Name: GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a purificação de proteínas recombinantes usando cromatografia de afinidade em duas etapas com tags GST e His em células SF9. Este método eficiente produz proteínas de alta pureza e solubilidade para estudos bioquímicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Anne-Marie Dion-Cote para discussões que levaram ao desenvolvimento do método. JK e RB são FQNRT estudiosos de doutorado, M.-MG é um estudioso Vanier CIHR e J.-YM é pesquisador sênior FRSQ. Este trabalho foi apoiado por fundos de Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa de Engenharia de JY. M.

1. Produção de recombinante de baculovírus Os baculovírus são gerados utilizando o Sistema de Expressão de Baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen, principalmente de acordo com o protocolo do fabricante, com apenas ligeiras modificações: <ol><li> Um vetor pFastBac1 modificado (Gibco, a vida) foi criado contendo o GST e Seus-tags (Figura 2). O local de clonagem múltipla (MCS) de pET-52b (+) vector (Novagen), que contém uma etiqueta 10xHis, foi inserido no mcs de um vector pFastBac1 para gerar pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de MCS pET-52b (+) foi amplificado por PCR entre os locais de restrição Xbal e BlpI, a adição de um local de restrição de BglII no terminal 5 &#39;da extremidade e um local de restrição Hind III na extremidade 3&#39;. O produto de PCR foi então clonado entre BamHI e HindIII sítio de restrição de pFastBac1, usando a compatibilidade de sequências de restrição de BamHI e BglII. Uma vez que o objetivo era gerar um pFastBac1 permitindo a expressão deproteína recombinante com estreptavidina-e 10xHis-tags, o sítio de restrição BamHI de pET-52b (+) sequência de MCS não foi utilizado. Além disso, o sítio de restrição XbaI não foi usado para evitar a redundância de sítios de restrição que ocorrem entre os sites que já estão no MCS de pFastBac1 e estes inserido com o MCS de pET-52b (+). A sequência de codificação de GST com o local de reconhecimento PreScission Protease (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) foi então inserido no pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de cDNA a partir de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) foi amplificado por PCR com iniciadores que contêm sítios de restrição Ncol e Kpnl na extremidade 5 &#39;e 3&#39; das extremidades, respectivamente. O local Ncol permite a adição de um codão de iniciação, mas também uma alanina para o GST. O produto de PCR foi então clonado no pFastBac1-Strep-10xHis entre os sítios de restrição Ncol e Kpnl, resultando na deleção da etiqueta de estreptavidina. O novo vetor de fusão assim obtido foi denominado pFastBac1-GST-10xHis. </li><li> Clonar o cDNA codificante para a protein de interesse no vector pFastBac-GST-10xHis entre a GST (N-terminal) e a cauda de His (C-terminal). Ter cuidado para remover o codão de terminação para permitir que o cDNA de fusão com o His-tag no terminal C. </li><li> Transforme E. coli DH10Bac com o pFastBac recombinante (obtida no passo 1.2) para gerar o bacmid. Permitir que as colónias crescer durante a noite a 37 ° C e várias horas a 30 ° C em placas de selecção contendo Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 7 ug / ml de gentamicina, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml de IPTG). </li><li> Escolha e restreak duas colônias brancas (a partir do passo 1.3) em placas de seleção para confirmar o fenótipo branco. </li><li> Inocular 2 ml de LB contendo 10 ug / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 10 mg / ml de gentamicina, com as duas colónias brancas a partir do passo 1.4 e deixá-los crescer durante a noite, sob agitação (250 rpm) a 37 ° C. </li><li> A fim de purificar o ADN de bacmid, sedimentar as bactérias do passo 1.5,ressuspender as células em 300 uL de solução I e adicionar 300 mL de solução II (kit Maxiprep da Qiagen). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, adicionar 300 mL de 3 M KOAc, pH 5,5 e incubação durante 10 min em gelo. Centrifugar as amostras a 4 ° C, a velocidade máxima durante 10 min. Adicionar 800 mL de isopropanol para os sobrenadantes e incubar por 10 min em gelo. Centrifugar as amostras durante 15 min a 4 ° C e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Deixar o sedimento secar e ressuspender o sob condições estéreis, em 40 ul de Tris-EDTA a pH 8,0. O ADN de bacmid deve ser armazenada a 4 ° C. </li><li> Gerar baculovírus, conforme descrito no protocolo do fabricante. Os baculovírus pode ser armazenado a 4 ° C protegidos da luz. </li></ol> 2. Recombinant Protein Expression <ol><li> De modo a escolher o baculovírus mais eficiente para a purificação e para controlar o tempo do pico da expressão da proteína é alcançada, execute um mini-ensaio de uma infecçãos seguintes: Infect 2 x 10 7 de Sf9 infectadas células cultivadas a 27 ° C em meio de Grace (complementado com SBF a 10% e 1% P / S) com 133 ul (1/150) de baculovírus. Recolhe alíquotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, e 72 horas pós-infecção. Sedimentar as células e analisar o nível da proteína de interesse por western blotting utilizando anticorpos anti-tag de expressão. </li><li> Use o baculovírus mais eficiente a partir do passo 2.1 para infectar um spinner contendo 1,0 x 10 6 células Sf9 por ml em 500 ml de mídia com uma proporção de 1/150 entre o vírus e meios de comunicação. Permitir que as células infectadas crescer em suspensão a 27 ° C e colheita das células, quando a expressão máxima de proteína (como determinado no passo 2.1 acima) é alcançado. As células sedimentadas podem ser armazenadas a -80 ° C até posterior utilização. </li></ol> 3. Preparação de Lisado celular solúvel Todos os seguintes passos de incubação são realizados a 4 ° C sob rotação suave. <ol><li> Lyse SAs células que expressam f9 sua proteína de interesse, em ~ 20 ml de tampão de ligação de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, DTT 1 mM em PBS1X para uma concentração final de NaCl de 250 mM, e inibidores da protease cocktail (Roche). Num banho de água gelada, a solução 20x Dounce com um homogeneizador de Dounce, sonicado 3x 30 segundos cada (produção de 70%), e novamente Dounce 20x. </li><li> (Opcional). Incubar o ligado total de células com 1 mM de MgCl 2 e 7 nuclease Benzonase (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para remover o ADN de contaminação ou de ARN. </li><li> Centrifugar a 18.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante. </li><li> (Opcional). Centrífuga-se o sobrenadante de novo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obter um lisado solúvel claro. Passar o sobrenadante através de um filtro de 0,2 ou 0,45 mM para evitar o entupimento. </li></ol> 4. Ligação da proteína em GST Beads <ol><li> Incubar o ligado celular solúvel com 1 ml de pérolas de GST (pré-lavado duas vezes com10 ml de tampão GST) de ligação, durante 1 hora a 4 ° C, sob suave rotação. </li></ol> Comentário: O tempo de incubação deve ser optimizado de acordo com a estabilidade da proteína e eficiência de ligação. <ol start="2"><li> Rotação rápida a 700 rpm e remover o sobrenadante contendo as proteínas não ligadas (o que pode ser mantido para uma análise mais aprofundada). Lavar as proteínas ligadas a GST (Figura 3B, pista 1) com tampão de lavagem de GST (GST com tampão de ligação NaCl 350 mM final). </li><li> Repita o passo 4.2 2x. Na última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível. </li><li> Incubar os grânulos com 5 mM de ATP e 15 mM de MgCl 2 (em 10 ml de tampão de ligação a GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar ligação não específica de proteínas de choque de calor 8. Lavar as pérolas três vezes com tampão de lavagem de GST. </li></ol> 5. PreScission clivagem do GST <ol><li> Centrifugar as esferas de GST, remover o sobrenadante e lavar as contas de GST com P5 buffer (50 NaHPO 4 mM pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM de imidazole). </li><li> Incubar as GST-esferas com enzimas PreScission, em tampão P5 a partir de 3 horas a durante a noite a 4 ° C. (Dividir as esferas de GST em fracções de 100 mL e adicionar 4-8 unidades (2-4 ul) de enzima diluído em 100 ul de tampão de P5). </li></ol> Comentário: O tempo de incubação do passo PreScission precisa ser optimizada de acordo com o peso molecular, assim como a estabilidade da proteína. Se se observar degradação, este tempo de incubação pode ser reduzido até um mínimo de 2 horas em vez de durante a noite. <ol start="3"><li> Rotação rápida e recolher o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes depois de adicionar 100 ml de P5 de tampão aos grânulos e reunir todas as fracções (Figura 3B, pista 2). </li></ol> Comentário: Os restantes grânulos pode ser usada para a análise de eficácia de clivagem (Figura 3B </strong&gt;, pista 3). Normalmente, 70-80% da proteína é clivada. 6. Para TALON metal Affinity Resin-A ligação às proteínas <ol><li> Divide-se a eluição a partir de cima em 3 fracções de 1 ml e incubar cada uma com 100 de resina de afinidade com metal Talon grânulos secos ul (pré-lavado duas vezes com tampão de P5) durante 1 hora sob rotação. </li></ol> Comentário: Dividindo a eluição em várias frações aumenta a eficiência de ligação / lavagens. <ol start="2"><li> Lava-se a resina 5 min com tampão de P30 (P5 tampão com uma concentração final de 30 mM de imidazol). </li><li> Repita o passo 6.2 2x e reunir as contas em um único tubo. Antes da última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível. </li></ol> Comentário: Isto corresponde à amostra ligado GARRA (Figura 3B, pista 4). 7. A eluição da proteína purificada <ol><li> Incubar a resina TALON proteína ligada por 5 min sob rotação com P500 tampão (tampão P5 com uma concentração final de 500 mM de imidazol). Use uma proporção entre o buffer e gotas de 1:1 v / v (Por exemplo, se você tivesse tomado 200 mL de contas secas, você terá que adicionar 200 mL de P500). Repetir este passo duas vezes e manter cada fracção eluída separadamente (chamado de eluição 1 (E1), eluição 2 (E2) e eluição 3 (E3) e a figura 3B, pistas 5-7). </li></ol> Comentário: Os grânulos restantes podem ser utilizados para análise de eficiência de eluição (Figura 3B, pista 8). Tipicamente, 60-80% da proteína é eluída no total. <ol start="2"><li> Analisar a quantidade e qualidade da sua proteína purificada por carregar aproximadamente 20-40 ul de cada fracção com uma concentração padrão de BSA em SDS-PAGE e mancha com azul de Coomassie (Figura 3B) ou SYPRO mancha de proteína para visualização. </li></ol> Comentário: A proteína de interesse pode também ser detectado throughout o procedimento de purificação utilizando anticorpo anti-GST e anti-Seus anticorpos (figura 3C). 8. Armazenamento da Proteína Purificada <ol><li> Dializar a proteína purificada contra um tampão de armazenamento adequado (por exemplo, 20 mM de Tris-Acetato, pH 8,0, KAc 200 mM, Glicerol a 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. É importante verificar a precipitação de proteína purificada durante a diálise. Nós normalmente dialisar 2x durante 1 hora a 4 ° C, sob agitação de rotação. </li><li> Fazer pequenas aliquotas de proteína purificada (10-20 mL) e congelam-se em gelo seco durante 30 min. Armazenar as alíquotas a -80 ° C e evitar muitos ciclos de congelamento / descongelamento. </li></ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
<li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li>
<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

A GST-His protocolo de purificação aqui apresentada é adequada para a purificação de uma ampla gama de tamanhos de proteínas recombinantes: Foram purificados com sucesso Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e um alto teor de proteína de peso molecular de instável Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Além disso, as proteínas purificadas com este protocolo foram bioquimicamente ativo 6. O sucesso deste método depende unicamente da expressão, solubilidade e esta...

A purificação de proteínas recombinantes é crucial para tratar de questões fundamentais em bioquímica. As formas convencionais de purificação de proteínas, como a cromatografia de permuta iónica e cromatografia de exclusão de tamanho dependem de propriedades físicas da proteína-alvo, tais como o seu ponto isoeléctrico e carga ou tamanho, respectivamente. As características da proteína últimos são partilhados por uma variedade de proteínas, o que aumenta consideravelmente a probabilidade de as proteínas contaminantes, em estratégias de purificação de proteínas convencionais. Este problema pode ser contornado com o uso de várias colunas de purificação, o que é demorado. Ao mesmo tempo, os últimos métodos de cromatografia de exigir configuração experimental caro. A purificação por afinidade-tag aumenta fortemente a especificidade do alvo, tal como na maioria dos casos, a marcação será único para a proteína de interesse. Em estudos recentes, com Flag ou HA-purificação de afinidade tem sido amplamente usado. Em contraste com rec existenteprotocolos de purificação de proteínas ombinant em que tags simples são utilizados, foi estabelecida a combinação única de duas tags. O nosso método envolve a fusão de uma etiqueta de GST na extremidade N-terminal e uma cauda de His no terminal C da proteína de interesse, para uma óptima relação entre a quantidade e pureza da proteína desejada. A GST é uma marca longa (29 kDa), que é altamente eficiente para a purificação sobre Sepharose de glutationa. Além disso, utilizando GST garante boa relação custo-eficácia de nosso método 1. A possibilidade de se clivar a GST com o enzima PreScission (com a sequência de reconhecimento LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, resultando na adição de apenas dois aminoácidos) tem muitas vantagens, por exemplo, esta estratégia evita a alteração das funções fisiológicas de proteínas devido a impedimento alostérico. O pequeno His-tag fundido com o outro extremo da proteína serve num segundo passo de purificação para aumentar a pureza da proteína por lavando a GST clivada, bem como proteínas degradadas e outros<html> contaminantes. Além disso, o protocolo não requer um passo de diálise quando se muda de GST para a coluna passo His-purificação (resina TALON). Contaminantes comuns em tais processos de purificação são proteínas de choque térmico (HSP). A adição de um passo de incubação com MgCl2 e ATP permite a remoção desses contaminantes (Figura 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) são técnicas comuns que dependem instrumentação dispendiosa para gerar um rendimento elevado de proteína purificada de interesse. O protocolo de purificação de lote apresentamos aqui, em contraste, é manual e não necessita de uma instalação instrumental caro. Um rendimento elevado de proteína pode ser alcançado com a expansão do protocolo. Ao mesmo tempo, com o protocolo de purificação do lote, o volume de eluição pode ser ajustada, a fim de aumentar a concentração de proteína, o que não é dada com FPLC ou HPLC. ntent &quot;&gt; Além disso, com a GST-His protocolo de purificação do lote, proteínas com uma gama de dimensões de ~ 10-300 kDa pode ser purificada. Uma das maiores vantagens é dada pelo facto de que se pode purificar várias proteínas ao mesmo tempo , por exemplo, tanto um de tipo selvagem e a sua proteína mutante. O sucesso do protocolo apresentado apenas depende do nível de expressão e a solubilidade da proteína de interesse.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (competente)</td>Sistema de Expressão de Baculovírus <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Bac-to-Bac</td><td>Kit</td></tr> de <tr><td>Preparação Maxi</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solução I e II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td> Células infectadas <td>com Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de pré-cisão</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>meio infectado de Grace suplementado</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovino caracterizado</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicilina-estreptomicina)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa Resina de Sepharose</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Resina Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Produção interna</td><td></td><td></td>de anticorpos GST</tr><tr><td>6X-His monoclonal</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce homogeneizador (apertado)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td>Bolsa de diálise <td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>(50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

gst-sua purificação: a two-step affinity purification protocolo cedendo full-length proteínas purificadas

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Ensaios de chave em enzimologia para a caracterização bioquímica de proteínas in vitro, necessitam de elevadas concentrações de proteína purificada de interesse. Protocolos de purificação de proteína deve combinar eficiência, simplicidade e eficácia de custo 1. Aqui, nós descrevemos a GST-His método como um novo sistema de purificação por afinidade em pequena escala para as proteínas recombinantes, com base em um N-terminal de etiqueta de glutationa-Sepharose (GST) de 2,3 e uma marcação 10xHis C-terminal de 4, que são ambos fundida para a proteína de interesse. A última construção é usado para gerar baculovírus, para a infecção de células Sf9 infectadas para a expressão da proteína 5. GST é uma marca bastante longo (29 kDa), que serve para garantir a eficiência da purificação. No entanto, pode influenciar as propriedades fisiológicas da proteína. Por isso, é subsequentemente clivado da proteína usando a enzima PreScission 6. A fim de assegurar a máxima pureza e para remover a GST clivada, nósadicionou-se uma segunda etapa de purificação por afinidade com base na comparativamente pequena de His. Mais importante, a nossa técnica é baseada em duas etiquetas diferentes flanqueiam as duas extremidades da proteína, que é uma ferramenta eficaz para remover as proteínas degradadas e, portanto, enriquece proteínas de comprimento total. O método aqui apresentado não requer uma configuração instrumental caros, tais como FPLC. Além disso, incorporamos MgCl2 e lavagens de ATP para remover impurezas da proteína de choque térmico e tratamento nuclease abolir contaminando ácidos nucléicos. Em resumo, a combinação de duas marcas diferentes flanqueiam o N-e C-terminal e a capacidade para clivar um dos marcadores, garante a recuperação de uma proteína altamente purificada e de comprimento completo de interesse.

A fim de ilustrar a eficácia da GST-His protocolo de purificação, que purificado Rec14, um S. pombe proteína de 32,9 kDa. O Rec14 cDNA foi clonada no nosso vector pFastBac1 modificado permitindo a adição de GST-e Seus-tags no N-e C-terminais, respectivamente, (Figura 1A). Baculovírus recombinantes foram então preparados e utilizados para infectar células SF9 infectadas para a expressão da proteína. Os lisados ​​celulares solúveis foram incubados com contas de GST e proteínas ligadas foram eluíd...

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter uma proteína de interesse altamente purificada e de comprimento completo. Isso é alcançado pela produção de um vírus recombinante bao, que é usado para infectar células de inseto SF nine, a fim de obter uma versão altamente expressa e solúvel da proteína de interesse com duas marcações. Em seguida, realiza-se uma purificação por afinidade em duas etapas, caracterizada pela purificação da proteína marcada com glutationa S-transferase, seguida por cromatografia de afinidade por metal.O resultado da purificação é uma proteína marcada com histidina altamente pura. Em seguida, as amostras de proteína purificadas são submetidas à diálise para garantir baixas concentrações de sal no tampão de armazenamento. Os resultados obtidos demonstram a solubilidade, quantidade e qualidade da expressão da proteína com base na coloração total de proteína em um gel de eletroforese SDS-PAGE.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando enfrentamos dificuldades para purificar proteínas grandes e instáveis, como PAL B dois e BOC dois. Assim, a principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a purificação por afinidade em

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução...

 Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Neste vídeo, demonstramos a técnica de cromatografia de afinidade de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinase marcadas com histidina da bactéria Clostridium difficile.

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificação de proteínas recombinantes usando cromatografia de afinidade em duas etapas com tags GST e His em células SF9. Este método eficiente produz proteínas de alta pureza e solubilidade para estudos bioquímicos.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Explorar mais vídeos