Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é criar gradientes adesivos e solúveis para estudar a migração celular. Isso é feito pela primeira passivação, uma superfície para evitar a adesão celular inespecífica. O segundo passo é fabricar carimbos a partir da impressão por micro contato.

Em seguida, a superfície é padronizada com linhas ávidas por micro contato. O din amarrado também pode ser impresso como pontos usando litografia de caneta de imersão presa à parte inferior de um dispositivo microfluídico. A superfície modificada atuará como base para um gradiente adesivo de biotina RGD.

A etapa final é carregar as células na superfície com o adesivo na presença de um gradiente de atrativo quimioterápico solúvel. Em última análise, a microscopia de células vivas é usada para mostrar a migração celular em resposta a pistas adesivas e solúveis. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio transwell ou de câmara vazia e uma configuração microfluídica convencional, é que o sistema desintegrado de padrão de superfície O dispositivo microfluídico permite a observação das respostas das células a pistas adesivas controladas espacialmente e gradiente adesivo e um gradiente solúvel ao mesmo tempo.

Bem, este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da migração celular, como a importância da adesão celular e causar acidente vascular cerebral entre os receptores de quimioterapia Texas, como receptores acoplados à proteína G da quinase e receptores de adesão como RIN Para comeu lamínulas de vidro. Primeiro, limpe as lamínulas submergindo-as em um rack em 100% de etanol e colocando o rack em banho-maria de patinação por 30 minutos. Seque as lamínulas de vidro ao ar.

Em seguida, sonicar as lamínulas de cobertura de vidro por 30 minutos em hidróxido de sódio de um molar. Em seguida, enxágue as superfícies de vidro inclinando cuidadosamente a grade em um copo cheio de um litro e meio de água em cubos de mili. Repita o processo de enxágue três vezes usando água fresca em milicubos de cada vez.

Após o terceiro enxágue, seque a tampa de vidro desliza no forno a 60 graus Celsius por cerca de meia hora. Coloque metade das lamínulas de vidro limpas individualmente em uma câmara úmida feita de uma placa de 24 poços, parcialmente cheia de água. Os poços são preenchidos com água e as lamínulas de vidro são colocadas em cima dos poços para a ação, Um copolímero de polilisina e polietilenoglicol é usado no qual 20% das moléculas de peg são enxertadas em biotina.

Abreviado como biotina PLL Peg, coloque 15 microlitros de biotina PLL Peg em PBS em cada lamínula de vidro. Pegue a outra metade das lamínulas de vidro limpas restantes e coloque cuidadosamente a solução de PEG. Deixe as lamínulas por uma hora na câmara úmida.

Após uma hora de deslizamento, a tampa ensanduichada desliza suavemente uma da outra sem raspar a superfície revestida com PEG e enxágue-a com água UE. A água deve deslizar facilmente para o lado tratado com o pino. Se necessário.

Seque ao ar livre as lamínulas de cobertura de vidro em uma toalha de papel com a superfície tratada voltada para cima. A tampa de vidro desliza em um vácuo dessecador até uso posterior. O mestre de silício necessário para este procedimento é fabricado por fotolitografia para lançar o selo A-P-D-M-S para o elastômero PDMS no Mestre de Silício dentro de uma placa de Petri com cerca de um centímetro de altura e curar a mistura mestre e PDMS em um forno a 70 graus Celsius por uma hora.

Posteriormente, o carimbo PDMS é removido do mestre de silício e cortado no tamanho certo para imprimir padrões de proteína usando a técnica de impressão por microcontato primeiro limpo e para tornar os carimbos PDMS mais hidrofílicos, tratando o lado do padrão em um limpador UV e ozônio por uma hora e meia imediatamente após o local de tratamento com ozônio. E espalhe 10 microlitros de adin descascado nos selos PDMS. Se as trilhas forem visíveis sob o microscópio fluorescente, use Aden despojado que é conjugado a um flúor quatro, como avid despojado e LOR três 50.

Deixe por uma hora em uma câmara úmida. Remova o excesso de ruído estreptocócico do carimbo com lenço de papel, papel e ar. Seque o carimbo por aproximadamente um minuto.

Pressione levemente o carimbo na lamínula de vidro revestida com biotina PLL peg. Se o estreptococo din fluorescente foi usado, examine o padrão sob um microscópio de epifluorescência. Os padrões de proteínas também podem ser impressos usando litografia com caneta de imersão.

Primeiro misture uma parte de um miligrama por mililitro, decapagem ou avidan elif Fluor três 50 com 10 partes de glicerol e carregue cinco microlitros da mistura no cantilever. Ajuste a velocidade de impressão. Tempo de contato do cantilever na superfície ou uma distância vertical do cantilever à superfície para reduzir o tamanho do ponto.

Aproximadamente cinco micrômetros iniciam o processo de impressão conforme descrito no manual de operação da loja de instrumentos de litografia com caneta de imersão. Todas as superfícies impressas em um dessecado. Um dispositivo microfluídico disponível comercialmente é usado para criar gradientes de superfície.

Cole estas guias de cobertura de vidro revestidas ou estampadas com tritina no lado adesivo do dispositivo para garantir que não haja vazamento por várias horas. Sele as bordas do dispositivo com a fina camada de vaselina aquecida e com uma segunda camada de uma mistura de uma parte de vaselina para uma parte de cera de parafina. Preencha o canal do dispositivo com seis microlitros de PBS para criar dois gradientes opostos.

Encha os dois reservatórios, um com 70 microlitros de biotina, quatro fluoresceína e outro com 70 microlitros de biotina conjugada ao peptídeo biotinilado, arginina, glicina, ácido espártico ou RGD, incube as amostras em temperatura ambiente no escuro por uma hora. Enxaguar a biotina, RGD e biotina do dispositivo microfluídico é o aspecto mais difícil deste procedimento, pois existe o risco de prender bolhas de ar e perturbar as trilhas impressas de microcontato. Para garantir o sucesso, a biotina e o PBS devem ser removidos com cuidado e lentamente.

Remova as soluções de biotina e enxágue cuidadosamente a superfície duas vezes com PBS enquanto ainda estiver conectado ao dispositivo microfluídico. Marque a direção do gradiente adesivo antes de carregar as células marcadas com fluorescência no dispositivo microfluídico. Conte as células e divida-as em dois tubos de números de células iguais.

Lave e resus. Suspenda um tubo de células com meios contendo o atrativo de quimioterapia, como DMEM com baixo teor de glicose com lavagem de 10% de FBS e o outro tubo de células no meio. Sem o atrativo quimioterápico, como o DMEM com 0% de FBS, a concentração final de células em cada tubo deve ser cinco vezes 10 das quintas células por mililitro.

Remova todas as soluções do dispositivo microfluídico e coloque-o no microscópio pré-aquecido. Stage carregue 70 microlitros de células ressuspensas em 0%F-B-S-D-M-E-M em um reservatório. Carregue 70 microlitros de células ressuspensas em 10%F-B-S-D-M-E-M em outro reservatório.

Fita frouxamente colocada sobre os reservatórios para evitar a evaporação. Certifique-se de que o canal do dispositivo microfluídico esteja no campo de view e as células estão em foco. Selecione os parâmetros de aquisição de imagem, como tempos de exposição e filtros fluorescentes.

A sequência de imagens de campo claro e fluorescência que as células e rastreiam, bem como os pontos de tempo e a duração da gravação, iniciam o programa de aquisição de imagens. Este vídeo demonstra um método para imagens de células vivas de células que migram em um ambiente com gradientes adesivos e solúveis concorrentes. As faixas adesivas que contêm strippin fluorescente e RGD biotinilado foram criadas com impressão de micro contato ou litografia com caneta de imersão.

A impressão de microcontato bem-sucedida é indicada pelo perfil de linha da intensidade de fluorescência nas trilhas, onde as trilhas adesivas e as regiões anti-incrustantes podem ser claramente distinguidas. Os pontos impressos com litografia de caneta de imersão parecem arredondados, não em forma de lágrima, indicando um processo de impressão bem-sucedido. Neste exemplo, os pontos foram impressos em uma linha com separação de linha e coluna definida para 10 a 15 micrômetros.

Essa distância é suficiente para evitar que os pontos se fundam, mas permite a visualização de vários pontos em um único campo de visão. Com a maioria das configurações do microscópio, um Grady de pistas adesivas na trilha impressa foi criado com o dispositivo microfluídico simples. Ao carregar biotina quatro fluoresceína e biotina RGD nos lados opostos de um painel de câmara microfluídica.

Um show de 60 imagens em mosaico tiradas com um comprimento total de imagem de 3072 micrômetros. No painel B, a intensidade da fluorescência foi medida em todo o comprimento de todo o mosaico. Linhas de tendência lineares foram ajustadas à intensidade de fluorescência para indicar o gradiente RGD no canal.

Após a remoção da biotina, solução de biotina RGD, a mesma câmara pode ser usada para introduzir um gradiente solúvel. O painel A mostra a intensidade fluorescente do corante fluoresceína perto dos reservatórios preenchidos com PBS e fluoresceína e através do canal em T é igual a zero. O painel B mostra a intensidade fluorescente dos sinais solúveis.

Após uma incubação de 16 horas, os resultados comparáveis indicam que o gradiente permaneceu estável por pelo menos 16 horas. He, uma migração celular em uma câmara microfluídica com gradientes opostos foi observada usando este método e um filme representativo é mostrado aqui. O gradiente adesivo foi RGD imobilizado em trilhas de estreptococos avidanas e o gradiente solúvel foi de zero a 10%FBS.

As imagens foram tiradas a cada 15 minutos por um total de 20 horas. A transição de imagem mostrada é de oito quadros por segundo. Este segundo filme é de uma única célula heli migrando para a fonte FBS.

A transição de imagem mostrada é de oito quadros por segundo. A linha azul que representa a trajetória da célula foi obtida por meio de um software de rastreamento celular. Este último gráfico mostra as trajetórias das células a partir das imagens do primeiro filme.

As trajetórias das células que migraram para a maior concentração de FPS solúvel são mostradas nas trajetórias dos glóbulos vermelhos que migraram para concentrações mais altas de RGD aderente são mostradas em preto. Essas trajetórias mostraram que mais células hela migraram para a fonte do atrativo quimioterápico do que para concentrações mais altas de RGD aderente. Embora seja importante tentar este procedimento para evitar a evaporação de PBS ou mídia no dispositivo microfluídico durante a preparação do gradiente adesivo e a imagem do estilo de vida, use fita adesiva, se necessário, para cobrir todas as entradas do dispositivo microfluídico Após este procedimento.

Outros métodos, como transfecção e microscopia de solução híbrida, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a biomecânica do citoesqueleto atuando por proteína, proteínas de adesão focal e receptores durante a migração celular.