Name: Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a realizar injeção estereotáxica de vetor viral no corno dorsal lombar da medula espinhal de camundongo. Este método permite manipulação gênica condicional precisa para estudar funções neurais e mecanismos da dor.

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Agradecemos Bakhos A. Tannous, Ph.D., Diretor de Desenvolvimento de Vector e Produção no Centro de Neurociências de Massachusetts General Hospital, em Charlestown, Massachusetts, para fornecer-nos com o vetor rAAV-EGFP e João Whang para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por subvenções R01 NS050408 (a JS) do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.

O procedimento cirúrgico descrito foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Columbia. 1. Preparação de Equipamentos e suspensão de partículas de vírus <ol><li> Limpar e desinfectar o equipamento, esterilizar os instrumentos cirúrgicos e os picos de entalhe em V que serão utilizados para fixar vértebra L1. </li><li> Puxe e pipetas de vidro bisel. Usamos pipetas que têm um diâmetro da ponta de 40 um e são chanfrados num ângulo de 20 °. Esterilizar as pipetas de vidro. </li><li> Configure o quadro estereotáxico, montar o injetor micro para o manipulador e conectar o injetor para o controlador. </li><li> Prenda uma das pipetas de vidro para o micro usando o kit de conexão de compressão. </li><li> Remover o êmbolo da microsseringa e encher a seringa com óleo mineral. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftol), podem ser adicionados ao óleo mineral para aumentar a sua visibility. Reinserir o êmbolo e empurre-o para todo o caminho até a ponta. Cuidadosamente evitar a criação de uma bolha de ar. </li><li> Preparar a suspensão de partículas de vírus em um armário de biossegurança. Descongelar o virus congelada em gelo e, imediatamente antes da utilização, diluir com estéril salina tamponada com fosfato com a concentração de partículas desejado. </li><li> Insira o micro para o suporte no injector. </li><li> Pipetar 5 ul da suspensão de vírus para uma folha de plástico, por exemplo Parafilm. Diminuir a ponta da pipeta de vidro para o soltar e puxar o êmbolo para encher a microsseringa. Criar uma pequena bolha de ar na ponta da pipeta para evitar que o entupimento. </li></ol> 2. Laminectomia <ol><li> Prepare a área de cirurgia limpando banco e almofada de aquecimento com desinfetante. </li><li> Anestesiar o mouse. Nós usamos anestesia inalatória com isoflurano (3% durante a indução, 2% a 3% durante a manutenção). </li><li> Coloque lubrificante em cada olho, para proteger os olhos de secagem durante o períodooperação. </li><li> Raspar a pele a partir da parte inferior das costas do pescoço do rato e desinfectar a pele com a alternância de toalhetes de um anti-séptico tópico tal como clorhexidina ou povidona-iodo e etanol a 70%. Isolar o local assepticamente preparada com tecido cirúrgico e infiltrar o local da incisão com bupivacaína (0,25%, 1:10 diluídas com solução salina fisiológica). </li><li> Incisão na pele na extremidade caudal da caixa torácica ao longo da linha média (2-3 cm) e separar a fáscia que cobre a lombada. </li><li> Porque a medula espinhal pára de crescer mais cedo durante o desenvolvimento pós-natal do que a coluna vertebral, o segmento vertebral L4 está por baixo da primeira vértebra lombar (L1). Vértebra L1 está localizado à vértebra caudal que mantém o último par de costelas. Identificar e expor vértebra L1, removendo os pequenos músculos e ligamentos da coluna vertebral presos a sua superfície dorsal. </li><li> Ligeiramente levantar e segurar vértebra L1 com uma pinça de Adson. Use uma pinça laminectomia dedicados para remover o portio dorsaln da vértebra (coluna e lâmina) e expor a medula espinhal. Evitar danos na medula espinhal. </li><li> Transferir o rato sobre a placa de aquecimento na armação estereotáxica. Monitorar a temperatura do mouse durante a operação subseqüente. </li></ol> 3. Injeção <ol><li> Fix vértebra L1 com picos de entalhe em V. Os picos devem estabilizar a coluna vertebral, de modo que a vértebra não se mover durante a respiração. </li><li> Traga a micro mais perto de modo que a ponta da pipeta é acima do local da laminectomia. Abaixe o êmbolo até que a suspensão de vírus sair da pipeta. Remover a gota, com uma ponta de algodão estéril. </li><li> Posicionar a ponta da pipeta na porção rostral do mais medula espinal exposta. Centro da pipeta acima do sulco posterior mediana, em seguida, passar a ponta 500 mm lateralmente. Diminuir a ponta para a superfície do cabo e punção da dura-máter ou, se estiver a trabalhar com uma pipeta de vidro unbeveled, utilizar uma cânula de aço biselado para perfurar o dura. Baixar a ponta da pipeta de vidro 300 um para a medula espinhal. </li><li> Injectar 1 ul de suspensão de vírus, a uma taxa de 200 nl / min. </li><li> No final da injecção, esperar, pelo menos, 2 minutos antes lentamente retraindo a pipeta. </li><li> Repita os passos 3,3-3,5 na porção mais caudal da medula espinal exposta para obter uma distribuição completa do vector viral em L4 segmento da coluna vertebral. Os dois locais de injecção situam-se rostral e caudal do segmento de L4 para evitar danos no tecido na região-alvo. </li></ol> 4. O fechamento da ferida <ol><li> Lançamento vértebra L1 dos grampos de entalhe em V e remover o mouse do quadro estereotáxico. </li><li> Suturar a fascia com 5,0 vicryl. A fáscia fechado oferece cobertura para o site laminectomia. </li><li> Feche a pele com fio de náilon ou grampos cirúrgicos. </li></ol> 5. Cuidados no pós-operatório <ol><li> Transferir o mouse para uma gaiola de recuperação, com cama, macio não-particular. Coloque-o em tele laterais para respiração confortável. Monitorar o animal até que ele é totalmente alerta, ambulatório e começa a beber. </li><li> Fornecemos analgesia pós-operatória, durante 72 h, com injecções subcutâneas diárias de carprofeno (5,0 mg / kg). </li><li> Monitorar a recuperação pós-cirúrgica por inspeção diária para os primeiros 3 dias, depois a cada dois dias ou três dias por semana, até que a experiência é completa. </li><li> Remover as suturas ou agrafos 7 a 10 dias após a operação, quando a cicatrização de feridas é completa. </li><li> Eutanásia do animal após a conclusão da experiência. </li></ol>

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<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Injecção estereotáxica vector permite a segmentação neurónios da espinal medula de aplicações, tais como mapeamento de rede neuronal com base em vírus transsináptica espalhando 6,7 ou optogenética dissecção 8, durante a regeneração axonal de orientação a partir de 9,10 lesão, ou terapia de gene para a prevenção ou tratamento da neurodegeneração 11, 12. Os vectores virais têm sido utilizados para a manipulação de genes na medula espinhal de estudar vias motoras, autonômicas e s...

As tecnologias avançadas de manipulação genética condicional no rato permitir abordagens multifacetadas para a exploração de vias sinápticas e ligações funcionais no sistema nervoso central. Os transgenes podem ser regulados por moléculas pequenas efectoras, tais como a doxiciclina que actuam sobre um transactivador controlado por tetraciclina, que pode ser concebido para funcionar como um repressor ou um activador da transcrição de genes, ou tamoxifeno reconhecendo um domínio mutado de ligação ao ligando do receptor de estrogénio 1 . Modificação irreversível transgene geralmente é conseguido por o ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinases. Cre (recombinação causas) e FLP (flippase enzima de recombinação) catalisam a excisão, inversão ou translocação de fragmentos de DNA que são ladeadas por loxP (locus de cruzamento x mais, P1) ou Frt (flippase alvo de reconhecimento) sites, respectivamente 1. As aplicações incluem a ativação do gene ou silenciamento e ácido induzível ribonucléico (RNA) interferência <sup&gt; 2. Expressão condicional de repórteres fluorescentes ou enzimáticos, tais como β-galactosidase ou fosfatase alcalina pode ser utilizada para rotular os neurónios e examinar a sua organização tópica e conectividade 3. Grandes projectos de mutagênese na América do Norte ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) e Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) estão produzindo bibliotecas de clones de rato com células-tronco embrionárias condicionais genes alvos e armadilhas que eventualmente cobrem o genoma do rato inteiro. Ratos gerados a partir destes clones podem ser cruzadas com um número crescente de linhas de ratinhos que expressam ADN sob recombinases promotores ou loci específicos para uma determinada população de neurónios para a manipulação de genes selectiva ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; No entanto, restringir a manipulação de genes a diferentes populações de neurónios ou de regiões de interesse particular não pode ser obtida por segmentação genética sozinho, se um promotor específico para a população de neurónios de interesse não é conhecido ou não expresso por todos os neurónios na região de interesse. Na medula espinal, os desenhos experimentais podem exigir restrição espacial da manipulação genética de um ou dois segmentos crânio-caudal. Injecção estereotáxica de um vector viral que expressa Cre ou Flp permite limitar a recombinação de genes para as regiões na medula espinal de ratos em que os fragmentos de DNA são flanqueados por sítios loxP ou FRT, os chamados alelos floxed ou flrted. Ao contrário de rearranjo do DNA constituinte, que resultaria da hibridização, os animais com ratos que expressam recombinase, esta estratégia também proporciona um controlo temporal sobre a activação do gene ou silenciamento. Os vectores virais que codificam floxed ou flertou transgenes oferecem uma opção inversa de manipulação de genes em ratos expressando a corresponding recombinase jusante de um promotor específico para neurónios. Vários vetores recombinantes com afinidade para os neurônios estão disponíveis 4. De elevada capacidade de adenovírus (gutless), vírus adeno-associados, vírus do herpes simplex e lentivírus são comumente utilizados vectores neurotrópicas. Selecionando o vírus apropriado para uma questão de pesquisa é uma parte crucial do projeto experimental. Tamanho do transgene, via de administração, a especificidade da infecção para os neurónios, em oposição às células da glia, a eficácia da infecção, os efeitos secundários inflamatórios e tóxicos precisam ser considerados 4. Aqui descrevemos a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal da medula espinhal, uma técnica que empregam para a regulação do gene condicional na nossa pesquisa sobre a neurobiologia da dor. O corno dorsal recebe entrada aferente primário neurônios somatossensoriais incluindo neurónios nociceptivos. Interneurônios locais processar as informações antes de neurônios de projeção transmiti-lo a partir decorno dorsal para o cérebro 5. Nós demonstramos que a infecção de neurónios do corno dorsal da coluna vertebral ao nível segmental L4 com um neurotrópica de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no âmbito de um promotor de citomegalovírus constitucionalmente activo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Placa de base da coluna vertebral </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento estereotáxico de pequenos animais </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Rato gás suporte da cabeça anestesia </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Ajustáveis ​​montagens de base </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> Picos de entalhe em V </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeno animal, sistema de controlo de temperatura </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps laminectomia </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (um) com SYS-Micro4 Controlador </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN de compressão apropriado, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no cabo de rato spinal

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenquimatosa injecção de um vector viral permite a manipulação genética condicional em populações distintas de neurônios ou regiões específicas do sistema nervoso central. Nós demonstramos uma técnica de injecção estereotáxica que permite a expressão do gene alvo ou silenciamento no corno dorsal da medula espinal do rato. O procedimento cirúrgico é breve. Ele requer laminectomia de uma única vértebra, fornecendo para a recuperação rápida do animal e da motilidade perfeita da coluna vertebral. Injecção controlada de um pequeno volume vector suspensão a baixa velocidade e à utilização de uma micro-seringa com cânula de vidro biselado minimizar a lesão dos tecidos. A resposta imunitária local do vector depende das propriedades intrínsecas do vírus empregue, na nossa experiência, é menor e de curta duração quando um vírus adeno-associado recombinante é utilizado. Um gene repórter, tais como a proteína fluorescente verde melhorada facilita a distribuição espacial de controlo do vector, e a eficácia e celular specipecificidade da transfecção.

Sucesso rendimentos de transfecção expressão gênica robusto em neurônios do corno dorsal injetado (Figura 1), poupando o corno dorsal do lado contralateral, o corno anterior e gânglios da raiz dorsal. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Transfecção dos neurónios do corno dorsal. (A) Expressão do EGFP repórter fluorescente (verde) no corno dorsal esquerda da medula espinhal L4, duas semanas após a injecção estereo...

Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma expressão gênica restrita espacialmente na medula espinhal de camundongos mediante injeção estereotáxica de um vetor viral no corno dorsal lombar. O primeiro passo do procedimento é localizar e expor a vértebra lombar. O segundo passo é remover a porção dorsal da vértebra para expor a medula espinhal.Um procedimento denominado laminectomia. Em seguida, uma pipeta de vidro conectada a uma bomba de microseringa é posicionada sobre o corno dorsal e introduzida na medula espinhal. O passo final consiste em injetar lentamente a suspensão do vetor.Duas semanas depois, a transfeção de neurônios do corno dorsal é demonstrada pela expressão da proteína verde fluorescente, o que permite acompanhar a distribuição do vírus. Este método ajuda a elucidar a função dos neurônios em parte da via sensorial. Utilizamo-lo em estudos que focam especificamente no desenvolvimento da dor inflamatória ou neuropática.A demonstração visual é fundamental para aprender como posicionar o camundongo no estereotáxico. É essencial para o sucesso do procedimento que a coluna vertebral seja fixada corretamente, pois a laminectomia é uma técnica tão delicada. Martin Mol

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Porlan, E., et al. Modificação genética estável e eficiente de células no camundongo adulto V-SVZ para a análise de efeitos autônomos e não autônomos de células-tronco neurais. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a modificação genética estável de células-tronco neurais (NSCs) na zona ventricular-subventricular (V-SVZ) por meio da injeção estereotáxica de um gene terapêutico portador de vírus em um modelo de camundongo. O vírus entra nas NSCs, sofre transcrição reversa, integra-se ao...

Injeção estereotáxica de vírus para modificação genética estável em um modelo de camundongo

Fonte: Chen, S., et al., Cirurgia Estereotáxica para Manipulação Genética em Células Estriatais de Cérebros de Camundongos Neonatais. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vetor viral que codifica a Cre recombinase e a proteína de fluorescência verde ou GFP no estriado de um filhote de camundongo geneticamente modificado para obter a manipulação de genes extirpando um STOP flanqueado por loxP, ativando a proteína de fluorescência vermelha ou RFP como repórter.

Microinjeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação gênica em um filhote de camundongo estriado

Fonte: Tadokoro, T., et al. Entrega do vetor do vírus adeno-associado subpial 9 (AAV9) em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra uma técnica de injeção subpial para entrega de genes à medula espinhal em camundongos. O procedimento envolve expor a dura-máter, perfurar a pia-máter e injetar um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) carregando um gene que expressa proteína fluorescente no espaço subpial. Após a injeção e recuperação, o vírus facilita a expressão gênica nas...

Entrega de genes subpiais na medula espinhal de camundongos para avaliar a expressão gênica

Fonte: Pereira, M. et. al., Reprogramação direta in vivo de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vírus adeno-associado no córtex cerebral de um camundongo transgênico para fornecer reprogramação neuronal dependente de Cre e genes repórteres fluorescentes em células gliais.

Injeção estereotáxica de vetores virais para reprogramação de células gliais em modelo de camundongo

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projeto, embalagem e entrega de CRISPR retro e lentivírus de alto título por meio de injeção estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a injeção viral estereotáxica para edição precisa de genes neuronais no cérebro de camundongos. O protocolo garante a entrega precisa do vírus ao giro denteado, permitindo a marcação fluorescente e o nocaute genético mediado por CRISPR para estudar circuitos neurais, função gênica e mecanismos de doenças in vivo.

Injeção viral estereotáxica para edição de genes neuronais direcionados no cérebro de camundongos

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Este protocolo demonstra a injeção de um vetor viral retrogradely transportável em tecido de medula espinhal de ratos. O vetor é tomado no sinapse e transportado para o corpo celular dos neurônios do alvo. Este modelo é apropriado para rastreamento retrógrado de importantes vias da coluna vertebral ou células alvos para aplicações da terapia de gene.

Injeção direta de um vetor de Lentivirus destaca várias vias motoras na medula espinhal de ratos

Este protocolo demonstra um novo método para a aplicação de terapias genéticas a subpopulações de células em ratos neonatais em idades pós-natais de 5 a 10 dias, injetando um modificador quimiogenético anterógrado no córtex somatomotor e uma Cre recombinase retrógrada transportável na medula espinhal cervical.

Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor duplo-viral usando cirurgia combinada de cérebro e coluna vertebral

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Aprenda a realizar injeção estereotáxica de vetor viral no corno dorsal lombar da medula espinhal de camundongo. Este método permite manipulação gênica condicional precisa para estudar funções neurais e mecanismos da dor.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

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