Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é criar gradientes adesivos e solúveis para estudar a migração celular. Isso é conseguido primeiro passivando uma superfície para prevenir adesão celular inespecífica. O segundo passo é fabricar carimbos a partir da impressão por microcontato.

Em seguida, a superfície modificada é padronizada com linhas de estreptavidina por impressão de microcontato. A estreptavidina também pode ser impressa em forma de pontos utilizando litografia com caneta de mergulho acoplada à parte inferior de um dispositivo microfluídico. A superfície modificada atuará como base para um gradiente adesivo de biotina RGD.

O passo final consiste em carregar células na superfície com o sinal adesivo na presença de um gradiente solúvel de quimioatraente. Em última análise, utiliza-se microscopia de células vivas para demonstrar a migração celular em resposta a sinais adesivos e solúveis. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como o ensaio de transwell ou câmara vazia e configurações microfluídicas convencionais, é que o sistema desintegrado de dispositivos microfluídicos com padrões de superfície permite a observação simultânea das respostas celulares a sinais adesivos espacialmente controlados, a gradientes adesivos e a gradientes solúveis.

Bem, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da migração celular, como a importância da adesão celular e a causa do acidente vascular cerebral entre receptores quimiotáticos, tais como receptores tirosina quinase, receptores acoplados à proteína G e receptores de adesão como RIN. Para começar, limpe as lamínulas de vidro imersas em uma gradinha com etanol a 100% e coloque a gradinha em um banho de ultrassom por 30 minutos. Em seguida, seque as lamínulas de vidro ao ar.

Em seguida, sonique os lamínulas de vidro por 30 minutos em hidróxido de sódio molar. Depois, enxágue as superfícies de vidro inclinando cuidadosamente a grade em um béquer contendo um litro e meio de água milli cube. Repita o processo de enxágue três vezes, utilizando água milli cube fresca a cada vez.

Após a terceira lavagem, seque as lamínulas de vidro em estufa a 60 graus Celsius por cerca de meia hora. Coloque metade das lamínulas de vidro limpas individualmente em uma câmara úmida feita a partir de uma placa de 24 poços, parcialmente preenchida com água. Os poços são preenchidos com água e as lamínulas de vidro são colocadas sobre os poços para a reação. Utiliza-se um copolímero de polilisina e polietilenoglicol no qual 20% das moléculas de PEG são ligadas à biotina.

Abreviado como PLL Peg biotina, coloque 15 microlitros de PLL Peg biotina em PBS sobre cada lamínula de vidro. Pegue a outra metade das lamínulas de vidro limpas restantes e cuidadosamente faça uma montagem em sanduíche com a solução de PEG. Deixe as lamínulas por uma hora na câmara úmida.

Após uma hora, o lâmina desliza suavemente, separando-se sem raspar a superfície revestida com PEG, e enxágue-as com água UE. A água deve escorrer facilmente no lado tratado com PEG. Se necessário.

Seque as lamínulas de vidro ao ar sobre uma toalha de papel com a superfície tratada voltada para cima. Armazene as lamínulas de vidro em um dessecador a vácuo até uso posterior. O molde de silício necessário para este procedimento é fabricado por fotolitografia para moldar o carimbo de PDMS sobre o molde de silício dentro de uma placa de Petri até uma altura de aproximadamente um centímetro e cure a mistura do molde e PDMS em estufa a 70 graus Celsius por uma hora.

Posteriormente, o carimbo de PDMS é removido do molde de silício e cortado no tamanho adequado para imprimir padrões proteicos utilizando a técnica de microimpressão por contato. Primeiro, limpe e torne os carimbos de PDMS mais hidrofílicos, tratando o lado com padrão em um limpador de UV e ozônio por uma hora e meia. Imediatamente após o tratamento com ozônio, aplique e espalhe 10 microlitros de avidina destreptavidina sobre os carimbos de PDMS. Se as trilhas devem ser visíveis sob o microscópio fluorescente, utilize avidina destreptavidina conjugada a um fluoróforo, como avidina destreptavidina marcada com Alexa Fluor 350.

Deixe por uma hora em uma câmara úmida. Remova o excesso de strep din do carimbo com papel-toalha e ar. Seque o carimbo por aproximadamente um minuto.

Pressione suavemente o carimbo sobre a lamínula de vidro revestida com biotina de estreptoavidina PLL. Se foi utilizada estreptavidina fluorescente, examine o padrão sob um microscópio de fluorescência epifluorescente. Padrões de proteínas também podem ser impressos utilizando litografia por caneta de molhabilidade (dip pen lithography).

Primeiro, misture uma parte de um miligrama por mililitro de streptavidina marcada com Fluor 350 com 10 partes de glicerol e aplique cinco microlitros da mistura sobre a ponteira. Ajuste a velocidade de impressão. Tempo de contato da ponteira com a superfície ou uma distância vertical da ponteira em relação à superfície para reduzir o tamanho do ponto.

Cerca de cinco micrômetros iniciam o processo de impressão conforme descrito no manual de operação do armazenamento do instrumento de litografia por dip pen. Todas as superfícies impressas em um dessecador. Um dispositivo microfluídico comercialmente disponível é utilizado para criar gradientes de superfície.

Cole estas lamínulas de vidro revestidas ou padronizadas com tritin no lado adesivo do dispositivo para garantir que não haja vazamento por várias horas. Selle as bordas do dispositivo com uma camada fina de vaselina aquecida e com uma segunda camada de uma mistura de uma parte de vaselina para uma parte de cera de parafina. Encha o canal do dispositivo com seis microlitros de PBS para criar dois gradientes opostos.

Encha os dois reservatórios, um com 70 microlitros de biotina, quatro fluoresceína e o outro com 70 microlitros de biotina conjugada ao peptídeo biotinilado arginina glicina ácido aspártico ou RGD, e incube as amostras à temperatura ambiente, no escuro, por uma hora. A etapa de lavagem da biotina, RGD e biotina fitsy do dispositivo microfluídico é o aspecto mais difícil deste procedimento, pois há o risco de aprisionar bolhas de ar e perturbar as trilhas microcontactadas. Para garantir o sucesso, a biotina e o PBS devem ser removidos cuidadosa e lentamente.

Remova as soluções de biotina e enxágue cuidadosamente a superfície duas vezes com PBS enquanto ainda estiver acoplada ao dispositivo microfluídico. Marque a direção do gradiente adesivo antes de carregar as células marcadas fluorescentemente no dispositivo microfluídico. Conte as células e divida-as em dois tubos com números iguais de células.

Lave e reconstitua. Suspenda um tubo de células em meio contendo o quimioatraente, como DMEM com baixo teor de glicose e 10% de FBS, e o outro tubo de células em meio sem quimioatraente, como DMEM com 0% de FBS. A concentração final de células em cada tubo deve ser cinco vezes 10 à quinta células por mililitro.

Remova todas as soluções do dispositivo microfluídico e coloque-o no microscópio pré-aquecido. Adicione 70 microlitros de células re-suspensas em D-M-E-M com 0% de F-B-S a um reservatório. Adicione 70 microlitros de células re-suspensas em D-M-E-M com 10% de F-B-S a outro reservatório.

Fita colocada solta sobre os reservatórios para evitar evaporação. Certifique-se de que o canal do dispositivo microfluídico esteja no campo de visão e de que as células estejam em foco. Selecione os parâmetros de aquisição de imagem, como tempos de exposição e filtros fluorescentes.

Sequência de imagens em campo claro e fluorescência que mostra células e trilhas, bem como pontos temporais e início do tempo de gravação no programa de aquisição de imagens. Este vídeo demonstra um método para imagem de células vivas que migram em um ambiente com gradientes adesivos e solúveis concorrentes. Trilhas adesivas que contêm estreptavidina fluorescente e RGD biotinilado foram criadas por microimpressão de contato ou litografia por ponta úmida.

A impressão por microcontato bem-sucedida é indicada pelo perfil linear da intensidade de fluorescência ao longo das trilhas, onde as trilhas adesivas e as regiões antifouling podem ser claramente distinguidas. Os pontos impressos por litografia com caneta de mergulho apresentam-se arredondados, não em formato de lágrima, indicando um processo de impressão bem-sucedido. Neste exemplo, os pontos foram impressos em linha com separação entre linhas e colunas ajustada entre 10 e 15 micrômetros.

Essa distância é suficiente para impedir que os pontos se fundam uns aos outros, mas permite a visualização de múltiplos pontos em um único campo de visão. Com a maioria das configurações de microscópio, um gradiente de sinais adesivos na trilha impressa foi criado com o dispositivo de microfluídica simples. Ao carregar biotina com quatro fluoresceínas e biotina RGD nos lados opostos de um painel de câmara microfluídica.

A mostra 60 imagens em mosaico obtidas com um comprimento total de imagem de 3072 micrômetros. No painel B, a intensidade da fluorescência foi medida ao longo do comprimento de todo o mosaico. Linhas de tendência lineares foram ajustadas à intensidade da fluorescência para indicar o gradiente de RGD no canal.

Após a remoção da solução de biotina e biotina RGD, a mesma câmara pode ser utilizada para introduzir um gradiente solúvel. O painel A mostra a intensidade fluorescente do corante fluoresceína próximo aos reservatórios preenchidos com PBS e fluoresceína e ao longo do canal em T igual a zero. O painel B mostra a intensidade fluorescente das pistas solúveis.

Após uma incubação de 16 horas, os resultados comparáveis indicam que o gradiente foi estável por pelo menos 16 horas. Aqui, uma migração celular em uma câmara microfluídica com gradientes opostos foi observada utilizando este método, e um filme representativo é mostrado. O gradiente adesivo foi imobilizado com RGD em trilhas de estreptavidina e o gradiente solúvel variou de zero a 10% de soro bovino fetal (FBS).

As imagens foram capturadas a cada 15 minutos durante um total de 20 horas. A transição de imagens apresentada corresponde a oito quadros por segundo. Este segundo vídeo mostra uma única célula heli migrando em direção à fonte de FBS.

A transição da imagem mostrada é de oito quadros por segundo. A linha azul que representa a trajetória da célula foi obtida por meio de um software de rastreamento celular. Este último gráfico mostra as trajetórias das células provenientes das imagens do primeiro filme.

As trajetórias celulares que migraram em direção à maior concentração de FPS solúvel são mostradas em vermelho, e as trajetórias celulares que migraram em direção a concentrações mais elevadas de RGD aderente são mostradas em preto. Essas trajetórias demonstraram que mais células HeLa migraram em direção à fonte do quimioatraente do que em direção a concentrações mais elevadas de RGD aderente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar a evaporação de PBS ou meio no dispositivo microfluídico durante a preparação do gradiente adesivo e a imagem em tempo real; utilize fita adesiva, se necessário, para cobrir todas as entradas do dispositivo microfluídico após este procedimento.

Outros métodos, como transfeção e microscopia de solução híbrida, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a biomecânica do citoesqueleto mediada por proteínas, proteínas de adesão focal e receptores durante a migração celular.