Name: Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a medir perfis de velocidade de fluxo sanguíneo em microcanais usando μPIV. Esta técnica de velocimetria por imagem de micropartículas permite analisar características de fluxo com aplicações clínicas importantes.

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Os autores gostariam de agradecer a NSERC (Ciências Naturais e Conselho de Engenharia do Canadá) para financiamento, Catherine Pagiatikis por sua ajuda em corridas iniciais, Sura Abu-Mallouh e Frederick Fahim para testar o protocolo, Richard Prevost de LaVision, Inc para o suporte técnico, e Guy Cloutier, da Universidade de Montréal para o empréstimo da câmera de alta velocidade Dalsa.

1. Microchip Fabrication O primeiro passo é criar ou comprar o seu microcanais. Há muitas opções de material de microchip. Um dos materiais mais comuns escolhidos é o poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Existem muitas publicações sobre as indicações para PDMS fabricação através de litografia suave 16,17,18. Uma vez que o canal de PDMS é fabricado, há vários tratamentos de superfície disponível para inverter a sua hidrofobicidade natural. Tratamento com plasma oxigenado é uma opção comum. Zhou, Ellis, e Voelcker (2009) dar uma revisão de tratamentos de superfície e como eles afetam PDMS. Estes resultados são no entanto para a água, e o sangue tem propriedades diferentes. Um estudo sobre o que significa que o tratamento de superfície para o sangue foi feito através de Pitts et al. (2012a). Para que os resultados aqui apresentados, as superfícies microchip e as lâminas de vidro que eramligado a ambos foram expostas ao plasma oxigenada durante 45 segundos e, em seguida, pressionado firmemente em conjunto, resultando numa ligação permanente. 2. Preparação de Sangue <ol><li> Coletar amostras de sangue de uma unidade credenciada. Por exemplo, o sangue de suíno pode ser utilizado com o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante. Adicionar 1 g de EDTA, com 4 ml de água, e, em seguida, adicionar a solução a 1 litro de sangue completo, misturando suavemente 10x. </li></ol> Ao escolher-se amostras de sangue, eles permitem a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. As amostras de sangue devem ser frescos e, de preferência usado no dia em que são recolhidas para conservar as propriedades reológicas do sangue. As amostras podem ser conservadas sob refrigeração à temperatura ambiente, uma vez, no entanto sangue total sem anticoagulante será inutilizado após refrigeração. Dependendo do anticoagulante, GVs pode ser mantido refrigerado durante até 42 dias, e de sangue total pode ser mantido refrigerado durante 35 dias, mas seria possível contaminação de uma forma não-mfacilidade edical 21. Além disso, tenha cuidado com o método de coleta de amostras de bovinos ou suínos, e evitar a contaminação pela medula óssea. <ol start="2"><li> Centrifugar as amostras de sangue de 3x a 3.000 rpm durante 10 min de cada vez. Depois da primeira centrifugação, remover o plasma e crosta inflamatória, descarte. Geralmente, é mais fácil de remover o plasma em primeiro lugar, e, em seguida, descartar ou guardar para uso futuro, em seguida, para remover a cobertura amarelada sozinho. </li></ol> Introduzir a pipeta lentamente, de modo a não misturar o creme leucocitário volta para a corrente sanguínea. Após a remoção da cobertura amarelada, adicionar cerca de 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misturar suavemente, recentrifuge. Repita o último passo. Após a terceira centrifugação, remover a crosta inflamatória PBS e restante, descarte. Também é possível utilizar o plasma nativo em vez de PBS se deseja manter as propriedades de agregação do sangue. Certifique-se de não misturar qualquer buffy coat ou brancocélulas do sangue para o plasma. <ol start="3"><li> Aqui as células vermelhas do sangue (RBC limpos) e suspender em PBS ou plasma em concentrações desejadas (hematócrito). Verificar com hematócritos numa microcentrífuga (CritSpin FisherSci, EUA). </li></ol> Sangue em 10 a 20% de hematócrito deve ser mais fácil de visualizar do que 40 ou 50% (hematócrito fisiológica). Na microcirculação, o sangue é geralmente metade do hematócrito da circulação macro, para H = 20 é adequada 15. <ol start="4"><li> Adicionar partículas traçadores fluorescentes para a concentração desejada para as amostras de sangue. A regra geral é que 10 partículas em uma janela de correlação, que podem ser calculados antes da hora. </li></ol> Por exemplo, 30 ul de partículas são adicionados a 1 ml de solução de sangue para a configuração descrita no vídeo. Alternativamente, as próprias GVs podem ser marcadas por fluorescência. <ol start="5"><li> Além disso, faça uma solução de calibração com água e gripeorescing partículas. É necessário calibrar o sistema, com uma solução newtoniano. </li></ol> Por exemplo, quando se utiliza uma objectiva 10X com um canal na escala de 100 mm, uma concentração adequada é de 300 ul de partículas misturadas com 15 ml de água destilada. Uma outra opção é utilizar o glicerol diluída com água destilada para uma viscosidade de 3CP, que está mais próxima à viscosidade do sangue macro. 3. μPIV Medidas <ol><li> De segurança do laser: Verifique a temperatura e umidade. Use óculos de segurança apropriados a laser. Feche a cortina do laser ou ligar o sinal de laser na porta do laboratório para evitar que pessoas que não estão protegidas de serem expostos. </li><li> Processo de software de Davis é mostrado no vídeo. Para mais detalhes, consulte o manual do usuário de um sistema específico. </li><li> Antes de levar os dados, a escala de câmera precisa ser calibrado utilizando um micrômetro. </li><li> Para reduzir a conformidade do sistema, use o mais curto espaço de uma tubulaçãod a seringa mais pequena possível rígida, tal como uma pi Hamilton Gastight seringa de 15 ou 50. Para reduzir a perda de sangue ou de admissão de ar para o sistema, para selar o tubo da seringa e para o chip. Isto pode ser feito com a cola, ou vaselina PDMS (sendo cuidadoso para não contaminar o sangue). </li></ol> Para preencher o micro-seringa com água misturada com partículas de usar o método de traçador de refluxo visto que o volume da micro-seringa é geralmente muito mais pequeno do que o volume a preencher. O método consiste refluxo para encher a seringa e micro-canal em conjunto através da saída do canal, utilizando uma seringa de plástico secundário. Para isso, em primeiro lugar remover o micro-êmbolo de seringa, em seguida, apertar o líquido utilizando a seringa clássica ligado à saída do canal, que o fluxo de líquido para fora da micro-seringa até que todas as microbolhas estão fora da micro-seringa ou tubagem chips, finalmente, colocar o êmbolo para trás, e desconecte a seringa de plástico. A presença or ausência de microbolhas pode ser verificado com um microscópio. <ol start="5"><li> Nivelar a bomba de seringa para atingir tubagem horizontal. Programar a bomba de seringa a taxa de fluxo desejada. </li></ol> Estar ciente dos possíveis efeitos transitórios, como o &quot;efeito gargalo&quot;, para o sistema rígido ou a conformidade do sistema que modifique o fluxo real. Tempos característicos de um sistema pode ser estimado como função dos materiais e as dimensões do sistema. (Capítulo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005) <ol start="6"><li> Coloque microchip no palco microscópio e ligar a bomba. Utilizar a água com partículas para calibrar o sistema para o perfil de velocidade média e calibrar o dT (o tempo entre as imagens pulsadas). </li></ol> As partículas devem mover-se entre 5 e 10 pixels entre os quadros para uma boa correlação 11. Ao calibrar, ter o cuidado de medir no meio do canal. O plano de foco no meio tem a maiorvelocidade 8. Se estiver usando um canal de volta, tome cuidado com os efeitos de sombreamento. Uma imagem da amostra é mostrado na Figura 2, usando uma câmara de impulsos, enquanto que a parte superior da imagem é o primeiro impulso e a imagem de fundo é o segundo impulso. Pode ser visto na figura, que os pontos brilhantes (partículas fluorescentes) são os mais em foco. <ol start="7"><li> OPCIONAL: Tomando os dados a diferentes alturas de um perfil de velocidade em 3D pode ser reconstituída por adição dos diferentes vectores para uma única imagem. O vídeo apresenta uma rotina que foi desenvolvido para a automatização do processo. </li><li> Quando a tomada de dados com o sangue, encher a seringa com a quantidade desejada de sangue com o mesmo método como a água. Programar a bomba de seringa para a taxa de fluxo desejada, e levar os dados desejados. Um exemplo de imagens em bruto obtidos são apresentadas na Figura 2. Tenha cuidado com RBC sedimentação bem. Recarregando a seringa cada corrida ou a cadaoutro prazo, irá reduzir a resolução da RBC. </li><li> Após a obtenção de imagens, a correlação cruzada é executada nos pares de imagem para obter campos vector de velocidade entre as imagens. É importante ter boas imagens para ter uma boa correlação. Antes de correlacionar, pré-processamento pode ser feito para eliminar o ruído de fundo. </li></ol> Correlação cruzada é feito entre as janelas nas imagens adjacentes, que podem ser variadas em tamanho e forma a afectar a correlação. Depois de correlação cruzada, pós-processamento de imagem pode ser feito para eliminar vetores errôneos ou outliers. Uma descrição detalhada das diversas opções disponíveis e os seus precisões podem ser encontrados em Pitts et al. (2012b), onde o melhor tratamento para o sangue foi considerado o método de &quot;imagem de sobreposição&quot; com janelas estendido em comprimento e alinhada com o fluxo . Estas operações podem ser feitas manualmente em um programa como o MATLAB, ou dentro do pacote de software com seu sistema. O<html> software não é importante, a matemática por trás das operações é mais importante e cada operação pode afectar a precisão do perfil final velocidade. Os vectores resultantes podem ser calculadas no espaço entre o canal para obter perfis de velocidade instantânea e, em seguida, novamente a média no tempo para obter, de um perfil de velocidade média representativa. Kloosterman et ai. (2011) dão uma explicação do erro nas medições μPIV onde a profundidade de campo é grande. As discussões sobre o erro de processamento de dados aqui apresentado pode ser encontrada na Pitts et al. (2012b) para as medições pulsadas e Chayer et al. (2012) para as medições de alta velocidade. Exemplos de perfis de velocidade são apresentados nas Figuras 3 e 4. Figura 3 apresenta-se um único perfil de velocidade para a linha central de uma 10 ul / h de fluxo de RBC em H = 10 em um canal de largura de 140 um. tenda &quot;&gt; O perfil único é alcançada pela média dos vectores correlacionados através do canal para obter um perfil de velocidade, e então a média no tempo para obter uma medida representativa. Neste caso, 100 pares foram, em média, o tempo em todo o campo de vista. Um exemplo do perfil de reconstrução 3D feita por um fluxo de água de calibração num canal 100 um quadrado, com uma taxa de fluxo programado, de 30 uL / hr é encontrado na Figura 4. Na Figura 4, os perfis são medidos em intervalos de 1 uM. <ol start="10"><li> OPCIONAL: Nas imagens de alta velocidade descritos set-up podem ser tomadas nas mesmas condições por câmeras de comutação (e sistemas de aquisição de dados). Isto pode ser útil para a visualização da camada livre de células no canal, e para quantificar a agregação. A análise dos dados é ligeiramente diferente (Chayer et ai., 2012). </li></ol> Exemplos de imagens de luz branca com e sem agregação de RBC são presented na Figura 5 em H = 20. As imagens superiores mostram H = 20 em PBS, que remove a capacidade do agregado para o RBC, a 1 mL / hr. A imagem de fundo é H = 20 em plasma nativa em 0,5 mL / hr. Na imagem inferior, a agregação é visível. <ol start="11"><li> Desligue o sistema de uma forma segura, quando as medições foram concluídos. Use procedimentos adequados de segurança do laser até fonte de energia do laser é completamente desligado. </li></ol>

<ol><li>Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle+image+velocimetry+system+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">A particle image velocimetry system for microfluidics.</a> Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).</li>
<li>Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).</li>
<li>Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sliced+micro-PIV+using+confocal+laser+scanning+microscopy+%28CLSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM).</a> Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).</li>
<li>King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hematocrit+and+leukocyte+adherence+on+flow+direction+in+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+of+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation.</a> Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).</li>
<li>Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+micro-PIV+measurements+of+three-dimensional+profiles+of+cell+suspension+flow+in+a+square+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel.</a> Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).</li>
<li>Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-resolution+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Micro-+and+Nanofabricated+Structures+and+Devices+for+Biomedical+Environmental+Applications%22%5BJournal%5D)">Micro-resolution particle image velocimetry.</a> Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications. 3258, 122-133 (1998).</li>
<li>Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+illumination+for+two-dimensional+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry.</a> Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).</li>
<li>Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+measurement+accuracy+in+optical+microhemodynamics%3A+experiment+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation.</a> Physiological Measurement. , In Press (2012).</li>
<li>Tabeling, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabeling%2C+P+%22Introduction+to+Microfluidics%22">Introduction to Microfluidics</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).</li>
<li>Olson, M. G., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out-of-focus+effects+on+particle+image+visibility+and+correlation+in+microscopic+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry.</a> Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).</li>
<li>Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+micro-particle+image+velocimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).</li>
<li>Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+applications+on+microfluidic+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Advances and applications on microfluidic velocimetry.</a> Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).</li>
<li>Chiu, J. J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium%3A+Pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).</li>
<li>Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcirculation%3A+Physiology+at+the+mesoscale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The microcirculation: Physiology at the mesoscale.</a> J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).</li>
<li>Popel, A. S., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+and+hemorheology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechancis%22%5BJournal%5D)">Microcirculation and hemorheology.</a> Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 37, 551-577 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+methods+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Today%22%5BJournal%5D)">Flexible methods for microfluidics.</a> Physics Today. , 42-48 (2001).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+of+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).</li>
<li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+PDMS+surface+modifications+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).</li>
<li>Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+angle+study+of+blood+dilutions+on+common+microchip+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).</li>
<li>Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+red+blood+cell+aggregability+and+shape+during+blood+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage.</a> Transfusion. 39, 277-281 (1999).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302(2012).</li>
<li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Usando μPIV para medições de fluxo de sangue na escala da microcirculação pode dar insights sobre um grande número de processos de engenharia biomédica, mecânica e química relevantes. Alguns dos principais fatores para contabilizar são a densidade da RBC-se, a agregação e deformabilidade do RBC, agregação ou movimento das micro partículas fluorescentes, ea fixação da RBC nos canais. Todos estes podem ser explicados se as orientações gerais estabelecidas acima forem seguidas. Há uma lista de verificação básica para mante...

O corpo humano contém numerosos vasos com diâmetro inferior a 50 um, que são o principal local de permuta entre o sangue e tecidos. O estudo do fluxo de sangue nesses vasos representa um desafio considerável, devido tanto à escala das medições e as propriedades dos fluidos de sangue. Estas medições, incluindo o gradiente de pressão, o corte na parede e perfis de velocidade nas arteríolas e vénulas, são factores principais relacionados com as respostas fisiológicas. Há agora oportunidades sem precedentes para resolver esses desafios de medição, graças às novas técnicas experimentais no micro escala para estudar a microcirculação e resolver este problema multiescala. Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é uma técnica de visualização de fluxo baseado em partículas, que é utilizado para avaliar perfis de velocidade de fluxo sanguíneo em microcanais por meio de correlação cruzada. μPIV, desenvolvido pela primeira vez por Santiago et al., tem sido utilizado com hemorreologiaestudos desde Sugii et al., em 2001, utilizou a técnica para medir o fluxo de sangue em 100 mM tubos de vidro redondo 1,2. Diferentes abordagens para existir μPIV. Câmaras de alta velocidade pode ser utilizado para relacionar o movimento das células vermelhas do sangue (RBC), e as imagens por impulsos pode ser utilizado para relacionar o movimento das partículas de marcadores. Qualquer destas opções podem ser acoplados com um microscópio vertical ou invertida, dependendo da aplicação. Em ambos os casos, o resultado é um perfil de velocidade 2D. Outra abordagem é a utilização de um microscópio confocal para atingir perfis 2D e 3D. Este método tem sido aplicado para o sangue 3,4,5. Micro escala PIV tem várias complicações, quando comparado com macro PIV. Em macro PIV os dados podem ser limitados a um único plano de luz através das folhas, mas a iluminação de volume micro escala é necessário. Volume de iluminação é um problema maior para a imagiologia de micro fluxos sanguíneos, como os próprios GVs são grandes em comparação com o channels, e utilizando os glóbulos vermelhos como os marcadores partículas conduz a uma profundidade de correlação (DOC), o que pode diminuir significativamente o rigor dos resultados de correlação cruzada de 6,7,8. Após Wereley et ai. (1998), o DOC para um canal de altura com 40 um RBC como marcadores é de 8,8 mM, enquanto que com um traçador de partícula de 1 um a DOC é de 6,7 mM. Esta diferença torna-se mais pronunciado quando se muda a altura do canal e ampliação. Além disso, os glóbulos vermelhos são opacas, e aumentando a densidade dos GVs no fluxo provoca dificuldades de imagem. Traçadores fluorescentes partículas, utilizadas pela primeira vez por Santiago et al. (1998), têm sido defendidos como uma ferramenta para diminuir a influência de partículas fora do foco, quando usando as partículas mais pequenas possíveis. Utilização de 1 um de diâmetro micropartículas fluorescência acoplado com um laser é uma abordagem que pode diminuir a profundidade de foco no problema de micro imagiologia fluxo sanguíneo 10. Existem várias opiniões atuais do estado de μPIV technology, cada um dos quais destaca a importância da μPIV para estudos de fluxo de sangue 11,12. Várias considerações importantes devem ser tidas em conta quando se utiliza μPIV de sangue. No nível micro, a escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de células flexíveis vermelhas do sangue (eritrócitos), as grandes células brancas do sangue, plaquetas e outras proteínas suspensas num fluido newtoniano (plasma) . Os perfis de velocidade medidos aqui pode ser utilizado para medir certas características das micro-circulações sanguíneas. Os factores importantes na microhemorheology são a taxa de fluxo do sangue, a forma do perfil de velocidade, e a tensão de cisalhamento na parede do recipiente. Esta informação tem implicações clínicas, tal como a microcirculação é o local para a troca de nutrientes no corpo, e esta troca é dependente do cisalhamento. Existem vários estudos de revisão atuais sobre o estado da investigação na microcirculação, bem 13,14,15. Apresentado aqui é um protocolo para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em polidimetilsiloxano (PDMS) microcanais. Canais de PDMS foram fabricados em casa seguindo as fontes na seção 1 do protocolo. Amostras de sangue de suínos foram obtidos a partir de um matadouro credenciado e limpos seguindo seção 2 do protocolo. Todos os dados foram obtidos usando o sistema MITAS μPIV LaVision, conforme descrito na seção 3 do protocolo. A montagem é composto por um laser Nd: YAG (New Wave Research, EUA) e câmara CCD (imagem intensa, Lavision), controlada por uma unidade programável de disparo, um microscópio de fluorescência acoplado a um estágio movendo-se em três eixos, e um computador, para além de uma câmara de alta velocidade (Dalsa 1M150, Holanda) foi adicionado para a visualização dos próprios eritrócitos. Ambas as câmeras são conectadas a uma caixa de ótica 2 portas (Custom por Zeiss, Alemanha). Em típico medidas in vivo do fluxo de sangue, um microscópio vertical é usado para rastrear as hemácias domselves, enquanto que, na típica aplicações in vitro um microscópio invertido é usado para controlar as partículas de marcadores. Neste única dupla set-up, a caixa de óptica permite que ambos os traçadores de ser fotografada usando um microscópio invertido. O sangue foi introduzido nos microchips através de uma bomba de seringa de alta precisão (Nexus3000, Chemyx Inc., EUA). Um diagrama do sistema é mostrada na Figura 1, onde a parte de cima da figura representa a 140 mM por 40 mM canais rectangulares fabricadas de PDMS, e a porção inferior representa todo o sistema, incluindo ambas as câmaras, o laser, a bomba de seringa e do microscópio. ΜPIV atual set-ups disponíveis, geralmente com software proprietário, incluem TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmos de correlação cruzada standard pode ser conseguido através de numerosas opções de software, incluindo o MATLAB. O software não é a chave, a compreensão de que as caixas de diálogo correspondem matematicamente servirá o usor muito melhor. Neste protocolo Davis, software proprietário da LaVision ou MATLAB são utilizados. O protocolo não é um software específico, mas as opções do menu pode estar em lugares diferentes, em diferentes pacotes de software.

<table><tbody><tr><td>poli (dimetilsiloxano) (PDMS), ou seja Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com poshpato (PBS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>micro partículas fluorescentes</td><td>Microgenics / FisherSci</td><td>R900</td><td></td></tr><tr><td>glicerol (OPCIONAL)</td><td>Microcentrífuga Sigma Aldrich</td><td>G6279-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Seringa CritSpin</td><td>FisherSci</td><td>22-269-291</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. 50 &mu; l Câmera Gastight</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Imager Intenso, LaVision de alta velocidade</td><td>, Dalsa</td><td>Imager Microscópio intenso</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>bomba de seringa, i.e. Nexus3000</td><td>Chemyx, Inc.</td><td>Tubo flexível Nexus-3000</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Tygon</td><td>FisherSci</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>software de processamento de dados, i.e. Centrífuga DaVis</td><td>LaVision</td><td>DaVis</td><td></td></tr><tr><td>, i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-partículas velocimetry imagem para a velocidade medidas de fluxos de sangue micro perfil

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é usado para visualizar imagens pareadas de micro partículas semeadas nos fluxos sanguíneos. As imagens são interligado para dar um perfil de velocidade precisa. Um protocolo é apresentada para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em microcanais. Na escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de partículas flexíveis suspensas no plasma, um fluido newtoniano. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo pode ser obtida a partir destas medições. Vários parâmetros de chave, tais como a profundidade de foco, a concentração de partículas, e a compatibilidade do sistema, são apresentados a fim de assegurar, dados úteis precisos, juntamente com exemplos e resultados representativos para vários hematócritos e as condições de escoamento.

Em todas as figuras, o fluxo é da esquerda para a direita nas imagens em bruto, de baixo para cima e de perfis de velocidade calculados. Um exemplo dos dados em bruto obtidos com sangue de hematócrito H = 10, com um caudal de 10 ml / h é mostrado na Figura 2. Os dados brutos podem ser interligado, sem qualquer processamento de dados para obter perfis de velocidade. O impacto dos métodos de pré-tratamento e de processamento de dados é discutida por Pitts et al., (2012b). Um exemplo de um perfil ...

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

O objetivo geral deste procedimento é medir o perfil de velocidade de uma solução sanguínea em um microcanal utilizando a simetria de imagem de micropartículas LOC. Isso é realizado primeiramente calibrando o sistema com uma solução newtoniana no microcanal para definir a escala, ajustar a imagem, o tempo e localizar o plano central do canal. O segundo passo consiste em introduzir a solução sanguínea na configuração do canal e garantir que não haja microbolhas.Em seguida, o fluxo sanguíneo é imageado nos planos desejados no canal, utilizando pares de imagens de uma câmera pulsada ou vídeo de uma câmera de alta velocidade. O passo final consiste em realizar a correlação cruzada entre os pares de imagens ou a sequência de vídeo para obter o campo vetorial de deslocamento dentro do canal. Por fim, o campo vetorial de deslocamento pode ser médio ao longo do canal e no período de tempo da medição para obter um perfil de velocidade indicativo.Este perfil pode ser analisado mais detalhadamente ou utilizado para cálculos. Este método pode responder perguntas fundamentais nas áreas biomédica e de biofluidos, como a forma do perfil de velocidade e a taxa de cisalhamento na parede de vasos microscópicos. Geralmente, usuários novos neste método enfrentam dificuldades relacionadas ao uso de amostras biológicas, como o sangue, e às complexidades envolvidas na realização de medições precisas.O primeiro passo é obter um microcanal em Polymethyl SUBOXANE ou PDMS. Os microcanais neste experimento têm aproximadamente 50 mícrons de profundidade e 150 mícrons de largura. Exponha o lado do PDMS que entrará em contato com o fluido e a lâmina de vidro à qual ele será ligado a um plasma oxigenado por 45 segundos.Em seguida, pressione-os firmemente juntos para obter uma ligação permanente. Neste experimento, utiliza-se sangue fresco coletado dos poros. Para prepará-lo, adicione 0,5 gramas de EDTA a dois mililitros de água.Em seguida, adicione a solução a um litro de sangue total morno agitado suavemente 10 vezes e deixe esfriar até a temperatura ambiente quando o sangue atingir a temperatura ambiente. Centrifugue amostras de 50 mililitros de sangue a 3000 RPM durante 10 minutos. Após isso, utilize uma pipeta para remover o plasma.Em seguida, introduza lentamente uma pipeta para remover a camada de buffy coat, evitando que ela se misture novamente ao sangue após sua remoção. Adicione cerca de 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS e, após misturar suavemente, repita a centrifugação, a remoção do plasma e do buffy coat e a adição de PBS mais duas vezes. Após a centrifugação final, remova o PBS juntamente com o buffy coat remanescente.Retire as hemácias limpas e suspenda-as em PBS ou plasma nas concentrações desejadas. A amostra aqui contém 10% de hemácias ou um hematócrito de 10. Em seguida, adicione partículas traçadoras fluorescentes de um mícron às amostras de sangue na concentração desejada, cerca de 30 microlitros por um mililitro de sangue neste sistema.Além disso, neste momento, prepare uma solução de calibração com água desionizada e as partículas fluorescentes. Os dados deste experimento são coletados usando um sistema de imagem a laser lavis com uma câmera pulsada. Este sistema é acoplado a um laser ND YAG.Antes de coletar os dados, tome todas as precauções de segurança necessárias para trabalhar com laser. Prepare o microchip conectando-o ao sistema de seringa usando a menor seringa possível aqui, 50 microlitros, e a menor quantidade de tubo. Selle o tubo à seringa no chip com cola PDMS ou vaselina para reduzir vazamentos de fluido e entrada de ar.Tenha cuidado para evitar a contaminação potencial do fluido. Para calibrar o sistema primeiro, use a solução de calibração para encher a microseringa. Primeiro, encha uma seringa padrão com a solução de água e partículas fluorescentes. Remova o êmbolo da microseringa.Use a seringa padrão para injetar a solução de calibração na saída do microcanal. Isso fará com que o fluido preencha a seringa micro e escape pela sua extremidade aberta. Continue injetando o fluido até que não haja microbolhas nos tubos do microchip ou na seringa micro.Para verificar a ausência de microbolhas, recoloque o êmbolo da microseringa e examine o sistema com um microscópio. Exemplos de microbolhas são mostrados aqui quando não há microbolhas no sistema, desconecte a seringa padrão e substitua-a por uma seringa para coletar o fluxo de saída. Em seguida, conecte a microseringa com fluido de calibração à bomba de seringa e nivele a bomba.Portanto, o tubo está na posição horizontal. Configure a bomba de seringa na taxa de fluxo desejada. Coloque o microchip sobre a platina do microscópio invertido.Agora calibre o sistema. Primeiro, meça o perfil de velocidade no centro do canal. Também calibre o intervalo de tempo entre as imagens pulsadas.As partículas devem se mover entre cinco e dez pixels entre os quadros. Para uma boa correlação, tenha cuidado para realizar a medição no centro do canal. Após a calibração, remova a microseringa, o êmbolo e a seringa de saída e enxágue o sistema com água pura.Em seguida, preencha o sistema com o sangue preparado utilizando uma seringa padrão para injetá-lo na saída do microcanal. Continue até que não haja microbolhas, conforme confirmado por microscópio. Em seguida, substitua o êmbolo da seringa micro. Em seguida, coloque a microseringa com sangue na bomba de seringa e nivele-a. Mantenha a configuração da bomba inalterada. Coloque o microchip sobre a platina do microscópio e inicie a bomba.Comece a coletar dados para evitar que os glóbulos vermelhos sedimentem na seringa; recarregue-a após cada uma ou duas execuções. Após a coleta de todos os dados, as imagens são como mostradas aqui. Esses são dados brutos obtidos para uma concentração de 10% de glóbulos vermelhos e uma taxa de fluxo de 10 microlitros por hora.A imagem superior é a primeira. A imagem inferior foi capturada um centésimo de segundo depois. Essas imagens são pré-processadas para remover o ruído de fundo após o pré-processamento.A correlação cruzada entre as imagens é realizada para obter campos de velocidade. Este é um exemplo de um resultado de perfil de velocidade de um sistema com 10% de glóbulos vermelhos e uma taxa de fluxo de 10 microlitros por hora. Observe que o eixo vertical representa a velocidade.Utilizando diferentes câmeras e sistemas de aquisição de dados, é possível obter imagens de alta velocidade. Isso pode ser útil para visualizar a camada livre de células no canal e para quantificar a agregação. Essas imagens são de amostras com 20% de hemácias na imagem superior.A taxa de fluxo é de um microlitro por hora, e as células sanguíneas estão suspensas em PBS, o que elimina sua capacidade de agregação. Na imagem inferior, a taxa de fluxo é de 0,5 microlitro por hora, e as células sanguíneas estão suspensas em plasma nativo.Neste caso, a agregação é visível. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, quando focadas, imagens nítidas proporcionarão a melhor correlação entre pares de imagens subsequentes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de como aplicar a simetria de velocidade de imagem de micropartículas em fluxos sanguíneos microscópicos, apesar das dificuldades inerentes do sangue como fluido de trabalho.

micro-particle-image-velocimetry-for-velocity-profile-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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