Name: Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Aprenda a silenciar ITSN-1s em pulmões de camundongo usando lipossomos catiônicos e siRNA por injeção retrorbital repetida. Este método seguro reduz expressão proteica em 75% por 24 dias.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde R01HL089462 para SP.

1. Os lipossomas catiônicos Preparação <ol><li> Autoclave um balão de fundo redondo limpo para ser usado para a preparação lipososmes. </li><li> Preparar soluções estoque: <ol class="lalpha"><li> - Dissolve-se 200 mg de dimetil dioctadecil brometo de amónio (Doab) em 10 ml de clorofórmio, usando um pequeno frasco de vidro. </li><li> - Dissolve-se 200 mg de colesterol em 10 ml de clorofórmio através de um pequeno frasco de vidro. </li><li> - Preparar e autoclave para esterilizar a 5% de glucose em 100 ml de DNA / RNA-ase livre de água destilada. </li></ol></li><li> Lavar o balão de fundo redondo com clorofórmio. Adicionar 5-10 ml para o frasco, redemoinho, e deixe descansar por alguns minutos. Manter o frasco coberto com folha de alumínio em todas as vezes. Esvaziar o clorofórmio, a partir do balão. </li><li> Preparação de lipossomas: <ol class="lalpha"><li> - Adicionar 315 ml de solução estoque Doab ao balão de fundo redondo. </li><li> - Adicionar 200 ul de solução de estoque de colesterol para o balão. </li><li> - Adicionar 9,5 ml de clorofórmio a um frascoª misture redemoinho. </li></ol></li><li> Definir o evaporador rotativo a 37 ° C, 100 rotações por minuto (rpm) ou superior (100-120 rpm). O evaporador rotativo deve estar conectado a um controlo no vácuo da bomba de água com um tubo de sucção conectado correctamente. </li><li> Conecte o tanque de gás argônio e do evaporador rotativo. </li><li> Fixe o balão ao evaporador rotativo e ajustar as configurações ideais antes de baixá-lo em banho-maria. Abra a primeira válvula para o argônio completamente, transformando-horário. Sempre abrir e fechar esta válvula em primeiro lugar. A segunda válvula controla a pressão de árgon de sopro para o balão. A pressão deve ser sempre suave. </li><li> Baixar o rotavapor em banho de água, suficiente para que o balão ao tocar na água sem ser completamente submerso e girar sobre a velocidade. </li><li> Espere até que todos os clorofórmio evapora, cerca de 10 min. Em seguida, parar a máquina. </li><li> Desligue a velocidade rotavapor e as válvulas do tanque de argônio. Agora, o frasco deve ser removido. </li><li> Adicionar 2 ml de glicose a 5% para pofrasco e para dissolver os lípidos. </li><li> Raspe o fundo do balão, cuidadosamente, com ponta de pipeta de 1 ml para dissolver todos os lípidos. Depois de riscar, remover qualquer lípido remanescente a partir de 1 ml de ponta para o balão, se necessário, com uma segunda ponta. </li><li> Incubar a solução obtida em banho-maria a 42 ° C enquanto lentamente vórtice (15 rpm) ao balão. </li><li> Encha a cuba de ultra-sons com água fria. Sonicate a solução para pelo menos 20-30 min com o frasco levantou e inferior apenas mal contato com a água. </li><li> Aquecer o balão num banho de água do evaporador rotativo durante 20 minutos a 42 ° C, à velocidade zero, com o fundo redondo, imersa em água, este tempo. </li><li> Filtrar os lipossomas através de uma 0,47 micron e, subsequentemente, filtros de seringa de 0,22 micron. </li><li> Usando um pequeno extrusor, filtrar os lipossomas através de uma membrana de 50 nm para gerar uma população homogénea de vesículas lipossómicas unilamelares. </li><li> Transfira os lipossomas para um tubo Eppendorf e colocá-lo em gelo. </li></ol><html> 2. Preparar os lipossomas: siRNA ITSN-1 Complexos <ol><li> Ressuspender o rato no alvo ITSN siRNA siRNA em tampão contendo HEPES 20 mM e cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4, para uma concentração final de 2 mg / mL. Mantê-lo no gelo antes de misturar. </li><li> Preparar os complexos de lipossomas: ITSN siRNA na proporção de 8 nmol de lipossomas: 2 ug de RNA (ou 400 nmol de lipossomas: 100 ug ITSN siRNA). No presente estudo, foram adicionados 50 ul de ITSN siRNA a partir da solução de estoque (50 mM) a 100 ul de lipossomas preparados de fresco utilizando um DNA / RNA-ase livre do tubo de Eppendorf. Note-se que a concentração de ITSN siRNA é muito importante, porque um máximo de 150 ul de mistura pode ser bilateralmente e retro-orbital injectado no rato de uma só vez. </li><li> Manter a mistura em gelo, enquanto espera para injectar os ratinhos. </li></ol> 3. Rato retro-orbital Injection Veia (ângulo interno do soquete do olho) jove_content &quot;&gt; foram aprovados e realizados todos os experimentos com camundongos, de acordo com as diretrizes da Rush University Animal Care Institucional e Comitê de uso. <ol><li> Anestesiar o rato através de injecção intra-peritoneal de um mg / kg de peso 50 corporal de cetamina e 5 mg / kg de peso corporal de xilazina (mistura comercialmente disponível). Dependendo da idade e do peso do animal, ajustar o volume e concentração de anestésicos. Os ratinhos utilizados no estudo os ratinhos são ratinhos CD1 machos, de 6-8 semanas de idade e pesam cerca de 25 gramas. As seringas são um tipo tuberculina ml com agulha acoplada. </li><li> Segurar orelhas de rato com uma mão e transformar o mouse de um lado para expor o ângulo interno do olho. Aponte medial à prega semilunar, evite tocar no globo ocular. </li><li> Approach as caruncle lacrimal do olho, segurando a seringa contendo a mistura em um ângulo de 45 graus em todos os três eixos. </li><li> Injecte lentamente a mistura e deixe o mouse para se recuperar com o lado injetado up. Se um grande líquidaformas de gotas no local de inserção da agulha, retirar a agulha de sucção, de volta a gota dentro da seringa e tente novamente. Injeções repetidas são o melhor feito pela alternância dos olhos, para permitir a recuperação perfeita. Em caso de dúvida, esta técnica pode ser verificada por injecção de tinta azul (50 ul, 0,5% de violeta de cristal em metanol) e expondo os pulmões do rato para observar a vasculatura azul. </li><li> Os ratos no estudo foram injetados cada 3 º dia por 3 semanas sem mortes ou efeitos adversos. </li></ol> 4. Rato de perfusão pulmonar e coleta de tecido para estudos bioquímicos <ol start="0"><li> Conjunto de bomba peristáltica para executar a 1,5 ml / min. </li><li> Prepare o ambiente: ventilador, mesa de operações, instrumentos, cotonetes estéreis, Q-dicas, cordas, copos, água destilada salina balanceada de Hank, tracer. </li><li> Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal do anestésico mistura (100 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina). </li&gt; <li> Ao nível do pescoço, remova as glândulas salivares e expor a traquéia. </li><li> Comece com laparotomia, consumo do diafragma, e seguir com a toracotomia, expondo os pulmões eo coração. </li><li> Remover o timo. </li><li> Usando a microscopia de luz para uma melhor precisão, cateterização da artéria pulmonar. </li><li> Fazer traqueostomia e entubar o mouse usando o traqueostoma. Defina o ventilador a uma taxa de 150 golpes / min e volume de golpe de 150 mL. </li><li> Como saída, abra o átrio esquerdo. </li><li> Perfundir vasculatura do pulmão do rato livre de sangue durante 5 minutos, utilizando a bomba peristáltica e solução de Hank aquecida a 37 ° C. </li><li> Perfundir traçador (8 nm de ouro albumina-16) para 10 min adicionais à mesma taxa de fluxo. </li><li> Lave o traçador não ligado por 5 min de perfusão pulmonar com solução de Hank. </li><li> Siga com a fixação in situ dos pulmões por 10 min de perfusão de 4% (peso / vol) de formaldeído, glutaraldeído a 2,5%, e 1% de ácido tânico 0,1 TUBOStampão a pH 7,2. </li><li> Recolher os pulmões, remover o excesso de tecido, cortar blocos pequenos (3/3 mm), e colocá-los num frasco de cintilação contendo 2 ml rotulados de mistura fixador. </li></ol> Os ratos expirará totalmente anestesiado durante o procedimento. 5. Rato Lung processamento de tecidos para a EM <ol><li> Preparar soluções stock: 1% Palade OsO4, acetato de veronal, e tampão Kellenberger. <ol class="lalpha"><li> - De 1% de OsO-Palade tampão 4 contém: 1 ml de caldo de veronal de etilo, 1,25 ml de 4% de OsO 4, 1 ml de ácido clorídrico 0,1 N, e água destilada até 5 ml de volume final. </li><li> - Solução de acetato de veronal é obtido por dissolução de 1,15 g andydrous acetato de sódio e 2,94 g de derivado do ácido barbitúrico em 100 ml de água destilada. </li><li> Solução-Kellenberger contém 2 ml de acetato de estoque Veronal, 2,8 ml de 0,1 N de ácido clorídrico, 0,05 g de acetato de uranilo, e 5,1 mlde água destilada, pH = 6. </li></ol></li><li> Lave os blocos de pulmão em 0,1 M de cacodilato de sódio, pH = 7,4, resumidamente três vezes. </li><li> Fixar as amostras em 4% (p / v) de formaldeído, 2,5% de glutaraldeído em tampão de 0,1 PIPES, pH 7,2, durante 1 hora, à temperatura ambiente. </li><li> Pós-fix com 1% Palade-ósmio para 1 hora no capô, no gelo, no escuro. </li><li> Lavar uma vez com tampão Kellenberger. </li><li> Incubar as amostras em tampão de Kellenberger durante 2 horas durante a noite, à temperatura ambiente. </li><li> Lavar uma vez em etanol a 50%. </li><li> Desidratam com série gradual de etanol, 5 min / cada um: 70%, 95%, depois 2 x 15 min 100% de etanol. </li><li> Alternar a 100% de óxido de propileno, 2 x 15 min. </li><li> Remover o óxido de propileno e adicionar uma mistura de 50% de óxido de propileno e 50% de Epon 812, incubar durante a noite, em uma roda rotativa, à temperatura ambiente. </li><li> Na manhã seguinte, retire a mistura e adicione Epon fresco 812, pelo menos por 4-5 horas no volante. </li><li> Usando moldes cônicos dobrou, cheiasno meio do caminho com frescos 100% Epon 812, adicionar espécimes selecionados e colocá-los para as bordas. </li><li> Mover os moldes para a incubadora a 60 ° C e deixá-los curar durante 48-72 hr. </li><li> Quando polimerizado, enviar os blocos para ser magra (60-70 nm de espessura) seccionado. </li></ol>

<ol><li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li>
<li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li>
<li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Res.+Int.%22%5BJournal%5D)">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).</li>
<li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs%3A+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li>
<li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome%2FDNA+complexes%3A+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li>
<li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin%3A+more+than+charge+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li>
<li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li>
<li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li>
<li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal%2C+nanoparticle%2C+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li>
<li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacokinetics%2C+tissue+distribution%2C+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating%2C+pegylated+liposomes+%28SPI-077%29+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li>
<li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Com base em estudos anteriores publicadas por outros 9 e nos 1, 18 que desenvolvemos esta metodologia para o longo prazo derrubar de ITSN-1s in vivo pela administração intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 dias consecutivos) de siRNA específico / complexos de lipossomas. Esta abordagem experimental é eficiente, pode ser utilizado de forma segura e repetida e pode ser facilmente estendido para estudar o envolvimento de um gene que codifica toda a proteína de interesse no endotélio...

SiRNA Nu não pode penetrar na membrana da célula, a ser carregada negativamente, e que é facilmente degradado por enzimas no sangue, tecidos e células. Até recentemente, com modificações estruturais para melhorar a estabilidade, a acumulação de siRNA no local alvo depois da administração é extremamente baixo e requer um veículo intracelular eficiente 5. Lipossomas catiónicos emergiu como seguros transportadoras ácidos nucleicos com o potencial de transferência de grandes pedaços de DNA / RNA em células, encapsulando e protegendo os ácidos nucleicos a partir da degradação enzimática 6. Além disso, lipossomas catiónicos interagem espontaneamente com o ADN / ARN, promovendo assim a transferência de genes para as células 2. Mais recentemente, os lipossomas têm sido aplicadas para proporcionar vacinas e os medicamentos de baixo peso molecular 7. Entrega lipossomal de microRNA-7-expressando plasmídeo supera receptor do factor de crescimento epidérmico tirosina-quinase inibidor de resistência em células de cancro do pulmão 8. Quando visando oendotélio vascular, a administração intravenosa é essencial porque os complexos que não são susceptíveis de atravessar a barreira endotelial e extravasamento para o interstício 9. Em comparação com outros órgãos, ECs da microvasculatura do pulmão têm a maior absorção e avidamente internalizar lipossoma catiónico e complexos de ADN / ARN, seguido dos gânglios linfáticos e placas de Peyer 9. Entrega intravenosa em modelos de roedores de siRNA através de injecções veia retro-orbital ou cauda foi provado inofensivos mesmo em concentrações elevadas, tais como 50 mg / kg 10. Na literatura publicada a composição de lipossomas catiónicos é diferente, com base na formulação de lípidos e a sua razão molar 11, 12. Existe uma grande variedade de aplicações potenciais utilizando lipossomas catiónicos para a distribuição de genes in vivo, quer visando down-regulation/over-expression das proteínas, a entrega de vacinas ou de terapias anti-tumorais 13-15. Importante lembraré que a eficiência da interacção de membrana de DNA / RNA celular é regulada pela forma de acoplamento entre os complexos gerados e lípidos de membrana. Isto sugere que a adaptação da composição para os perfis de lípidos da membrana celular alvo pode ser benéfico e resultam em elevadas taxas de transfecção num determinado tipo de célula 6.

<table><tbody><tr><td>Brometo de dimetil dioctadecil amônio (DOAB)</td><td>Estabilizador Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast (miniextrusora)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato, 19 mm de diâmetro, poro de 50 nm</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Sais balanceados de Hank</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de fundo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Mouse siRNAITSN - no alvo </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF digital com cabeça de</td><td></td>bomba RHOO</tr><tr><td>Ventilador</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td><td>Descontinuado pelo fabricante</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de incorporação</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tânico</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm traçador</td><td></td> de ouro-albumina <td>Preparado em laboratório como em16</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Comentários</td></tr><tr><td colspan="4">Equipado com 2 Avestin 1 ml seringas à prova de gás (cat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">SiRNA modificado, in vivo</td></tr><tr><td colspan="4">Parte da IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 Março, Alemanha</td></tr><tr><td colspan="4">Substituído por Embed812, cat. # 14120</td></tr></tbody></table>

silenciando a longo prazo de intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um sirna específico via lipossomos catiônicos. avaliação dos efeitos knockdown por microscopia eletrônica

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Estudos anteriores mostraram que o knockdown de ITSN-1s (KD ITSN), uma proteína envolvida na regulação de endocitose permeabilidade vascular pulmonar e células endoteliais (ECs) a sobrevivência, a morte celular induzida por apoptose, um obstáculo importante no desenvolvimento de um sistema de cultura celular, com períodos prolongados ITSN-1s inibição 1. Usando lipossomas catiônicos como carreadores, exploramos o silenciamento do gene ITSN-1s nos pulmões do rato pela administração sistêmica de siRNA visando ITSN-1 gene (ITSN siRNA). Lipossomas catiônicos oferecem várias vantagens para entrega siRNA: cofre com doses repetidas, não imunogénico, não tóxico, e fácil de produzir 2. Lipossomas desempenho e actividade biológica depende do seu tamanho, carga, a composição lipídica, a estabilidade, a dose e via de administração de 3 Aqui, eficiente e ITSN KD específica em pulmões do rato foi obtida utilizando uma combinação de colesterol dioctadecil brometo de amónio e dimetil. Entrega intravenosade ITSN siRNA / complexos de lipossomas catiônicos transitoriamente derrubado proteína ITSN-1s e mRNA em pulmões de ratos no dia 3, que se recuperou depois de mais 3 dias. Aproveitando os lipossomas catiónicos como um transportador segura repetível, o estudo alargado para 24 dias. Assim, o tratamento retro-orbital com complexos recém-gerados foi administrado a cada 3 dias, induzindo ITSN KD sustentado ao longo do estudo 4. Tecidos de camundongos coletadas em vários pontos tempo ITSN pós-siRNA foram submetidos a análises de microscopia eletrônica (ME) para avaliar os efeitos da crônica KD ITSN, no endotélio pulmonar. High-resolution EM imagens nos permitiu avaliar as alterações morfológicas causadas por KDITSN no leito vascular pulmonar (ou seja, o rompimento da barreira endotelial, diminuição do número de caveolae e regulação positiva de vias de transporte alternativos), características não-detectável por microscopia de luz. Em geral estes resultados estabeleceu um importantetante papel de ITSN-1s na função de ECs e homeostase do pulmão, enquanto que ilustra a eficácia da prestação de siRNA lipossomas in vivo.

Os níveis de proteína ITSN-1s e ARNm foram monitorizadas a vários pontos de tempo após a entrega siRNA ITSN por Western blot e por PCR convencional e quantitativas como no 4. Os níveis de proteína ITSN-1s e ARNm em siRNA ITSN pulmões de ratinho foram tratadas com cerca de 75% menor, por referência aos controlos durante o knockdown contínua de ITSN-1s durante 21 dias. Sem ITSN-1s, dinamina-2, um parceiro importante interagindo de jogador ITSN-1s e essencial no descolamento da caveolae a p...

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os efeitos do bloqueio de longo prazo da expressão da intersectina 1S sobre a estrutura e a função dos pulmões de camundongos. Isso é realizado primeiramente pela preparação de complexos específicos de duplo lipossomo INA para direcionar a vasculatura pulmonar de camundongos como segundo passo. Os complexos lipossomais de INA são administrados por injeção retro-orbital, e esse procedimento é repetido a cada 72 horas durante 24 dias consecutivos para alcançar uma inibição eficiente da expressão da intersectina 1S.A seguir, o tecido pulmonar de camundongos injetados é coletado para análises bioquímicas e levantamentos por microscopia eletrônica, a fim de avaliar os níveis de proteína e de mRNA do intersectina-1 e realizar análises morfológicas extensivas dos pulmões. Os resultados obtidos por meio de western blot de lisados pulmonares com anticorpos específicos contra a intersectina-1 e análises de Q-R-T-P-C-R demonstram uma redução específica e eficiente dos níveis da intersectina-1 por 24 dias consecutivos. A principal vantagem desta técnica em relação às metodologias existentes, como vetores virais ou lentivírus, é que a entrega pulmonar de lipossomos ônicos é reprodutível, segura, não tóxica e altamente eficaz no endotélio pulmonar.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos avaliar os efeitos da interseção de N para baixo in vivo e quando outros métodos de entrega de SRNA não funcionaram. Para preparar lipossomos ônicos, adicione 315 microlitros de uma solução estoque de brometo de dimetil dioctadecilamônio, ou DOAB, a um balão de fundo redondo, seguido por 200 microlitros de solução estoque de colesterol e 9,5 mililitros de clorofórmio, misturando com movimentos de rotação. Conecte o balão ao evaporador rotativo ajustado a 37 graus Celsius e 100 ou mais rotações por minuto.Abra completamente a primeira válvula do argônio girando-a no sentido horário. Sempre abra e feche esta válvula primeiro. A segunda válvula controla a pressão do argônio que entra no frasco.Abra-o parcialmente para garantir pressão suave. Assim que o gelo seco começar a gotejar sobre o tubo que conecta o tanque de gás de Argonne com o evaporador rotativo, abaixe o evaporador rotativo na banho-maria até que o frasco toque a água sem ficar completamente submerso. Aumente o regulador de velocidade para 100 a 120 rpm. Quando todo o clorofórmio no frasco tiver evaporado, desligue a máquina.Regule a velocidade do rotoevaporador para zero e feche as válvulas do tanque de argônio. Remova o frasco. Adicione dois mililitros de uma solução de glicose a 5% ao frasco para ressuspender os lipídios.Usando uma ponteira de pipeta de um mililitro, raspe completamente o fundo do frasco para dissolver todos os lipídios. Incube a solução obtida em banho-maria a 42 graus Celsius por uma hora, agitando lentamente o frasco em vórtex. Sonique a solução por pelo menos 20 a 30 minutos, mantendo o frasco em posição vertical e com o fundo levemente tocando a água fria no banho de ultrassom.Em seguida, aqueça o balão na banho-maria do rotoevaporador por 20 minutos a 42 graus Celsius em velocidade zero, com o fundo redondo imerso na água. Filtre os lipossomos através de um filtro de seringa de 0,47 mícron, seguido por um filtro de seringa de 0,22 mícron. Utilizando um extrusor pequeno, filtre os lipossomos através de uma membrana de 50 nanômetros para gerar uma população homogênea de vesículas lipossomais unilamelares.Transfira os lipossomos para um tubo eppendorf e coloque no gelo. Prepare os complexos de lipossomos com RNA ITSN numa proporção de oito mols de lipossomos para dois microgramas de RNA. Neste exemplo, 50 microlitros de I-A-I-T-S-N.A partir de uma solução estoque de 50 micromolar, adiciona-se a 100 microlitros de lipossomos recém-preparados utilizando um tubo EOR livre de A-R-N-A-D-N-A. Mantenha a mistura em gelo até a injeção nos camundongos. Os camundongos utilizados neste estudo têm entre quatro e seis semanas de idade e pesam cerca de 25 gramas.Confirme com o aperto no dedo do pé que o animal está completamente anestesiado antes da injeção. As seringas utilizadas são seringas tuberculínicas de um mililitro com a agulha fixada com uma mão. Segure as orelhas do camundongo e vire o animal de lado para expor o ângulo interno do olho.Direcione-se medialmente aos semilunares do PIKA e evite tocar o globo ocular. Aproxime-se do canto lacrimal do olho com a seringa carregada em um ângulo de 45 graus em todos os três eixos. Injete lentamente a mistura, devolva o camundongo à sua gaiola e permita que ele se recupere com o lado injetado para cima.Superior. O camundongo é tratado com SIR NA direcionado ao gene ITSN um a cada 72 horas durante 24 dias. Para iniciar este procedimento, verifique se o camundongo está completamente anestesiado pela ausência do reflexo de retirada. Inicie com uma laparotomia e ressecção do diafragma.Em seguida, realize uma toracotomia para expor os pulmões e o coração. Remova o timo utilizando um microscópio StereoZoom para maior precisão. Canule a artéria pulmonar.Em seguida, realize uma traqueostomia e entube o camundongo utilizando o estoma traqueal. Ajuste o ventilador para uma frequência de 150 movimentos por minuto e um volume corrente de 150 microlitros. Como saída, abra o átrio esquerdo usando uma bomba peristáltica ajustada em 1,5 mililitro por minuto e solução de Hank aquecida a 37 graus Celsius.Perfunda a vasculatura pulmonar de camundongo livre de sangue durante cinco minutos, seguido por perfusão com o marcador por 10 minutos. Após lavar o marcador não ligado, realize a fixação in situ dos pulmões por meio de perfusão de 10 minutos com formaldeído 4%, glutaraldeído 2,5% e ácido tânico 1%. Colete os pulmões e remova o tecido em excesso.Corte os pulmões em blocos pequenos e transfira-os para um frasco de cintilação rotulado contendo dois mililitros de uma mistura fixadora. Para iniciar o processamento do tecido pulmonar para microscopia eletrônica, lave brevemente os blocos pulmonares três vezes em tampão de citato de sódio 0,1 molar.Em seguida, fixe os espécimes em aldeído 4% e glutaraldeído 2,5% em tampão 0,1 Pipee por uma hora à temperatura ambiente, pós-fixando com 1% de osmio patilado por uma hora na capela sobre gelo, no escuro, após uma lavagem com tampão Callen burger. Incube os espécimes em tampão Callen burger por duas horas até a noite seguinte à temperatura ambiente. Lave uma vez em etanol 50% e, em seguida, desidrate com uma série graduada de etanol.70% etanol por cinco minutos, 95% etanol por cinco minutos e depois duas vezes em 100% etanol por 15 minutos cada. Em seguida, troque para 100% óxido de propileno. Realize duas incubações de 15 minutos.Remova o óxido de propileno e adicione uma mistura de 50% de óxido de propileno e 50% de epon. Incube durante oito a doze horas durante a noite em rotação em roda a temperatura ambiente. Na manhã seguinte, remova a mistura e adicione epon fresco. Incube por oito a doze horas por pelo menos quatro a cinco horas na roda.Adicione os espécimes selecionados a moldes duplamente cônicos preenchidos até a metade com Epon 100% fresco oito 12. Coloque-os nas bordas, transfira os moldes para uma estufa a 60 graus Celsius e deixe curar por 48 a 72 horas. A inibição crônica da expressão da ITSN um s por 21 dias consecutivos mediante administração repetida de complexos de siRNA da ITSN um s com lipossomos resulta em níveis significativamente mais baixos da proteína ITSN um nos pulmões de camundongos, conforme mostrado nestes resultados representativos aqui; lisados pulmonares de um controle não tratado e de camundongos tratados foram submetidos à imunoblotagem com anticorpos contra ITSN um e actina em vários pontos temporais após a administração do siRNA, conforme indicado.A análise demétrica de filmes representativos de blot CL alto e a R-T-P-C-R quantitativa do mRNA de I TSN um s confirmam ainda que o tratamento com complexos de lipossomos de siRNA de I TSN um s regula eficientemente para baixo a proteína I TSN um s nos pulmões de camundongos. A diminuição nos níveis de intersectina um leva à endocitose deficiente, à disruptura do transporte endotelial e à barreira interendotelial, bem como ao edema pulmonar. Essas micrografias eletrônicas representativas de tecido pulmonar mostram junções interendoteliais abertas, ou JIs, marcadas ao longo de seu comprimento por partículas de albumina douradas de oito nanômetros.O painel A um é uma ampliação do painel A, cujas setas indicam três a quatro partículas de albumina dourada localizadas próximas umas das outras no mesmo plano, indicando a abertura ampla do IEJ. Partículas douradas também estão associadas à saída abluminal dos IJs, indicada pelas setas nos painéis A um e B. Observe também o número limitado de CVE A e a dilatação do espaço pericapilar indicada pelo asterisco no painel, um downregulação aguda da expressão de intersectina, com ativação de vias alternativas de transporte para compensar a endocitose deficiente.Essas imagens de ME mostram anéis membranosos nos painéis A e A', tubos pleomórficos no painel B e endossomos aumentados fundidos com cve LA típica no painel C, ativamente envolvidos na captação e transporte de albumina dourada. Também são observadas uma acentuada dilatação do espaço perivascular e edema proteínaceo. A inibição prolongada da expressão de intersectina por 24 dias reduz o edema pulmonar em camundongos, restaurando parcialmente a integridade da barreira interendotelial.Estudos morfológicos por ME mostraram que o traçador de ouro albumina de oito nanômetros não pôde penetrar na IEJ neste ponto temporal, formando em vez disso resíduos de filtração na abertura luminar da junção, indicados pela seta. No entanto, os espaços perivasculares ou PVS mostraram alguma dilatação e edema leve, sugerindo que as junções são impermeáveis a partículas desse tamanho, mas ainda assim corpos multivesiculares ou MVB próximos à membrana plasmática possuem algumas de suas vesículas internas marcadas por partículas de ouro albumina de oito nanômetros. Esta tabela mostra o número de estruturas transcitoplasmáticas endocíticas em endotélio pulmonar de camundongos controle e deficientes.Uma descoberta significativa é a diminuição de cavi, um número no endotélio pulmonar de camundongos deficientes em ITSN1. A inibição crônica da expressão de intersectina 1 causou a ativação de vias citoplasmáticas endocíticas alternativas e parcialmente cavi, um número, a quantidade de anéis ou túbulos membranosos marcados por partículas de ouro com albumina. No endotélio pulmonar de camundongos deficientes cronicamente em I Tsn1, o número também aumentou 14 vezes em comparação com os controles.Após este procedimento, outros métodos, como o Eliza, podem ser aplicados a lisados de pulmão de camundongo para estimar quantitativamente o transporte transendotelial de diferentes traçadores hnic. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como entregar especificamente complexos de lipossoma ônico e SRNA ao endotélio pulmonar de camundongo, com o objetivo de silenciar a proteína de interesse e avaliar sua função.

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Biology

Biologia

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Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

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