GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

O objetivo geral do experimento a seguir é obter uma proteína de interesse altamente purificada e de comprimento completo. Isso é alcançado pela produção de um vírus recombinante bao, que é usado para infectar células de inseto SF nine, a fim de obter uma versão altamente expressa e solúvel da proteína de interesse com duas marcações. Em seguida, realiza-se uma purificação por afinidade em duas etapas, caracterizada pela purificação da proteína marcada com glutationa S-transferase, seguida por cromatografia de afinidade por metal.

O resultado da purificação é uma proteína marcada com histidina altamente pura. Em seguida, as amostras de proteína purificadas são submetidas à diálise para garantir baixas concentrações de sal no tampão de armazenamento. Os resultados obtidos demonstram a solubilidade, quantidade e qualidade da expressão da proteína com base na coloração total de proteína em um gel de eletroforese SDS-PAGE.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando enfrentamos dificuldades para purificar proteínas grandes e instáveis, como PAL B dois e BOC dois. Assim, a principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a purificação por afinidade em um único passo, é que, no nosso protocolo de purificação por afinidade em dois passos, a proteína obtida é altamente pura e geralmente livre de produtos de degradação. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área da biologia de proteínas, como as funções bioquímicas de proteínas recombinantes purificadas.

Este protocolo inicia com a produção do vírus recombinante bao, seguida pela seleção do vírus BA mais eficiente, conforme descrito no protocolo textual para infecção. Prepare um frasco de cultura agitado contendo entre 0,75 e 1,0 vezes 10 à sexta potência de células SF nine em 500 mililitros de meio, com uma proporção de um para 150 entre vírus e meio. Coloque o frasco agitado sob uma cabine de cultura celular e infecte as células adicionando o volume necessário de suspensão de vírus baula na suspensão celular através de um braço do frasco agitado.

Deixe as células infectadas crescerem em suspensão a 27 graus Celsius e recolha as células quando a expressão máxima da proteína for alcançada, o que é determinado ao escolher o vírus macular mais eficiente. Após a coleta das células, lise as células SF9 que expressam a proteína de interesse em aproximadamente 20 mililitros de tampão de ligação GST, suplementado com inibidores de protease, em banho de gelo. Homogeneíze a solução 20 vezes com um homogeneizador Dounce, em seguida sonique por três ciclos de 32 segundos e, depois, homogeneíze novamente 20 vezes. Em seguida, centrifugue o lisado celular a 18.000 RPM durante 30 minutos a quatro graus Celsius e mantenha o sobrenadante. Incube o lisado celular solúvel com um mililitro de perlas GST pré-lavadas por uma hora a quatro graus Celsius sob rotação suave.

O tempo de incubação deve ser otimizado de acordo com a estabilidade da pró e eficiência de ligação após a ligação. Fazer uma centrifugação rápida a 700 RPM e remover o sobrenadante contendo proteínas não ligadas. Lavar as proteínas ligadas à GST com o tampão de lavagem GST.

Repita este processo duas vezes após a última lavagem. Remova o máximo de sobrenatante possível. Em seguida, incube as microesferas com ATP cinco milimolar e cloreto de magnésio 15 milimolar em 10 mililitros de tampão de ligação GST durante uma hora a quatro graus Celsius para evitar a ligação não específica de proteínas de choque térmico após a incubação.

Lave as esferas três vezes com tampão de lavagem GST. Após a centrifugação das esferas GST e remoção do sobrenadante, lave as esferas GST com tampão P cinco. Em seguida, divida as esferas GST em frações de 100 microlitros e adicione quatro a oito unidades da enzima de precisão diluídas em 100 microlitros de tampão P cinco.

Incube as microesferas de GST com a enzima por três horas até a noite toda a quatro graus Celsius sob rotação suave. O tempo de incubação deve ser otimizado de acordo com o peso molecular e a estabilidade da proteína após a clivagem. Faça uma centrifugação rápida e colete o sobrenadante.

Adicione 100 microlitros de tampão P cinco às esferas. Em seguida, repita, centrifugue e colete o sobrenadante duas vezes. Recolha todas as frações.

Divida o EIT em três frações de um mililitro e incube cada uma com 100 microlitros de esferas secas de resina de afinidade metálica Talon pré-lavadas por uma hora sob rotação, dividindo a eluição em várias frações, o que aumenta a eficiência de ligação e de lavagem. Em seguida, lave a resina por cinco minutos com tampão P 30 a quatro graus Celsius com rotação suave. Após repetir a lavagem duas vezes, reúna as esferas em um único tubo para eluir a proteína purificada.

Adicione o tampão P 500 à resina Talon com proteína ligada. Adicione um tampão na proporção de um para um em volume em relação às perlas. Incube a suspensão por cinco minutos sob rotação.

Repita este passo duas vezes, mantendo cada fração eluída separada para o armazenamento da proteína purificada. Dialise a proteína contra um tampão de armazenamento apropriado duas vezes por uma hora a quatro graus Celsius sob agitação.

É importante verificar a precipitação da proteína purificada durante a diálise. Faça alíquotas pequenas da proteína purificada e congele em gelo seco por 30 minutos. Armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius e evite múltiplos ciclos de descongelamento e congelamento.

Analise o processo de purificação carregando aproximadamente 20 a 40 microlitros de cada fração em um gel de eletroforese SDS-PAGE. Após a corrida do gel, corar com azul de Kumasi ou corante para proteína para visualização; os lisados celulares solúveis e totais de células SF nine infectadas com o vírus valo recombinante REC 14 ou não infectadas como controle foram analisados por meio da coloração com azul de Kumasi, permitindo a confirmação da expressão da proteína GST re 14 his durante o processo de purificação. Muitas amostras foram analisadas para acompanhar a eficiência do método, sendo que a análise dessas amostras foi realizada com azul de Kumasi.

A coloração mostra que durante o primeiro passo da purificação, GST Rec 14 foi corretamente ligado às perolas de GST com um peso molecular aparente de aproximadamente 50 quilodaltons, devido à fusão de rec 14 com GST após clivagem de precisão com G-S-T-G-S-T; rec 14 hiss livre migra em torno de 37 quilodaltons. Embora a GST clivada possa ser visualizada nas perolas de GST, apesar de uma fração de GST livre de REC 14 que ainda permanece ligada às perolas de GST, obteve-se um enriquecimento notável de REC 14 hiss. Este passo poderia ser aprimorado aumentando o tempo de incubação da proteína com a protease de precisão. A análise de REC 14 hiss ligado a perolas Talon em comparação com as proteínas eluídas após a etapa de purificação por GST mostra que uma grande fração de REC 14 hiss está ligada às perolas Talon.

Após várias lavagens, o rec 14 hiss foi eluído e coletado, realizando-se três ilusões. A análise revelou alta pureza do rec 14 hiss e a maior concentração do rec 14 hiss na primeira comparação de eluição das frações eluídas com as perlas de talão após a eluição ilustrar a eficiência da ilusão. Uma vez que pouco rec 14 hiss pode ser detectado como ligado às perlas.

Essas amostras também foram submetidas à análise sanguínea por Western blot com anticorpos anti-GST e anti-hiss para acompanhar o REC 14. Ao longo do procedimento, o blot anti-GST mostra que algumas proteínas GS TRE 14 e GST isolada estavam presentes nas proteínas obtidas na etapa de purificação por GST e que os contaminantes foram removidos pela etapa de purificação por afinidade com a marcação hiss. Esse blot revela que a GST foi eficientemente removida da re 14 pelo tratamento de precisão e pela etapa de purificação com a marcação hiss.

O anti hiss blot tem como objetivo detectar a Re 14. Esse blot confirma que o GST Rec 14 hiss e o REC 14 hiss não foram clivados e removidos completamente dos grânulos de GST. Além disso, em alta concentração, o REC 14 parece se agregar.

Em resumo, os resultados apresentados demonstram a eficiência da purificação por GST hiss para a obtenção da proteína recombinante S palm B rec 14. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como recuperar uma proteína recombinante altamente purificada.

Essa técnica pode ser realizada em 12 horas após a degeneração do ácido lísico solúvel, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e rigorosamente a quatro graus Celsius para evitar a degradação proteica após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de co-precipitação ou espectrometria de massas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a identificação de parceiros proteicos ou modificações pós-traducionais da proteína de interesse.

Embora utilizemos este método para DNA, a estratégia de proteínas de reparo poderia ser modificada para estudar a função de proteínas em outras áreas de pesquisa.