Name: Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda a usar microdissecção por laser para isolar neurônios hipocampais de ratos após lesão cerebral traumática. Este método permite análise de expressão gênica em populações celulares específicas com alta precisão.

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Este trabalho é financiado por R01 NS052532 (para HLH), a Fundação Moody, e do Departamento de Anestesiologia. Agradecemos Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry para a sua assistência editorial, e Christy Perry para layout e excelente produção de todas as figuras, tabelas e ilustrações.

1. Procedimentos Cirúrgicos e Percussão Fluid TCE <ol><li> Todos os experimentos com animais são primeiro aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade do Texas Medical Branch, Galveston, Texas e do Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8 ª edição, Conselho Nacional de Pesquisa). </li><li> Os ratos (machos adultos Sprague-Dawley, 400-500 g obtido a partir do fornecedor de Charles Rivers, Portland, Maine) são alojados dois por gaiola e forneceu comida e água ad libitum num viveiro com estas condições constantes: ciclo de luz (600 a 1800 hr h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e humidade (40% a 50%) uma semana antes da utilização. </li><li> Anestesiar ratos com 4% isoflurano, intubar e ventilar mecanicamente (NEMI Científico; New England Medical Instruments, Medway, MA) os ratos com 1,5-2,0% de isoflurano em oxigênio: o ar (70:30) e prepará-los para parassagital fluido-percussão ferimento, como descrito anteriormente. 8, 10 </li><li> Sacrificar ratos no ponto de tempo apropriado após a lesão, dependendo do desenho experimental. Remover rapidamente os cérebros, congelar imediatamente em gelo seco, e armazenar a -80 ° C em um tubo de 50 ml ou prosseguir imediatamente para incorporar em OCT para seccionamento congelado. </li></ol> 2. Corte e coloração do cérebro de ratos <ol><li> O tecido do cérebro que não é utilizado imediatamente pode ser mantido à temperatura de -80 ° C, durante até um mês, se mantidas a uma temperatura constante. Cérebros que são congelados a -80 ° C, depois descongelado a 20 ° C durante o corte, e em seguida, re-congeladas não produzem RNA de qualidade após a descongelação segundo. Uma vez que o cérebro é descongelado, montado em OCT e seccionadas, as lâminas devem ser coradas dentro de 24 horas e usados ​​para a LCM dentro de 30 minutos a uma hora de coloração. Isto irá assegurar RNA de boa qualidade. Seguindo LCM, as células capturadas no LCM tampas podem ser armazenados em tampão de lise a -80 ° C durante até uma semana, mas ARN deve ser isolado de uma forma atempada, para garantir a melhor qualidade. &lt;/ Li&gt; <li> Antes do corte do cérebro, limpe o criostato com RNase-Zap e limpar os pincéis com EtOH (substitua a lâmina descartável entre cada cérebro). </li><li> Recuperar o cérebro no tubo de 50 ml a partir do congelador -80 ° C; colocá-lo no criostato a uma temperatura de -22 ° C e descongelamento no tubo durante cerca de 10 min. Remover o cérebro do tubo e local para o palco em gaze, lado ventral para cima. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, a fatia de cérebro para remover a porção posterior do cérebro apenas rostral do cerebelo e da porção anterior no quiasma. Encha uma cryomold com outubro meio de montagem (Tissue Tek), e colocar o cérebro para o molde com o lado anterior para baixo. Permitir que o tecido cerebral de congelar no meio de montagem até que fique branco (aproximadamente 10 min). </li><li> Congele a amostra de disco (Tissue Tek) no cérebro com outubro Remover o cérebro do molde. Insira o cérebro na cabeça do espécime e aperte os parafusos. </li><li> Insira um Disposavel, lâmina de perfil baixo (Fisher Scientific) no porta faca e apertar a alavanca para baixo. </li><li> Começar a cortar o cérebro menos de 20 um para remover a camada exterior de outubro Uma vez que a região do hipocampo é atingido, coloque o disco a 10 mícron. Colete cortes seriados coronais, colocando uma placa de vidro ou de vidro deslizante mais para a secção de tecido (Fisher Scientific). As lâminas são conservados a -20 ° C em um suporte de coloração RNase até seccionamento é completa. </li><li> Para remover todas as RNases de vidro onde as seções de tecido são processados, limpe todos os recipientes de coloração e cilindros graduados com Eliminase (Fisher Scientific) e enxaguar em água Milli Q. Preparar todas as soluções com RNase isento de água e filtrar a violeta de cresilo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) mancha com um filtro de 0,2 um antes da utilização. </li><li> Descongelar secções do cérebro, à RT durante 30 seg e fixar em 75% ETOH (1 min). </li><li> Para LCM de neurónios individuais lesados ​​de fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), Contracoloração com 1% de violeta de cresilo (15-20 seg), lavar em água isenta de RNase (2 x 30 s), a mancha com Fluoro-Jade (4 min), lavar em água isenta de RNase (3 x 1 min), desidratar com ETOH a 95% feito de água isenta de RNase (30 seg), 100% de ETOH (30 seg), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Para LCM de faixas de neurónios após a fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), com 1% de mancha violeta de cresilo (1 min), lavar em água isenta de RNase para (3 x 1 min), com 95% de desidratar ETOH (2 x 30 s), ETOH a 100% (2 x 30 segundos), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Ar seco em todas as seções um exaustor por 15 min antes da LCM. Slides podem ser armazenados os lados, seção-se, em uma caixa de lâminas revestidas com dessecante, se eles precisam ser transferidos de sala em sala. No entanto, os melhores resultados são obtidos se LCM é realizada imediatamente após cortes são secos. LCM deve ser limitado entre 30 minutos e 1 hora. Na seção seguinte, descrevemos primeiro como capturar trechos contínuos de células, o que é eaSIEST de dominar para aqueles que estão aprendendo esta técnica. Em seguida, descrevemos como precisamente captar neurônios individuais. No nosso processo, identificamos neurónios moribundos por sua afinidade para Fluoro Jade-um marcador de neurónios em degeneração. Células Fluoro-Jade-negativos se presume estar sobrevivendo neurônios. </li></ol> 3. Laser Microdissecção Captura (LCM) LCM de faixas de populações enriquecidas de neurônios do hipocampo <ol><li> LCM é realizada usando um microscópio PixCell IIe com um laser de diodo infravermelho (Life Technologies). </li><li> Ajuste o joystick centro para a posição vertical. Gire e bloquear o objetivo 4X na posição. </li><li> Coloque um slide no centro da platina do microscópio e ajustar manualmente até que a região do hipocampo está em vista. Use os ajustes de foco grosso e fino para trazer a imagem em foco. </li><li> Activar o mandril de vácuo pressionando o botão de vácuo no controlador. Gire e bloquear a objetiva de 10X em place. Concentre-se novamente com ajustes grosso e fino. </li><li> Carregar o CapSure Macro LCM tampas (Life Technologies) para o módulo de cassete CapSure e a posição de um tampão na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posição ao redor da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço para baixo sobre o slide, o que irá colocar a tampa no slide. Ajuste o foco fino e mova o joystick para verificar se as células estão dentro do círculo preto na tampa. Todas as capturas células devem estar dentro deste círculo preto. </li><li> Defina os parâmetros do laser. Primeiro, pressione o botão do laser habilitar no controlador. O local alvo laser será visível como um ponto-de-rosa no campo de visão do monitor do computador. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência e duração de 65-75 mW, para 1,0-2,0 msec, conforme necessário para a captação celular óptimo. </li><li> Para teª a laser, utilize o joystick para mover o ponto de laser para uma área onde não existem células para pegar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Use o joystick para mover o ponto de laser de distância do local polímero fundido e verificar para ver se um anel visível escuro circunda uma área livre onde o laser foi disparado. </li><li> Para capturar as células, utilize o joystick para mover o ponto de laser sobre a área das células de capturar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Mover o joystick quando disparar o laser para capturar uma grande área de células. Quando o laser é disparado derrete a película de polímero termoplástico sobre a tampa para a superfície das células alvo. O polímero absorve a radiação laser, o que não altera o RNA do DNA, ou proteína assegurar a integridade da amostra para futuras aplicações moleculares. </li><li> Depois de disparar todas as células de interesse, levantar o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere à tampa CapSure. O tecido remanescente e células ausentes serão visvel no campo de visão. As células da tampa também pode ser visto através da colocação da tampa sobre uma parte vazia do slide. </li><li> Levante o braço Colocação Cap e girá-lo para o Cap Unload Station. Abaixe a tampa na estação e girar o braço Colocação Cap de volta à sua posição anterior. </li><li> Deslize a ferramenta de inserção CapSure ao longo da plataforma e no tampão. Levantar a ferramenta a partir da plataforma. A tampa permanecerá ligado. Tocar levemente a tampa para a almofada CapSure limpo para limpar o tecido indesejado. </li><li> Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 100 ul de tampão de lise obtido a partir do kit de isolamento Micro-RNAqueous. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> LCM de um único FJ + neurônios no hipocampo <ol start="15"><li> Para capturar células individuais, coloque CapSure HS LCM tampas no módulo cassete CapSure e positisobre uma tampa na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posicioná-lo em volta da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência do laser e da duração de 65 mW para -75 0,45-0,50 msec para captura celular óptimo de células individuais. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço em direção ao slide. Isto irá colocar a tampa no slide. O Capsure HS superfície tampa senta elevada da amostra durante LCM. </li><li> Use o joystick para mover o laser mais simples FJ + células. Todas as células sendo capturados deve estar dentro do pequeno anel preto na tampa. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. </li><li> Quando todas as células dentro da área do círculo preto foram disparados com o laser, levante o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere ao HS CapSure cap. </li><li> Coloque outro slide no microslidar fase e recolher FJ + células até que a tampa HS está cheio. Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 40-50 ul de tampão de lise. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> 4. Isolamento de RNA total a partir de amostras de LCM (Esta secção será apenas descrito na apresentação de vídeo) <ol><li> O RNA total de células é isolado utilizando o Kit de RNAqueous-Micro (Ambion), seguindo os protocolos do fabricante. Todos os reagentes e soluções de lavagem são fornecidos no kit. Pré-molhado o micro filtro conjunto de cartucho por adição de 30 ul de tampão de solução de lise para o filtro. Após 5 minutos, centrifugar o filtro durante 30 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adiciona-se 3 uL de aditivo LCM ao lisado de amostra, pipeta para misturar e centrifugar. </li><li> Adicionar 52 ul de EtOH a 100% (1/2 volume) ao lisado de amostra; pipeta para misturar e transferir o lisado para o filtrocoluna. </li><li> Centrifugar a coluna de filtro a 10.000 × g durante 1 minuto para se ligar ao ARN para a coluna. Se existirem vários tampões para uma amostra, girar cada ligado através da mesma coluna separadamente. </li><li> Completar o processo de isolamento de ARN, tal como descrito no kit de RNAqueous Micro. </li><li> Realizar um tratamento com DNase e DNase inactivação das amostras de LCM de ARN, tal como descrito no kit, transferir os ARN a um tubo de RNase e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Quantificação e aplicações a jusante Avaliação da qualidade do RNA e quantificação é realizada com um Agilent Bioanalyzer utilizando os reagentes do kit de Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguindo o protocolo do fabricante. <ol><li> O RNA total é analisado num Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). O software avalia a concentração e a integridade da amostra de ARN através da atribuição de um número de integridade do RNA (NIR) para cada f amostra variandorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradado e 7-10 indica RNA de boa qualidade. </li><li> Não degradados RNA intactas será usado para o Real-Time PCR; ensaios individuais Taqman ou RT2 matrizes de perfil utilizando Sybr-química verde. O ARN também pode ser utilizado para a análise de mRNA e análise microarray microarray microRNA. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.

Esta técnica LCM nos permitiu fazer avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares de TCE. 8,10,11,12,13 Fomos os primeiros a utilizar esta técnica para demonstrar que as sub-regiões distintas do hipocampo de ratos têm perfis de expressão de genes que correlacionam-se com a sua vulnerabilidade selectiva de lesões. Nossos estudos mostraram que podemos quantificar a expressão de genes, por qPCR, de apenas 10 células de laser capturados e que poderíamos realizar genoma análise de microarranjo de tão poucos como 600 células capturadas. LCM seria uma ferramenta útil em estudos semelhantes de outras regiões do cérebro que se sabe estarem implicados em diversos distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos. Por exemplo, estudos utilizando LCM lançaram luz na patogênese da doença de Parkinson em neurônios dopaminérgicos da substância negra, 14 e ajudado estudos do genoma de perfil de núcleo accumbens, que está envolvida em circuitos de recompensa implicados no substance desordens de abuso. 15 Heterogeneidade neuronal é reflectida ao nível do genoma e 16 podem contribuir para a falta de sucesso dos tratamentos experimentais para o TCE em ensaios clínicos. Assim, o nosso objetivo é utilizar essa técnica para investigar os elementos críticos que influenciam a sobrevivência neuronal após o TCE. O nosso estudo profiling recente do genoma de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo após TBI sugerido que um reostato celular que reflecte a proporção dos níveis de expressão de genes para a sobrevivência das células de morte celular regula o destino da célula após TBI. Estes estudos em curso vai contribuir para a concepção e desenvolvimento de estratégias farmacoterapêuticas que podem influenciar positivamente o reostato sobrevivência celular. Além disso, usamos atualmente LCM para rastrear e monitorar os efeitos de potenciais tratamentos com drogas terapêuticas em neurônios do hipocampo após TCE. Assim, nossos estudos demonstram que dadas cuidadosas técnicas de RNase de manipulação e algunsmodificações dos protocolos existentes, é possível a obtenção de amostras de ARN de alta qualidade a partir de LCM para análise quantitativa de expressão génica precisas. No entanto, existem algumas armadilhas associados a técnicas de LCM. Por exemplo, a recolha de apenas células neuronais sem qualquer contaminação microglia pode ser quase impossível. Na camada de células piramidais do hipocampo foi estimado que 95% das células são neurónios, com 90% desta população de células piramidais ser e interneurônios 10%, deixando uma pequena percentagem de tipos de células da glia e outros. 8,17, 18 Em nossos estudos, utilizamos Fluoro-jade um corante fluorescente que, especificamente, somente etiquetas neurônios lesados ​​no tecido cerebral. Uma mancha diferente que é um marcador para a GFAP seria necessária para corar microglia 19. Recolha apenas as Fluoro-jade coradas individuais corpos neuronais assegura uma população mais homogénea de neurónios. Outro problema comum que pode exigir a resolução de problemas é um círculo que hát definido quando o laser é disparado. Se isto ocorre, é necessário controlar os ajustes do laser e ajustar a potência e duração, conforme necessário. Também é importante para garantir que a tampa é colocada sobre o tecido liso e assentado corretamente no braço. Consultando o manual da LCM técnico ou ligar para o suporte técnico, por vezes, ser necessário. Seguindo LCM e isolamento de ARN, a qualidade do RNA devem sempre ser avaliada utilizando um Bioanalyzer antes de qualquer análise da expressão do gene. Existem vários tipos de instrumentos de captura a laser atualmente no mercado, incluindo o corte a laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) instrumentos. O nosso sistema LCM funciona bem para a captura de pequenos números de células. Outros sistemas de alto rendimento e mais automatizado pode ser mais adequada para a obtenção de um maior número de células para a análise genómica e proteómica particularmente. Na verdade, LCM usando esses sistemas automatizados tem um grande potencial para a análise de protein expressão em células identificadas ou populações enriquecidas de células. 20 Além disso, LCM podem facilitar a análise de expressão de genes de células immunolabeled, 21, permitindo-nos a investigar a expressão de genes em tipos de células definidas independentemente da complexidade nos tecidos mais heterogéneos. Assim, LCM é uma excelente ferramenta para a ponta estudos moleculares de populações simples ou enriquecido de células.

A análise da expressão do gene de tecidos heterogéneos tem sido problemático,. Isto é particularmente verdadeiro no cérebro dos mamíferos, que possui cerca de 5.000 tipos de células diferentes de 4 Antes do desenvolvimento da microdissecação de captura laser (LCM), a técnica, os estudos genômicos dos efeitos da TBI in vivo foram baseadas na análise da expressão de genes de uma população mista de células cerebrais compreendidos, não só de diferentes tipos de células neuronais, mas também de células gliais de apoio e imunomoduladores. Os perfis de expressão resultantes complexos de genes obtidos a partir desses tecidos heterogéneos e os padrões frequentemente contraditórios de lesões induzidas por sinais celulares, pode ser uma explicação para a falha em ensaios clínicos humanos de estratégias terapêuticas mostrado eficaz em estudos pré-clínicos de TBI 5. Para se obter uma compreensão clara da lesão induzida pela expressão do gene em populações vulneráveis ​​de neurónios de rato a partir do quadrilpocampus, foi adotada a técnica de LCM, pela primeira vez por et al Emmert-Buck. 3 Posteriormente, modificado e aperfeiçoado esta técnica de microdissecção para captura eficiente de populações enriquecidas de neurônios e neurônios individuais para perfis mRNA usando quantitativa PCR em tempo real e análise de microarray . Para manter a integridade do mRNA em secções congeladas de tecido cerebral de análise genómica, modificamos protocolos existentes para a fixação, a coloração e captura rápida de neurónios de secções de cérebro de rato congelados. Para identificação e isolamento de feridos e moribundos neurônios do hipocampo, também otimizou a técnica de coloração Fluoro Jade-para LCM. Fluoro-Jade não faz distinção entre a morte celular por apoptose e necrose. Assim, todos os tipos de neurónios em degeneração pode ser detectada por esta mancha 6,7. Aqui, descrevemos o protocolo utilizado em nosso laboratório para obter piscinas de neurônios morrem ou sobrevivem, assim como trechos de enriquecido populatiComplementos de diferentes tipos de células neuronais (ou seja, CA1-CA3 neurônios para análise de expressão gênica após TCE). O procedimento para a lesão de percussão fluido cérebro realizado no nosso laboratório é descrito em detalhe em Shimamura et al., 8 e é muito semelhante ao protocolo de lesão de percussão lateral do fluido, em ratos publicadas em JoVE por Alder et al. 9 Uma vez que a técnica tem LCM mostrado ter um efeito mínimo ou nulo sobre a integridade do DNA, RNA e proteínas nos tecidos, esta é uma excelente ferramenta para a análise molecular da proteína e de tipos de células definidas.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de captura a laser PixCell IIe</td><td>Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td> <td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Acetato Violeta Cresyl</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (Grau histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova (Grau histológico)</td><td>UTMB farmácia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase pontas de pipeta de barreira livre</td><td>Fisher Scientific</td><td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Sistema de microdissecção por captura a laser Arcturus (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection A família PALM </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

laser microdissecção captura de populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

De longo prazo da deficiência cognitiva após TCE está associada com lesão induzida neurodegeneração na região do hipocampo, uma no lobo temporal medial, que é fundamental para a aprendizagem, memória e função executiva. 1,2 Daí nossos estudos se concentrar na análise de expressão gênica de neuronal específica populações em sub-regiões distintas do hipocampo. A técnica de captura de laser microdissecção (LCM), introduzido em 1996 por Emmert-Buck et al., 3 permitiu avanços significativos em análises de expressão de genes de células individuais e as populações de células enriquecidas a partir de tecidos heterogéneos, como o cérebro dos mamíferos que contém milhares de tipos de células funcionais. 4 Usamos LCM e um modelo de rato bem estabelecido de lesão cerebral traumática (TCE) para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese do TCE. Seguindo fluido percussão-TBI, os cérebros são removidos em tempos pré-determinados após a lesão, imediatamente congeladas em gelo seco,e preparados para seccionamento num criostato. Os cérebros de rato pode ser incorporado em OCT e seccionados imediatamente ou armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C, antes de seccionamento por microdissecção captura laser. Adicionalmente, nós utilizamos LCM para estudar os efeitos do TCE sobre os ritmos circadianos. Para isso, vamos capturar os neurônios do núcleo supraquiasmático que contêm o relógio mestre do cérebro de mamíferos. Aqui, demonstramos a utilização de LCM para obter neurónios individuais identificados (lesionado e degeneração, Fluoro-Jade-positivo, ou não lesionado, Fluoro-Jade-negativa) e as populações enriquecidas de neurónios do hipocampo para subsequente análise da expressão do gene por PCR em tempo real e / ou todo genoma microarrays. Estes estudos LCM habilitados têm revelado que a vulnerabilidade selectiva de regiões anatomicamente distintos do hipocampo do rato são reflectidos nos perfis de expressão de genes diferentes de diferentes populações de neurónios obtidos por LCM destas regiões distintas. Os resultados dos nossos estudos de célula única, quandoComparando os perfis de transcrição de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo, sugerindo a existência de um reostato sobrevivência da célula que regula a morte celular e sobrevivência após TBI.

Em nosso estudo LCM primeiro, fomos capazes de mostrar que as sub-regiões funcionalmente distintas (CA1 e CA3) do hipocampo de ratos têm perfis de expressão gênica que refletem a sua vulnerabilidade ao TCE. Figura 8 1A-1C mostra captura a laser de neurônios piramidais do hipocampo (CA1- CA3), os neurônios giro dentado e neurônios SCN antes, e após LCM. Limpas de captura piramidal grânulo, ou neurónios do NSQ, respectivamente, são mostrados nas tampas de macro. Figura 2A-2B ilustra a morrer, Fluoro-Jade positivos neurónios piramidais e sobreviver, Fluoro-Jade negativos neurónios piramidais antes e depois LCM. A captura limpa do morrer ou sobreviver neurônios é mostrado exibindo as células capturadas nas tampas LCM. Depois de LCM, o RNA total pode ser utilizado para uma gama diversificada de estudos moleculares, incluindo a análise quantitativa por PCR em tempo real da expressão génica utilizando TaqMan ou químicas de SYBR Green (Figura 3A), pequeno focused matrizes de PCR com sondas de SYBR Green (Figura 3B) ou de estudos de genomas inteiros de microarranjos (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Laser microdissecção captura de trechos de populações de células definidas a partir do cérebro do rato. Congelados 10 secções coronais uM do cérebro do rato são fixadas em etanol, coradas com um (violeta de cresilo) mancha Nissl e preparados para LCM. São mostradas fotografias de hipocampo de rato e no núcleo supraquiasmático, antes e depois de os neurónios e as células LCM capturados como visualizado nas tampas de macro. A. piramidais de os subcampos CA1-CA3 do hipocampo de rato. Células granulares no giro B. hipocampo denteado. C. Bilateral núcleos supraquiasmáticos localizados em cada lado do terceiro ventrículoe localizada acima do quiasma óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Laser microdissecção captura de neurônios do hipocampo de ratos. Mostrado são A. degenerando, Fluoro-Jade-positivos (com detalhes) CA3 do hipocampo neurônios e B. sobreviventes, Fluoro-Jade-negativo (sem manchas) CA3 neurônios antes e depois da LCM. Células capturados são visualizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Análise de expressão gênica de RNA total isolado de neurônios a laser capturados. A. Dados quantitativos PCR em tempo real de expressão circadiano relógio gene em SCN. B. Heatmap da expressão gênica em morrer e sobreviver neurônios do hipocampo mostrando a expressão de genes relacionados com a apoptose, utilizando matrizes focados PCR . C. Agilent todo o genoma análise de microarray da expressão gênica em hipocampais CA1-CA3 neurônios de ratos que receberam ferimentos farsa, TBI ou TCE, além de um vírus recombinante siRNA adeno-associado projetado para knockdown expressão de genes induzidos por lesão cerebral (óxido nítrico neuronal sintase e glutationa peroxidase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como obter populações enriquecidas de neurônios do hipocampo e neurônios únicos de seções de tecido congelado por microdissecção por captura a laser para posterior análise de expressão gênica. Isso é feito primeiro anestesiando um rato em uma câmara anestésica. O rato é então intubado, ventilado mecanicamente e colocado em um suporte de cabeça estereotáxico para preparar o rato Para lesão cerebral por percussão fluida, uma craniotomia é realizada.O segundo passo é administrar a lesão cerebral por percussão fluida. Em seguida, as seções coronais do cérebro são cortadas em um criostato e coradas com um auxílio fluro, um marcador para neurônios degenerados, ou violeta real, uma mancha de míssil. A etapa final é realizar a micro dissecação de captura a laser e coletar neurônios individuais ou pools de neurônios.Em última análise, o RNA total é isolado das células capturadas, analisado quanto à qualidade e quantificado usando um bioanalisador Agilent e usado em aplicações posteriores, como PCR quantitativo em tempo real e análise de microarray focada em vias ou em todo o genoma. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a microdissecção manual, é que podemos obter populações enriquecidas de neurônios ou outros tipos de células cerebrais, como glia ou células imunomoduladoras, ou neurônios únicos de seções de tecido. Isso nos permite realizar a análise da expressão gênica em distintos tipos de células identificados no cérebro e em outros tecidos heterogêneos compostos por vários tipos de células, demonstrando que este procedimento será perdido.Debbie Boone, pesquisadora associada sênior em nosso laboratório. Primeiro, recupere o tecido cerebral obtido de ratos com percussão fluida, lesão cerebral traumática ou lesão simulada do freezer de 80 graus Celsius negativos e transfira para 22 graus Celsius negativos. Criostato por 10 minutos para levar o cérebro à temperatura de seccionamento enquanto o cérebro está descongelando.Limpe o criostato com zap de RNA contendo etanol e limpe as escovas com etanol. Após os 10 minutos decorridos, remova o cérebro do tubo e coloque-o com o lado ventral para cima em um pedaço de gaze no estágio de criostato, use uma lâmina de barbear nova e corte o cérebro para remover a porção posterior do cérebro. Apenas rostral ao cerebelo e a porção anterior no quiasma óptico.Encha um molde criogênico com meio de montagem OCT e coloque o cérebro no molde com o lado anterior voltado para baixo. Deixe o tecido cerebral congelar no meio de montagem até que fique branco. Isso deve levar aproximadamente 10 minutos.Agora congele o disco de amostra no cérebro com OCT. Em seguida, remova o molde. Insira o disco com o cérebro preso na cabeça da amostra e aperte os parafusos.Insira um baixo perfil descartável lâmina no porta-faca e aperte a alavanca para baixo. Comece a cortar o cérebro a 20 mícrons para remover a camada externa de OCT. Quando a região do hipocampo for alcançada, ajuste o mostrador de mícron para 10.Colete seções seriais coronais colocando uma lâmina de vidro ou vidro positivo. Deslize para a seção de tecido. Coloque as lâminas em um rack de coloração livre de RNAs a menos 20 graus Celsius até que o corte esteja completo.Antes de proceder à coloração das seções, limpe todos os recipientes de coloração e cilindros graduados com ese e enxágue com água mili Q. Certifique-se de que todas as soluções foram preparadas com água livre de RNAs e que a coloração violeta e de flúor jade já passou por um filtro de 0,2 mícron antes. Use seções cerebrais Thor em temperatura ambiente por 30 segundos e fixe em 75% de etanol por um minuto.Em seguida, prossiga para a contracoloração apropriada para LCM de faixas de neurônios ou neurônios individuais para LCM de faixas de neurônios após a fixação, enxágue as lâminas em água livre de RNAs por um minuto de coloração com 1% de crista violeta por um minuto. Enxágüe em água livre de RNAs três vezes por um minuto cada, desidrate com etanol a 95% duas vezes por 30 segundos cada. Em seguida, 100% de etanol duas vezes por 30 segundos e xileno duas vezes por três minutos cada.Após a coloração ao ar, seque todas as seções em uma hotte por 15 minutos e depois prossiga para LCM.Here. LCM é executado. Usando um microscópio de célula P dois E com um laser de diodo infravermelho, primeiro ajuste o joystick central para a posição vertical.Em seguida, gire e trave o objetivo Forex na posição. Coloque uma lâmina com seções de hipocampo coradas no centro do microscópio stage e ajuste manualmente até que a região do hipocampo esteja à vista. Use o curso e encontre ajustes de foco.Para colocar a seção em foco, ative o mandril de vácuo pressionando o botão de vácuo no controlador. Em seguida, gire e trave a objetiva de 10 x no lugar. Concentre-se novamente com o curso e ajustes finos.Carregue as tampas de suas tampas macro LCM nas tampas, seu módulo de, e posicione uma tampa na posição da linha de carga. Gire o braço de colocação da tampa e posicione-o ao redor da tampa. Em seguida, levante o braço de colocação da tampa para remover as tampas do módulo de.Gire o braço de colocação da tampa sobre a corrediça e, em seguida, abaixe-o sobre a corrediça para colocar a tampa na corrediça. Ajuste o foco fino e mova o joystick para verificar se as células estão dentro do círculo preto na tampa. Todas as células a serem capturadas devem estar dentro deste círculo preto.Agora defina os parâmetros do laser. Primeiro pressione o botão de habilitação do laser no controlador. O ponto alvo do laser será visível como rosa.no campo de view no monitor do computador. Defina o tamanho do ponto do laser como pequeno para focar o laser e ajuste a potência e a duração para 65 a 75 miliwatts por um a dois milissegundos, conforme necessário, para uma captura ideal da célula. Para testar o laser, use o joystick para mover o ponto do laser para uma área onde não haja células para captar.Dispare o laser usando o botão de polegar. Em seguida, use o joystick para mover o ponto do laser para longe do ponto de polímero derretido e verifique se há um anel escuro visível ao redor de uma área clara onde o laser foi disparado. Para capturar células, use o joystick para mover o ponto do laser sobre a área das células para capturar e disparar o laser.Usando o botão de polegar, mova o joystick enquanto dispara o laser para capturar uma grande área de células. Depois de disparar todas as células de interesse, levante o braço de colocação da tampa. As células capturadas se separarão da seção de tecido e aderirão à tampa.Sua tampa, o tecido restante e as células ausentes serão visíveis no campo de view. As células da tampa também podem ser visualizadas colocando-a em uma parte vazia do slide. Levante o braço de colocação da tampa e gire-o para a estação de descarga da tampa.Abaixe a tampa na estação e gire o braço de colocação da tampa de volta à posição anterior. Deslize a tampa da ferramenta de inserção ao longo da plataforma e na tampa. Levante a ferramenta com a tampa presa da plataforma.Toque levemente a tampa na parte adesiva de um post-it para limpar o tecido indesejado. Coloque a tampa em um tubo livre de RNAs de 0,5 mililitro preenchido com 100 microlitros de tampão de lise obtido do kit de microisolamento aquoso RN. Imediatamente vórtice a tampa por 30 segundos para mentiras.As células incubam as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos e congelam a menos 80 graus Celsius até o isolamento do RNA. O procedimento de coloração para LCM de neurônios lesionados únicos após a fixação é semelhante ao procedimento para faixas de neurônios. No entanto, alguns tempos de incubação diferem e as seções mantidas com flúor por quatro minutos antes do enxágue e desidratação, consulte a parte de texto do protocolo para obter detalhes após a coloração.Novamente, seque ao ar todas as seções em uma capela por 15 minutos. Antes de prosseguir para o LCM para capturar a carga de células únicas, capture as tampas HS LCM na tampa ou no módulo de, usando o mesmo procedimento da tampa macro LCM. Novamente, defina o tamanho do ponto do laser como pequeno para focar o laser, mas desta vez ajuste a potência e a duração do laser para 65 a 75 miliwatts por 0,45 a 0,5 milissegundos para captura ideal de células individuais.Gire o braço de colocação da tampa sobre a corrediça e abaixe o braço em direção à corrediça. Para colocar a tampa sobre a lâmina, a superfície da tampa de captura HS fica elevada em relação à amostra. Durante o LCM, use o joystick para mover o laser sobre células positivas de auxílio de flúor únicas.Todas as células que estão sendo capturadas devem estar dentro do pequeno anel preto na tampa que dispara o laser usando o botão de polegar. Quando todas as células dentro da área do círculo preto tiverem sido disparadas com o elevador a laser, o braço de colocação da tampa, as células capturadas se separarão da seção de tecido e aderirão à tampa de captura. Agora coloque outra lâmina no microscópio stage e colete células positivas para auxiliar de fluro até que a tampa HS esteja cheia.Em seguida, coloque a tampa em um tubo livre de RNAs de 0,5 mililitro cheio de 40 a 50 microlitros de lise, tampão, vórtice e incubadoras antes de congelar novamente a 80 graus Celsius negativos. Se não for imediatamente, execute o isolamento de RNA de acordo com as instruções na parte de texto do protocolo. As imagens a seguir mostram microdissecção por captura a laser de faixas de populações de células específicas do cérebro de rato congelado em seções coronais de 10 mícrons do cérebro de rato.Foram preparados de acordo com este protocolo e corados com violeta de crista e mancha de míssil. Esta imagem mostra neurônios parametálicos dos subcampos ca um a ca três do hipocampo de ratos. Aqui, células granulares no giro dentado do hipocampo foram capturadas.Finalmente, mostramos faixas de neurônios capturados dos núcleos supra quiasmas bilaterais localizados em ambos os lados do terceiro ventrículo e acima do quiasma óptico. O SCN contém o relógio circadiano mestre que controla os ritmos circadianos em todo o corpo. As imagens a seguir mostram microdissecção de captura a laser de neurônios únicos do hipocampo de ratos.Mostrados aqui estão os hipocampos positivos para flúor degenerados ca três neurônios aqui sobrevivendo fluro ajuda negativa ca três neurônios antes e depois do LCM são mostrados células capturadas são visualizadas na tampa do LCM. As imagens a seguir mostraram análise da expressão gênica do RNA total, isolado de neurônios capturados a laser. Esta imagem mostra dados quantitativos de PCR em tempo real da expressão gênica do relógio circadiano no SCN.Este mapa de calor da expressão gênica em neurônios do hipocampo moribundos e sobreviventes mostra o perfil de expressão de genes relacionados à apoptose usando matrizes de PCR focadas. Finalmente, mostramos um exemplo de um mapa de calor gerado a partir de uma análise de microarray otorrinolaringológico de genoma completo da expressão gênica em ca um a ca três neurônios de ratos que receberam lesão simulada TBI ou TBI mais um vírus siRNA adeno-associado reclinado projetado para derrubar a expressão de óxido nítrico neuronal, sintase ou glutationa peroxidase um, ambos são genes induzidos por lesão cerebral Após seu desenvolvimento. Essas técnicas abriram caminho para cientistas em muitos campos de pesquisa, incluindo lesão cerebral e câncer, que usam modelos animais desses distúrbios para realizar perfis proteômicos e metabólicos genômicos de populações de células específicas.Por exemplo, atualmente estamos usando essas técnicas para capturar a laser populações de células específicas do córtex pré-frontal e das áreas cerebrais do núcleo accumbens que são conhecidas por estarem envolvidas no vício.

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Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou...

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