Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os efeitos do bloqueio de longo prazo da expressão da intersectina 1S sobre a estrutura e a função dos pulmões de camundongos. Isso é realizado primeiramente pela preparação de complexos específicos de duplo lipossomo INA para direcionar a vasculatura pulmonar de camundongos como segundo passo. Os complexos lipossomais de INA são administrados por injeção retro-orbital, e esse procedimento é repetido a cada 72 horas durante 24 dias consecutivos para alcançar uma inibição eficiente da expressão da intersectina 1S.

A seguir, o tecido pulmonar de camundongos injetados é coletado para análises bioquímicas e levantamentos por microscopia eletrônica, a fim de avaliar os níveis de proteína e de mRNA do intersectina-1 e realizar análises morfológicas extensivas dos pulmões. Os resultados obtidos por meio de western blot de lisados pulmonares com anticorpos específicos contra a intersectina-1 e análises de Q-R-T-P-C-R demonstram uma redução específica e eficiente dos níveis da intersectina-1 por 24 dias consecutivos. A principal vantagem desta técnica em relação às metodologias existentes, como vetores virais ou lentivírus, é que a entrega pulmonar de lipossomos ônicos é reprodutível, segura, não tóxica e altamente eficaz no endotélio pulmonar.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos avaliar os efeitos da interseção de N para baixo in vivo e quando outros métodos de entrega de SRNA não funcionaram. Para preparar lipossomos ônicos, adicione 315 microlitros de uma solução estoque de brometo de dimetil dioctadecilamônio, ou DOAB, a um balão de fundo redondo, seguido por 200 microlitros de solução estoque de colesterol e 9,5 mililitros de clorofórmio, misturando com movimentos de rotação. Conecte o balão ao evaporador rotativo ajustado a 37 graus Celsius e 100 ou mais rotações por minuto.

Abra completamente a primeira válvula do argônio girando-a no sentido horário. Sempre abra e feche esta válvula primeiro. A segunda válvula controla a pressão do argônio que entra no frasco.

Abra-o parcialmente para garantir pressão suave. Assim que o gelo seco começar a gotejar sobre o tubo que conecta o tanque de gás de Argonne com o evaporador rotativo, abaixe o evaporador rotativo na banho-maria até que o frasco toque a água sem ficar completamente submerso. Aumente o regulador de velocidade para 100 a 120 rpm. Quando todo o clorofórmio no frasco tiver evaporado, desligue a máquina.

Regule a velocidade do rotoevaporador para zero e feche as válvulas do tanque de argônio. Remova o frasco. Adicione dois mililitros de uma solução de glicose a 5% ao frasco para ressuspender os lipídios.

Usando uma ponteira de pipeta de um mililitro, raspe completamente o fundo do frasco para dissolver todos os lipídios. Incube a solução obtida em banho-maria a 42 graus Celsius por uma hora, agitando lentamente o frasco em vórtex. Sonique a solução por pelo menos 20 a 30 minutos, mantendo o frasco em posição vertical e com o fundo levemente tocando a água fria no banho de ultrassom.

Em seguida, aqueça o balão na banho-maria do rotoevaporador por 20 minutos a 42 graus Celsius em velocidade zero, com o fundo redondo imerso na água. Filtre os lipossomos através de um filtro de seringa de 0,47 mícron, seguido por um filtro de seringa de 0,22 mícron. Utilizando um extrusor pequeno, filtre os lipossomos através de uma membrana de 50 nanômetros para gerar uma população homogênea de vesículas lipossomais unilamelares.

Transfira os lipossomos para um tubo eppendorf e coloque no gelo. Prepare os complexos de lipossomos com RNA ITSN numa proporção de oito mols de lipossomos para dois microgramas de RNA. Neste exemplo, 50 microlitros de I-A-I-T-S-N.

A partir de uma solução estoque de 50 micromolar, adiciona-se a 100 microlitros de lipossomos recém-preparados utilizando um tubo EOR livre de A-R-N-A-D-N-A. Mantenha a mistura em gelo até a injeção nos camundongos. Os camundongos utilizados neste estudo têm entre quatro e seis semanas de idade e pesam cerca de 25 gramas.

Confirme com o aperto no dedo do pé que o animal está completamente anestesiado antes da injeção. As seringas utilizadas são seringas tuberculínicas de um mililitro com a agulha fixada com uma mão. Segure as orelhas do camundongo e vire o animal de lado para expor o ângulo interno do olho.

Direcione-se medialmente aos semilunares do PIKA e evite tocar o globo ocular. Aproxime-se do canto lacrimal do olho com a seringa carregada em um ângulo de 45 graus em todos os três eixos. Injete lentamente a mistura, devolva o camundongo à sua gaiola e permita que ele se recupere com o lado injetado para cima.

Superior. O camundongo é tratado com SIR NA direcionado ao gene ITSN um a cada 72 horas durante 24 dias. Para iniciar este procedimento, verifique se o camundongo está completamente anestesiado pela ausência do reflexo de retirada. Inicie com uma laparotomia e ressecção do diafragma.

Em seguida, realize uma toracotomia para expor os pulmões e o coração. Remova o timo utilizando um microscópio StereoZoom para maior precisão. Canule a artéria pulmonar.

Em seguida, realize uma traqueostomia e entube o camundongo utilizando o estoma traqueal. Ajuste o ventilador para uma frequência de 150 movimentos por minuto e um volume corrente de 150 microlitros. Como saída, abra o átrio esquerdo usando uma bomba peristáltica ajustada em 1,5 mililitro por minuto e solução de Hank aquecida a 37 graus Celsius.

Perfunda a vasculatura pulmonar de camundongo livre de sangue durante cinco minutos, seguido por perfusão com o marcador por 10 minutos. Após lavar o marcador não ligado, realize a fixação in situ dos pulmões por meio de perfusão de 10 minutos com formaldeído 4%, glutaraldeído 2,5% e ácido tânico 1%. Colete os pulmões e remova o tecido em excesso.

Corte os pulmões em blocos pequenos e transfira-os para um frasco de cintilação rotulado contendo dois mililitros de uma mistura fixadora. Para iniciar o processamento do tecido pulmonar para microscopia eletrônica, lave brevemente os blocos pulmonares três vezes em tampão de citato de sódio 0,1 molar.

Em seguida, fixe os espécimes em aldeído 4% e glutaraldeído 2,5% em tampão 0,1 Pipee por uma hora à temperatura ambiente, pós-fixando com 1% de osmio patilado por uma hora na capela sobre gelo, no escuro, após uma lavagem com tampão Callen burger. Incube os espécimes em tampão Callen burger por duas horas até a noite seguinte à temperatura ambiente. Lave uma vez em etanol 50% e, em seguida, desidrate com uma série graduada de etanol.

70% etanol por cinco minutos, 95% etanol por cinco minutos e depois duas vezes em 100% etanol por 15 minutos cada. Em seguida, troque para 100% óxido de propileno. Realize duas incubações de 15 minutos.

Remova o óxido de propileno e adicione uma mistura de 50% de óxido de propileno e 50% de epon. Incube durante oito a doze horas durante a noite em rotação em roda a temperatura ambiente. Na manhã seguinte, remova a mistura e adicione epon fresco. Incube por oito a doze horas por pelo menos quatro a cinco horas na roda.

Adicione os espécimes selecionados a moldes duplamente cônicos preenchidos até a metade com Epon 100% fresco oito 12. Coloque-os nas bordas, transfira os moldes para uma estufa a 60 graus Celsius e deixe curar por 48 a 72 horas. A inibição crônica da expressão da ITSN um s por 21 dias consecutivos mediante administração repetida de complexos de siRNA da ITSN um s com lipossomos resulta em níveis significativamente mais baixos da proteína ITSN um nos pulmões de camundongos, conforme mostrado nestes resultados representativos aqui; lisados pulmonares de um controle não tratado e de camundongos tratados foram submetidos à imunoblotagem com anticorpos contra ITSN um e actina em vários pontos temporais após a administração do siRNA, conforme indicado.

A análise demétrica de filmes representativos de blot CL alto e a R-T-P-C-R quantitativa do mRNA de I TSN um s confirmam ainda que o tratamento com complexos de lipossomos de siRNA de I TSN um s regula eficientemente para baixo a proteína I TSN um s nos pulmões de camundongos. A diminuição nos níveis de intersectina um leva à endocitose deficiente, à disruptura do transporte endotelial e à barreira interendotelial, bem como ao edema pulmonar. Essas micrografias eletrônicas representativas de tecido pulmonar mostram junções interendoteliais abertas, ou JIs, marcadas ao longo de seu comprimento por partículas de albumina douradas de oito nanômetros.

O painel A um é uma ampliação do painel A, cujas setas indicam três a quatro partículas de albumina dourada localizadas próximas umas das outras no mesmo plano, indicando a abertura ampla do IEJ. Partículas douradas também estão associadas à saída abluminal dos IJs, indicada pelas setas nos painéis A um e B. Observe também o número limitado de CVE A e a dilatação do espaço pericapilar indicada pelo asterisco no painel, um downregulação aguda da expressão de intersectina, com ativação de vias alternativas de transporte para compensar a endocitose deficiente.

Essas imagens de ME mostram anéis membranosos nos painéis A e A', tubos pleomórficos no painel B e endossomos aumentados fundidos com cve LA típica no painel C, ativamente envolvidos na captação e transporte de albumina dourada. Também são observadas uma acentuada dilatação do espaço perivascular e edema proteínaceo. A inibição prolongada da expressão de intersectina por 24 dias reduz o edema pulmonar em camundongos, restaurando parcialmente a integridade da barreira interendotelial.

Estudos morfológicos por ME mostraram que o traçador de ouro albumina de oito nanômetros não pôde penetrar na IEJ neste ponto temporal, formando em vez disso resíduos de filtração na abertura luminar da junção, indicados pela seta. No entanto, os espaços perivasculares ou PVS mostraram alguma dilatação e edema leve, sugerindo que as junções são impermeáveis a partículas desse tamanho, mas ainda assim corpos multivesiculares ou MVB próximos à membrana plasmática possuem algumas de suas vesículas internas marcadas por partículas de ouro albumina de oito nanômetros. Esta tabela mostra o número de estruturas transcitoplasmáticas endocíticas em endotélio pulmonar de camundongos controle e deficientes.

Uma descoberta significativa é a diminuição de cavi, um número no endotélio pulmonar de camundongos deficientes em ITSN1. A inibição crônica da expressão de intersectina 1 causou a ativação de vias citoplasmáticas endocíticas alternativas e parcialmente cavi, um número, a quantidade de anéis ou túbulos membranosos marcados por partículas de ouro com albumina. No endotélio pulmonar de camundongos deficientes cronicamente em I Tsn1, o número também aumentou 14 vezes em comparação com os controles.

Após este procedimento, outros métodos, como o Eliza, podem ser aplicados a lisados de pulmão de camundongo para estimar quantitativamente o transporte transendotelial de diferentes traçadores hnic. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como entregar especificamente complexos de lipossoma ônico e SRNA ao endotélio pulmonar de camundongo, com o objetivo de silenciar a proteína de interesse e avaliar sua função.