GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

O objetivo geral do experimento a seguir é obter uma proteína de interesse altamente purificada e de comprimento total. Isso é conseguido produzindo um vírus bao recombinante, que é usado para infectar células de insetos SF nove, a fim de obter uma versão altamente expressa e solúvel de duas marcas da proteína de interesse. Uma purificação de afinidade em duas etapas é então realizada, caracterizada pela purificação da glutationa, proteína marcada com soro, seguida de cromatografia de afinidade de metal.

O resultado da purificação é uma proteína marcada com histidina altamente pura. Em seguida, as amostras de proteínas purificadas são dialisadas para garantir baixas concentrações de sal no tampão de armazenamento. São obtidos resultados que mostram a solubilidade da expressão, quantidade e qualidade da proteína com base na coloração de proteína inteira de um gel de página SDS.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando tivemos problemas para purificar proteínas grandes e instáveis, como PAL B dois e BOC dois. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a purificação por afinidade em uma etapa, é que em nosso protocolo de purificação por afinidade em duas etapas, a proteína obtida é altamente pura e geralmente livre de produtos de degradação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia de proteínas, como funções bioquímicas de proteínas recombinantes purificadas.

Este protocolo começa com a produção do vírus bao recombinante, seguido pela seleção do vírus BA mais eficiente, conforme descrito no protocolo de texto para infecção. Prepare um vaso de cultura giratório contendo entre 0,75 a 1,0 vezes 10 a seis células SF nove em 500 mililitros de meio com uma proporção de um para 150 entre o vírus e o meio. Coloque o spinner sob um capuz de cultura de células infecte as células adicionando o volume necessário de suspensão do vírus baula à suspensão celular através de um braço do spinner.

Deixe as células infectadas crescerem em suspensão a 27 graus Celsius e colha as células quando a expressão máxima da proteína for atingida, que é determinada ao escolher o vírus macular mais eficiente. Após a coleta de células, lice nove células que expressam a proteína de interesse em aproximadamente 20 mililitros de tampão de ligação GST, suplementadas com inibidores de protease em banho de água gelada. Desça a solução 20 vezes com um homogeneizador descendente e depois sonice por três 32º ciclos antes de dançar novamente 20 vezes em seguida, centrifugue o lisado celular a 18.000 RPM por 30 minutos a quatro graus Celsius e mantenha o sobrenadante incubar o lisado de células solúveis com um mililitro de grânulos GST pré-lavados por uma hora a quatro graus Celsius sob rotação suave.

O tempo de incubação deve ser otimizado de acordo com a estabilidade do pro e a eficiência de ligação após a ligação. Gire rapidamente a 700 RPM e remova o sobrenadante contendo proteínas não ligadas. Lave as proteínas ligadas ao GST com tampão de lavagem GST.

Repita este processo duas vezes após a última lavagem. Remova o máximo de sobrenadante possível. Em seguida, incube as esferas com cinco milimolares A TP e 15 milimolares de cloreto de magnésio em 10 mililitros de tampão de ligação GST por uma hora a quatro graus Celsius para evitar a ligação não específica de proteínas de choque térmico após a incubação.

Lave as contas três vezes com tampão de lavagem GST. Depois de centrifugar os grânulos GST e remover o sobrenadante, lave os grânulos GST com tampão P cinco. Em seguida, divida as esferas GST, infrações de 100 microlitros e adicione quatro a oito unidades de enzima de precisão diluídas em 100 microlitros de tampão P cinco.

Incube as esferas de GST com enzima por três horas a durante a noite a quatro graus Celsius sob rotação suave. O tempo de incubação deve ser otimizado de acordo com o peso molecular, bem como a estabilidade da proteína após a clivagem. Gire rapidamente e colete o sobrenadante.

Adicione 100 microlitros de tampão P cinco às contas. Em seguida, repita, gire e colete sobrenadante duas vezes. Puxe todas as frações.

Divida o EIT em três frações de um mililitro e incube cada uma com 100 microlitros de grânulos secos de resina de afinidade metálica pré-lavada por uma hora sob rotação, dividindo a eluição em várias frações, aumenta a eficiência de ligação e lavagem. Em seguida, lave a resina por cinco minutos com tampão P 30 a quatro graus Celsius com rotação suave. Depois de repetir a lavagem duas vezes, puxe as esferas em um único tubo para eluir a proteína purificada.

Adicione o tampão P 500 à resina de garra ligada à proteína. Adicione uma proporção de buffer para cordão de um para um volume. Volume. Incubar a suspensão durante cinco minutos em rotação.

Repita esta etapa duas vezes. Manter cada fração iludida separada para armazenamento da proteína purificada. Dialisar a proteína contra um tampão de armazenamento apropriado duas vezes por uma hora a quatro graus Celsius sob agitação.

É importante verificar a precipitação da proteína purificada durante a diálise. Faça pequenas alíquotas da proteína purificada e congele em gelo seco por 30 minutos. Armazene as alíquotas a 80 graus Celsius negativos e evite muitos ciclos de congelamento de descongelamento.

Analise o processo de purificação carregando aproximadamente 20 a 40 microlitros de cada fração em um gel de página SDS. Após a execução da coloração em gel com azul de kumasi ou corante proteico para visualização, os lisados celulares solúveis e totais de nove células SF infectadas com o vírus valo recombinante REC 14 ou simulado infectado como controle foram analisados pela coloração com azul de Kumasi, permitindo a confirmação da expressão de GST re 14 sua proteína durante o processo de purificação. Muitas amostras foram analisadas para acompanhar a eficiência do método de análise dessas amostras pelo Kumasi Blue.

A coloração mostra que durante a primeira etapa de purificação, o GST Rec 14 foi corretamente ligado a grânulos GST com um peso molecular aparente de aproximadamente 50 kilodaltons devido à fusão de rec 14 com GST após clivagem de precisão com GST, o chiado rec 14 livre migra em torno de 37 kilodaltons. Embora o GST clivado possa ser visualizado nas contas de GST, apesar de uma parte do REC 14 livre de GST que ainda permanecia ligada às contas de GST, foi alcançado um enriquecimento notável do chiado do REC 14. Esta etapa pode ser melhorada aumentando o tempo de incubação da proteína com análise de protease de precisão do chiado REC 14 ligado aos grânulos Talon em comparação com as proteínas aludidas após a etapa de purificação do GST mostrar que uma grande fração do chiado REC 14 está ligada aos grânulos Talon.

Após várias lavagens, o chiado REC 14 foi iludido e coletado, três ilusões foram realizadas. A análise revelou uma alta pureza do chiado rec 14 e a maior concentração de chiado rec 14 na primeira comparação eluciana de frações iludidas com as contas de garra depois que Ellucian ilustra a eficiência da ilusão. Como o pequeno chiado rec 14 pode ser detectado como amarrado nas contas.

Essas amostras também foram submetidas a análise de sangue ocidental com anticorpos anti GST e anti-hiss para seguir o REC 14. Ao longo do procedimento, o anti GST blot mostra que alguns GS TRE 14 e GST sozinhos estavam presentes nas proteínas aludidas da etapa de purificação do GST e que os contaminantes foram removidos pela etapa de purificação de afinidade da etiqueta de chiado. Esta mancha revela que o GST foi removido com eficiência do re 14 pelo tratamento de precisão e pela etapa de purificação do chiado.

O anti-chiado visa detectar re 14. Esta mancha confirma que o chiado GST Rec 14 e o chiado REC 14 não foram completamente clivados e removidos das contas GST. Além disso, em alta concentração, o REC 14 parece agregar.

Em resumo, os resultados apresentados demonstram a eficiência da purificação de GST hiss para a purificação de S palm B rec 14. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como recuperar uma energia altamente embelezada. Proteína combinante Uma vez dominada.

Esta técnica pode ser feita em 12 horas após a degeneração do ácido solúvel se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rápida e estritamente a quatro graus Celsius para evitar a degradação de proteínas após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de precipitação de código ou espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a identificação de parceiros proteicos ou modificação pós-traducional da proteína de interesse.

Embora usemos esse método para o DNA, as proteínas de reparo podem ser modificadas para estudar a função das proteínas em outras áreas de pesquisa.