Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

O objetivo geral deste procedimento é registrar atividades elétricas de neurônios em uma preparação de cérebro de peixe intacto. Isso é realizado primeiramente anestesiando um peixe transgênico meca de quatro a seis meses de idade em MS 2 22 e, em seguida, dissecando seu cérebro. Em seguida, um dos neurônios de interesse marcados com GFP é contatado com um eletrodo de registro e suas atividades elétricas são registradas por meio de eletrofisiologia com grampo de patch solto ou grampo de patch de célula inteira.

No fim, os resultados podem mostrar alterações na frequência de disparo de potenciais de ação ou mudanças no potencial de membrana em resposta a diferentes tratamentos no cérebro intacto. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a eletrofisiologia de células em cultura ou preparações de fatias cerebrais, é que podemos caracterizar as propriedades elétricas dos neurônios em uma preparação de cérebro inteiro com circuitos neurais intactos. Embora esta técnica forneça insights sobre a neuroendocrinologia reprodutiva, ela também pode ser aplicada a outros sistemas neurais utilizando peixes transgênicos, como no estudo de neurônios que controlam motivação e comportamentos afetivos.

Esta demonstração utiliza peixes meca transgênicos nos quais os neurônios de GnRH três são geneticamente marcados com GFP. Para começar, anestesie um adulto maka imergindo-o em cinco mililitros de MS 222. Alguns minutos após as movimentações branquiais cessarem, transfira-o para uma placa de Petri de 60 milímetros com solução salina para peixes. Agora, use uma tesoura para decapitar o peixe na extremidade cefálica do alum.

Transfira a cabeça para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro, preenchida pela metade com solução salina para peixes e forrada com yl guard. O recipiente deve ter uma depressão central na qual se posiciona e fixa a cabeça com pinos para insetos, com o lado dorsal voltado para cima, utilizando tesoura fina. Corte cuidadosamente a parte dorsal do crânio ao longo de seu perímetro.

Em seguida, remova cuidadosamente o crânio com pinça, expondo a parte dorsal do cérebro, incluindo a parte anterior da medula espinhal. Agora, levante suavemente a medula espinhal com pinça de ponta fina e, então, corte os nervos conectivos bilaterais usando tesoura de ponta fina. Isso inclui o corte dos nervos cranianos, nervos espinhais, nervos ópticos do lado ventral e nervos olfativos anteriores.

Coloque o cérebro totalmente dissecado em um novo recipiente de Petri contendo solução salina fresca para peixes sob um microscópio. Verifique cuidadosamente se o cérebro inteiro e a glândula pituitária estão intactos e não estão cortados ou perfurados. Descarte quaisquer cérebros danificados e recomece utilizando uma agulha.

Coloque uma pequena gota de cola de ação rápida, como cianoacrilato, no centro da câmara de gravação. Espalhe a gota de cola por um centímetro quadrado. Em seguida, transfira rapidamente o cérebro para a cola.

Fixe-o com a face ventral voltada para cima. Agora, preencha a câmara de registro com cerca de um mililitro de solução salina para peixes, cobrindo o cérebro. Usando pinças de ponta fina, remova cuidadosamente as meninges da superfície da área de registro do cérebro, avançando progressivamente.

Perfunda continuamente o cérebro com solução salina para peixes aerada a uma taxa de pelo menos 200 microlitros por minuto. Prepare de seis a dez microeletrodos de vidro de seis a dez megaohms e preencha-os até cerca da metade com solução de gravação em configuração de patch solta. Utilizando um microscópio fluorescente ereto com câmera CCD refrigerada, localize os neurônios GFP-positivos do nervo terminal gn RH três, iniciando com a objetiva de 10x.

Em seguida, mude para a objetiva de 40 x e localize os neurônios na superfície ventral dos bulbos olfativos ou próximo a ela, logo à frente do cefalão. Agora, mude para um monitor de vídeo que fornece imagens em tempo real do microscópio. O agrupamento de neurônios contém de oito a dez neurônios GnRH.

Posicione o microeletrodo na câmara de gravação com a ponta do eletrodo acima do neurônio-alvo. Aplique uma pressão positiva constante e leve para que o microeletrodo não entupa. Aproxime-se suavemente do neurônio-alvo com a ponta do eletrodo, verificando e monitorando a resistência do eletrodo com o software Axo graft.

Usando o teste de selamento no modo de fixação de voltagem, quando a ponta do eletrodo está sobre a superfície do neurônio, a resistência do eletrodo muda ligeiramente neste ponto. Libere a pressão positiva para formar um selamento de baixa resistência, aplicando, se necessário, uma leve pressão negativa. O passo mais crítico para uma boa gravação é selecionar um neurônio limpo, o que pode ajudá-lo a obter um selamento ideal entre o eletrodo e a mesma membrana.

Agora mude para o modo de fixação de corrente. Abra o Chart, um programa da PowerLab, e comece a gravar continuamente a voltagem da membrana sem qualquer entrada de corrente; ajuste a escala de voltagem e a taxa de gravação, se necessário. Grave a atividade elétrica de base em solução salina normal para peixes por cerca de cinco minutos antes de aplicar qualquer tratamento. A perfusão por banho de fármacos, hormônios, peptídeos, etc., deve ser adicionada à preparação cerebral, fluindo a 200 microlitros por minuto.

Em seguida, utilize solução salina normal para peixes para um período de lavagem após localizar uma célula; verifique e monitore a resistência do eletrodo no modo de fixação de voltagem. Quando a ponta do eletrodo estiver sobre a superfície do neurônio e a resistência do eletrodo mudar ligeiramente, libere a pressão positiva e aplique uma pequena pressão negativa para formar um selo de alta resistência sobre o neurônio.

Aplique sucção suave com a boca. Rupture a membrana celular do patch. A resistência cairá instantaneamente para cerca de 120 a 250 megaohms quando a membrana se romper.

Agora mude para o modo de fixação de corrente e registre continuamente a voltagem da membrana usando o gráfico, sem qualquer entrada de corrente. Novamente, ajuste a escala de voltagem e a taxa de registro conforme necessário. Após realizar um registro de linha de base da atividade elétrica em solução salina normal para peixes por cerca de cinco minutos, aplique os tratamentos seguidos por um período de lavagem. As atividades elétricas espontâneas dos neurônios GNRH três do terminal nervoso moca foram registradas no modo de fixação de corrente.

A taxa típica de disparo é de 0,5 a seis hertz. Os potenciais geralmente disparam em um padrão tônico ou rítmico com um intervalo entre picos bastante regular, e o potencial da membrana entre picos tem uma média de cerca de menos 48 milivolts. Essa abordagem experimental também é bem-sucedida no registro de neurônios GNRH marcados com GFP localizados no prosencéfalo de adultos transgênicos.

Atividade elétrica de neurônios de peixe-zebra no cérebro intacto excisado de transgênicos. O peixe-zebra foi registrado de maneira semelhante à descrita para um DACA por meio de patch solto. As mesmas técnicas também permitiram a gravação de célula inteira.

Diferentemente dos neurônios de GnRH do nervo terminal meca, o padrão de atividade espontânea, disparo de potenciais de ação dos neurônios de GnRH do peixe-zebra na área pré-optica, cefalão ventral e hipotálamo é frequentemente irregular. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora para uma gravação de 15 minutos, se realizada corretamente. Boa sorte.