Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal
18 de março de 2013
Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.
O objetivo geral deste procedimento é alcançar a expressão gênica espacialmente restrita na medula espinhal de camundongos, injetando estereotaticamente um vetor viral no corno dorsal lombar. O primeiro passo do procedimento é localizar e expor a vértebra lombar. O segundo passo é remover a porção dorsal da vértebra para revelar a medula espinhal.
Um procedimento denominado laminectomia. Em seguida, uma pipeta de vidro conectada a uma bomba de microseringa é posicionada sobre o corno dorsal e abaixada na medula espinhal. A etapa final é injetar lentamente a suspensão vetorial.
Duas semanas depois, a transfecção dos neurônios do corno dorsal é demonstrada pela expressão da proteína fluorescente verde, que permite rastrear a distribuição do vírus. Este método ajuda a elucidar a função dos neurônios em algumas das vias sensoriais. Nós o usamos em estudos que se concentram especificamente no desenvolvimento de dor inflamatória ou neuropática.
A demonstração visual é fundamental para aprender a posicionar o mouse no quadro estereotáxico. É essencial para o sucesso do procedimento que a coluna seja fixada adequadamente, pois a laminectomia é uma técnica muito delicada. Martin Mole, um estudante de pós-graduação do meu laboratório, demonstrará o procedimento.
John Wang, um assistente de pesquisa, o ajudará um ou dois dias antes do procedimento. Pul glass pipetas para obter um diâmetro de ponta de 40 micrômetros e chanfrar a ponta em um ângulo de 20 graus no dia da cirurgia. Comece o procedimento desinfetando o equipamento cirúrgico e preparando as ferramentas cirúrgicas estéreis para configurar a estrutura estereotáxica.
Monte o injetor de microseringa no manipulador e conecte o dispositivo. Encaixe uma das pipetas de vidro na microseringa usando o encaixe de compressão. Agora remova o êmbolo da micro seringa.
Encha a seringa com o óleo mineral, reinsira o êmbolo e empurre-o até a ponta. Evite criar bolhas de ar. Em seguida, insira a micro seringa no suporte do injetor.
Em seguida, remova o vírus do freezer e prepare a suspensão de partículas do vírus antes de usar, diluindo-a com solução salina tamponada com fosfato estéril até a concentração de partículas desejada. Pipete cinco microlitros da suspensão do vírus em um pequeno pedaço de param. Em seguida, abaixe a ponta da pipeta de vidro na gota e puxe o êmbolo para encher a microseringa.
No final. Crie uma pequena bolha de ar na ponta da pipeta para evitar que ela entupa. Nesta etapa, prepare a área de cirurgia limpando a bancada na almofada de aquecimento com desinfetante.
Em seguida, anestesiar o mouse por inalação de flúor. Em seguida, aplique lubrificante em cada olho para protegê-los da secagem durante a operação Depois, raspe o pelo da parte inferior das costas até o pescoço do mouse. Desinfete a pele com lenços alternados de um anti-séptico tópico, como clorexidina ou iodopovidona, e etanol a 70%.
Em seguida, infiltrar o local da incisão com bupivacaína 0,25% diluída de um a 10 com soro fisiológico. Posteriormente, incisou a pele na extremidade do mimo da caixa torácica, dois a três centímetros ao longo da linha média e separe a fáscia que cobre a coluna. Identifique a vértebra L um, que está localizada aninhada na vértebra, segurando o último par de costelas e exponha-a removendo os pequenos músculos e ligamentos da coluna vertebral presos à sua superfície dorsal.
Em seguida, levante e segure levemente a vértebra L um com um par de adições e pinças. Em seguida, use uma pinça de laminectomia dedicada para remover a porção dorsal da vértebra, incluindo o processo espinhoso e a lâmina para expor a medula espinhal. Evite danificar a dura-máter ou a medula espinhal durante este procedimento.
Em seguida, transfira o mouse para uma placa de aquecimento na estrutura estereotáxica e monitore a temperatura do mouse durante a operação subsequente. Agora use os picos de entalhe em V para estabilizar a coluna para que a vértebra não se mova durante a respiração. Em seguida, aproxime a microseringa para que a ponta da pipeta fique acima do local da laminectomia.
Abaixe o êmbolo até ver a suspensão do vírus saindo da pipeta. Remova a gota com gaze estéril. Em seguida, posicione a ponta da pipeta na porção mais rostral da medula espinhal exposta.
Centralize a pipeta acima do sulco mediano posterior e mova a ponta 500 micrômetros lateralmente. Depois disso, abaixe a ponta até a superfície do cordão e perfure a dura-máter. Em seguida, abaixe a ponta do copo e pipete 300 micrômetros na medula espinhal.
Injete um microlitro de suspensão de vírus a uma taxa de 200 nanolitros por minuto. No final da injeção, aguarde pelo menos dois minutos antes de retrair lentamente a pipeta. Repita o procedimento de injeção na porção mais mimada da medula espinhal exposta para obter a distribuição completa do vetor viral no segmento espinhal L quatro.
Os dois locais de injeção estão localizados rostral e mimados no segmento L quatro. Para evitar danos aos tecidos na região alvo após a liberação da injeção, a vértebra L um do entalhe em V prende e remove o mouse da estrutura estereotáxica. Em seguida, suture a fáscia com cinco oh Vicryl.
A fáscia fechada fornece cobertura para o local da laminectomia. Em seguida, feche a pele com suturas de náilon ou grampos cirúrgicos. Forneça analgesia pós-cirúrgica por 72 horas com injeções subcutâneas diárias de carprofeno a cinco miligramas por quilograma.
Transfira o mouse para uma gaiola de recuperação com roupa de cama macia e não específica. Coloque o mouse de lado para uma respiração confortável. Em seguida, monitore o animal até que ele esteja totalmente alerta.
Ambulância e começa a beber. Monitore a recuperação pós-cirúrgica por inspeção diária nos primeiros três dias. Então, a cada dois dias ou três dias por semana até que o experimento seja concluído.
Sete a 10 dias após a operação, quando a cicatrização da ferida estiver completa. Remova as suturas ou grampos da pele. Esta figura mostra a expressão da proteína repórter fluorescente verde aumentada ou EGFP no corno dorsal esquerdo da medula espinhal L quatro.
Duas semanas após a injeção estereotáxica de neurônios R-A-A-V-E-G-F-P foram imunocorados para núcleos neuronais Proteína mostrada em vermelho Arrowhead. Aponte para células gliais transfectadas espalhadas na coluna dorsal. Aproximadamente 80% dos neurônios no corno dorsal medial foram infectados com a prática.
O procedimento pode ser concluído em 30 a 40 minutos e lembre-se de manter condições estéreis durante o procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar injeções quimais intra pinho na dose ho da medula espinhal do camundongo. Estamos usando a técnica para manipulação de genes, mas você pode adaptá-la para outros fins, como aplicação de drogas intraespinhais.
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Visão Geral
Este estudo demonstra um método para obter expressão gênica espacialmente restrita na medula espinhal de camundongos por meio da injeção estereotáxica de um vetor viral no corno dorsal lombar. Esta técnica permite a manipulação gênica direcionada, particularmente em áreas de contato sináptico entre aferentes somatossensoriais primários e neurônios do sistema nervoso central.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Terapia Genética
- Pesquisa na Medula Espinhal
Antecedentes
- Vetores virais são utilizados para manipulação gênica.
- O corno dorsal lombar é um local significativo para interações sinápticas.
- A expressão gênica condicional pode auxiliar na compreensão dos mecanismos neurais.
- A injeção estereotáxica é um método preciso para direcionar regiões cerebrais específicas.
Objetivo do Estudo
- Para alcançar expressão gênica direcionada na medula espinhal.
- Para explorar os efeitos da manipulação gênica na função da medula espinhal.
- Para fornecer uma estrutura metodológica para pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Localizar e expor a vértebra lombar.
- Realizar laminectomia para acessar a medula espinhal.
- Utilizar uma pipeta de vidro conectada a uma bomba microssegunda.
- Injetar a suspensão do vetor viral na substância cinzenta dorsal.
Resultados Principais
- Injeção bem-sucedida do vetor viral no corno dorsal lombar.
- Expressão gênica condicional observada em neurônios-alvo.
- O método demonstrou eficácia para manipulação restrita espacialmente.
- Aplicações potenciais no estudo de distúrbios relacionados à medula espinhal.
Conclusões
- O método permite manipulação gênica precisa na medula espinhal.
- Pode ser utilizado para investigar o papel de genes específicos na função neural.
- Essa abordagem pode aprimorar nossa compreensão da fisiologia da medula espinhal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A administração estereotáxica de vetores virais permite manipulação gênica precisa e restrita espacialmente na lâmina dorsal da medula espinhal de camundongos, uma região fundamental para o processamento sensorial e pesquisas sobre vias da dor. Essa abordagem auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na descoberta em neurociência, possibilitando a expressão ou silenciamento gênico condicional em populações neuronais definidas. O método fornece uma plataforma reprodutível para associar alvos genéticos a fenótipos funcionais em modelos pré-clínicos de dor, orientando decisões de avanço ou interrupção na seleção de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao permitir a expressão gênica condicional em populações específicas de neurônios da medula espinhal.
- Valor Operacional: Oferece uma abordagem cirúrgica padronizada para direcionamento consistente ao corno dorsal lombar entre estudos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem fenotípica da função gênica em vias da dor, auxiliando na avaliação da confiança do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera métricas quantificáveis de transfeção (por exemplo, expressão de EGFP) para avaliar a eficiência de entrega do vetor e a especificidade celular.
- Valor Operacional: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para triagem de compostos ou moduladores subsequentes em modelos de dor.
- Escalabilidade: O procedimento breve (30–40 minutos) e a recuperação rápida dos animais favorecem um maior rendimento em fluxos de trabalho de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela diretamente os mecanismos da dor inflamatória e neuropática, alinhando-se às prioridades da área terapêutica.
- Continuidade Tradutiva: Relaciona a modulação do alvo na medula espinhal com fenótipos comportamentais da dor, apoiando a validação pré-clínica.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a redução de riscos mecanicistas ao isolar efeitos específicos de genes em um circuito relevante para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, particularmente para alvos do sistema nervoso central envolvidos no processamento sensorial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a manipulação gênica espacialmente restrita em regiões definidas da medula espinhal.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas (por exemplo, intensidade de fluorescência, taxas de transfeção específicas por célula) para avaliação do desempenho do vetor e do efeito biológico.
- Análises: Permite a correlação entre eficiência de transfeção e resultados funcionais, auxiliando avaliações de resposta à dose e engajamento do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação gênica na medula espinhal a fenótipos relacionados à dor, apoiando estudos pré-clínicos alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma cirúrgica reutilizável, adaptável a diversos vetores virais, promotores ou transgenes em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir efeitos fora do alvo e aumentar a precisão anatômica em estudos de manipulação gênica.
- Valor Operacional: Promove a reprodutibilidade por meio de coordenadas estereotáxicas padronizadas, parâmetros de injeção e cuidados pós-operatórios.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar ou não ao fornecer clareza mecanicista sobre a função do alvo nas vias da dor.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base em fenótipos validados na medula espinhal.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia estereotáxica em roedores, técnicas microcirúrgicas e execução de procedimentos assépticos.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo estrutura estereotáxica, bomba de microsiringa e pipetas de vidro biseladas.
- Necessita de preparação padronizada de vetores virais e verificação de título para dosagem consistente entre experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes segmentos da medula espinhal, sorotipos virais ou cargas de transgenes.
- As limitações práticas incluem variabilidade cirúrgica e resposta tecidual, que devem ser controladas por meio de treinamento do operador e padronização do protocolo.
