsius negativos e transfira para 22 graus Celsius negativos. Criostato por 10 minutos para levar o cérebro à temperatura de seccionamento enquanto o cérebro está descongelando.

Limpe o criostato com zap de RNA contendo etanol e limpe as escovas com etanol. Após os 10 minutos decorridos, remova o cérebro do tubo e coloque-o com o lado ventral para cima em um pedaço de gaze no estágio de criostato, use uma lâmina de barbear nova e corte o cérebro para remover a porção posterior do cérebro. Apenas rostral ao cerebelo e a porção anterior no quiasma óptico.

Encha um molde criogênico com meio de montagem OCT e coloque o cérebro no molde com o lado anterior voltado para baixo. Deixe o tecido cerebral congelar no meio de montagem até que fique branco. Isso deve levar aproximadamente 10 minutos.

Agora congele o disco de amostra no cérebro com OCT. Em seguida, remova o molde. Insira o disco com o cérebro preso na cabeça da amostra e aperte os parafusos.

Insira um baixo perfil descartável lâmina no porta-faca e aperte a alavanca para baixo. Comece a cortar o cérebro a 20 mícrons para remover a camada externa de OCT. Quando a região do hipocampo for alcançada, ajuste o mostrador de mícron para 10.

Colete seções seriais coronais colocando uma lâmina de vidro ou vidro positivo. Deslize para a seção de tecido. Coloque as lâminas em um rack de coloração livre de RNAs a menos 20 graus Celsius até que o corte esteja completo.

Antes de proceder à coloração das seções, limpe todos os recipientes de coloração e cilindros graduados com ese e enxágue com água mili Q. Certifique-se de que todas as soluções foram preparadas com água livre de RNAs e que a coloração violeta e de flúor jade já passou por um filtro de 0,2 mícron antes. Use seções cerebrais Thor em temperatura ambiente por 30 segundos e fixe em 75% de etanol por um minuto.

Em seguida, prossiga para a contracoloração apropriada para LCM de faixas de neurônios ou neurônios individuais para LCM de faixas de neurônios após a fixação, enxágue as lâminas em água livre de RNAs por um minuto de coloração com 1% de crista violeta por um minuto. Enxágüe em água livre de RNAs três vezes por um minuto cada, desidrate com etanol a 95% duas vezes por 30 segundos cada. Em seguida, 100% de etanol duas vezes por 30 segundos e xileno duas vezes por três minutos cada.

Após a coloração ao ar, seque todas as seções em uma hotte por 15 minutos e depois prossiga para LCM.Here. LCM é executado. Usando um microscópio de célula P dois E com um laser de diodo infravermelho, primeiro ajuste o joystick central para a posição vertical.

Em seguida, gire e trave o objetivo Forex na posição. Coloque uma lâmina com seções de hipocampo coradas no centro do microscópio stage e ajuste manualmente até que a região do hipocampo esteja à vista. Use o curso e encontre ajustes de foco.

Para colocar a seção em foco, ative o mandril de vácuo pressionando o botão de vácuo no controlador. Em seguida, gire e trave a objetiva de 10 x no lugar. Concentre-se novamente com o curso e ajustes finos.

Carregue as tampas de suas tampas macro LCM nas tampas, seu módulo de, e posicione uma tampa na posição da linha de carga. Gire o braço de colocação da tampa e posicione-o ao redor da tampa. Em seguida, levante o braço de colocação da tampa para remover as tampas do módulo de.

Gire o braço de colocação da tampa sobre a corrediça e, em seguida, abaixe-o sobre a corrediça para colocar a tampa na corrediça. Ajuste o foco fino e mova o joystick para verificar se as células estão dentro do círculo preto na tampa. Todas as células a serem capturadas devem estar dentro deste círculo preto.

Agora defina os parâmetros do laser. Primeiro pressione o botão de habilitação do laser no controlador. O ponto alvo do laser será visível como rosa.

no campo de view no monitor do computador. Defina o tamanho do ponto do laser como pequeno para focar o laser e ajuste a potência e a duração para 65 a 75 miliwatts por um a dois milissegundos, conforme necessário, para uma captura ideal da célula. Para testar o laser, use o joystick para mover o ponto do laser para uma área onde não haja células para captar.

Dispare o laser usando o botão de polegar. Em seguida, use o joystick para mover o ponto do laser para longe do ponto de polímero derretido e verifique se há um anel escuro visível ao redor de uma área clara onde o laser foi disparado. Para capturar células, use o joystick para mover o ponto do laser sobre a área das células para capturar e disparar o laser.

Usando o botão de polegar, mova o joystick enquanto dispara o laser para capturar uma grande área de células. Depois de disparar todas as células de interesse, levante o braço de colocação da tampa. As células capturadas se separarão da seção de tecido e aderirão à tampa.

Sua tampa, o tecido restante e as células ausentes serão visíveis no campo de view. As células da tampa também podem ser visualizadas colocando-a em uma parte vazia do slide. Levante o braço de colocação da tampa e gire-o para a estação de descarga da tampa.

Abaixe a tampa na estação e gire o braço de colocação da tampa de volta à posição anterior. Deslize a tampa da ferramenta de inserção ao longo da plataforma e na tampa. Levante a ferramenta com a tampa presa da plataforma.

Toque levemente a tampa na parte adesiva de um post-it para limpar o tecido indesejado. Coloque a tampa em um tubo livre de RNAs de 0,5 mililitro preenchido com 100 microlitros de tampão de lise obtido do kit de microisolamento aquoso RN. Imediatamente vórtice a tampa por 30 segundos para mentiras.

As células incubam as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos e congelam a menos 80 graus Celsius até o isolamento do RNA. O procedimento de coloração para LCM de neurônios lesionados únicos após a fixação é semelhante ao procedimento para faixas de neurônios. No entanto, alguns tempos de incubação diferem e as seções mantidas com flúor por quatro minutos antes do enxágue e desidratação, consulte a parte de texto do protocolo para obter detalhes após a coloração.

Novamente, seque ao ar todas as seções em uma capela por 15 minutos. Antes de prosseguir para o LCM para capturar a carga de células únicas, capture as tampas HS LCM na tampa ou no módulo de, usando o mesmo procedimento da tampa macro LCM. Novamente, defina o tamanho do ponto do laser como pequeno para focar o laser, mas desta vez ajuste a potência e a duração do laser para 65 a 75 miliwatts por 0,45 a 0,5 milissegundos para captura ideal de células individuais.

Gire o braço de colocação da tampa sobre a corrediça e abaixe o braço em direção à corrediça. Para colocar a tampa sobre a lâmina, a superfície da tampa de captura HS fica elevada em relação à amostra. Durante o LCM, use o joystick para mover o laser sobre células positivas de auxílio de flúor únicas.

Todas as células que estão sendo capturadas devem estar dentro do pequeno anel preto na tampa que dispara o laser usando o botão de polegar. Quando todas as células dentro da área do círculo preto tiverem sido disparadas com o elevador a laser, o braço de colocação da tampa, as células capturadas se separarão da seção de tecido e aderirão à tampa de captura. Agora coloque outra lâmina no microscópio stage e colete células positivas para auxiliar de fluro até que a tampa HS esteja cheia.

Em seguida, coloque a tampa em um tubo livre de RNAs de 0,5 mililitro cheio de 40 a 50 microlitros de lise, tampão, vórtice e incubadoras antes de congelar novamente a 80 graus Celsius negativos. Se não for imediatamente, execute o isolamento de RNA de acordo com as instruções na parte de texto do protocolo. As imagens a seguir mostram microdissecção por captura a laser de faixas de populações de células específicas do cérebro de rato congelado em seções coronais de 10 mícrons do cérebro de rato.

Foram preparados de acordo com este protocolo e corados com violeta de crista e mancha de míssil. Esta imagem mostra neurônios parametálicos dos subcampos ca um a ca três do hipocampo de ratos. Aqui, células granulares no giro dentado do hipocampo foram capturadas.

Finalmente, mostramos faixas de neurônios capturados dos núcleos supra quiasmas bilaterais localizados em ambos os lados do terceiro ventrículo e acima do quiasma óptico. O SCN contém o relógio circadiano mestre que controla os ritmos circadianos em todo o corpo. As imagens a seguir mostram microdissecção de captura a laser de neurônios únicos do hipocampo de ratos.

Mostrados aqui estão os hipocampos positivos para flúor degenerados ca três neurônios aqui sobrevivendo fluro ajuda negativa ca três neurônios antes e depois do LCM são mostrados células capturadas são visualizadas na tampa do LCM. As imagens a seguir mostraram análise da expressão gênica do RNA total, isolado de neurônios capturados a laser. Esta imagem mostra dados quantitativos de PCR em tempo real da expressão gênica do relógio circadiano no SCN.

Este mapa de calor da expressão gênica em neurônios do hipocampo moribundos e sobreviventes mostra o perfil de expressão de genes relacionados à apoptose usando matrizes de PCR focadas. Finalmente, mostramos um exemplo de um mapa de calor gerado a partir de uma análise de microarray otorrinolaringológico de genoma completo da expressão gênica em ca um a ca três neurônios de ratos que receberam lesão simulada TBI ou TBI mais um vírus siRNA adeno-associado reclinado projetado para derrubar a expressão de óxido nítrico neuronal, sintase ou glutationa peroxidase um, ambos são genes induzidos por lesão cerebral Após seu desenvolvimento. Essas técnicas abriram caminho para cientistas em muitos campos de pesquisa, incluindo lesão cerebral e câncer, que usam modelos animais desses distúrbios para realizar perfis proteômicos e metabólicos genômicos de populações de células específicas.

Por exemplo, atualmente estamos usando essas técnicas para capturar a laser populações de células específicas do córtex pré-frontal e das áreas cerebrais do núcleo accumbens que são conhecidas por estarem envolvidas no vício.