Name: A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a gerar neurônios glutamatérgicos telencefálicos a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método reproduz checkpoints do desenvolvimento humano para estudar diferenciação neural e maturação neuronal.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Y. Sasai para generosamente fornecer o anticorpo FOXG1. Este trabalho foi financiado por Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 e 11-SCB24) e Fundação paraplegia espástica.

1. Geração de pluripotentes humanas Agregados de Células Tronco (D1-D4) <ol><li> As células estaminais pluripotentes humanas são cultivadas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEF) alimentadores na presença de meio de hESC suplementado com factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Após 5-7 dias de cultura, quando as colónias são grandes, mas ainda não-diferenciada, eles estão prontos para o próximo passo. </li><li> A solução de enzima deve primeiro ser preparado. Num tubo de 50 ml, dissolve-se a dispase (ou colagenase) a uma concentração de 1 mg / ml em meio DMEM/F12. Uma vez que estas soluções misture melhor quando aquecido, colocar o tubo contendo o meio e da enzima em banho-maria a 37 ° C durante 10-15 min e em seguida esterilizar utilizando um filtro Steriflip. </li><li> Aspirar o meio a partir das células, lavá-los com DMEM/F12, e aspirar esta fora também. Adicionar 1 ml de dispase a cada poço e colocar no incubador durante 3-5 min para hESCs (até 10 minutos para iPSCs). Olhe para as células ao microscópio, quandoas bordas enrolar ligeiramente / olhar um pouco mais escura, as células estão prontas para a próxima etapa. É melhor para verificar as células após 3 min e colocá-los de volta se necessário. Quando se utiliza este protocolo, pela primeira vez, é melhor começar com apenas uma placa de células de cada vez, uma vez que é importante para remover as células da dispase tão rapidamente quanto possível. </li><li> Aspirar a dispase a partir das células. Suavemente (as células são muito vulnerável nesta fase e vai sair da placa de forma relativamente fácil) adicionar 1,5 ml de meio DMEM/F12 a cada poço, a fim de enxaguar o dispase. Aspirar o DMEM/F12 e adicionar 1,5 ml de meio de hESC a cada poço. </li><li> Para separar e romper as células, coloque a ponta de uma pipeta de vidro de 10 ml para o canto inferior direito de um poço (tocar as células) e mover a pipeta para cima e para baixo (verticalmente) - o stoke ascendente deve estar em estreita proximidade para o acidente vascular cerebral processo descendente. Uma vez que o outro lado do poço é alcançado, repetir na dire horizontalction. </li><li> Uma vez que todas as células estão em suspensão, colocá-los em tubos de 15 ml e centrifugar a 200 xg-los, durante 2 minutos. Deve haver um pellet de células no fundo do tubo. Aspirar o meio a partir de acima do pellet. </li><li> O tamanho do frasco de cultura de célula que deve ser utilizada para manter os agregados depende da quantidade inicial de células. Para 6 poços (1 placa) de hESCs, uma cultura de tecido não-tratada balão T75 com 50 ml de meio de hESC deve ser utilizado. Transferir as células do passo 1.6 para o frasco e incubar a 37 ° C. </li><li> A fim de se livrar dos detritos de células, o meio celular e frasco deve ser substituído a cerca de 12 horas mais tarde. Para fazer isso, colocar a totalidade do meio / células para um tubo de 50 ml, as células girar para baixo (200 xg durante 2 min), e aspirar o meio velho. Em seguida, adicionar 50 ml de meio fresco hESC para as células, e colocar em um frasco T75 novo. As células podem então ser alimentadas diariamente seguindo este mesmo procedimento (até o dia 5). </li></ol><ol><li> Transferir as células / médio para um tubo de 50 ml e centrifugar as células durante 2 minutos a 200 x g. Em seguida, aspirar fora o sobrenadante, e transferir as células para um novo (cultura de tecidos não-tratado) T75 frasco com 50 ml de meio de indução neural (NIM). </li><li> Uma vez que as células estão em NIM, metade do meio deve ser substituído a cada dois dias. Os agregados devem ser suficientemente grandes para onde irão afundar-se no fundo de um tubo cónico de 50 ml, por si só depois de alguns minutos (sem centrifugação necessário). Depois de 2-3 dias de NIM (D7-D8 total), as células devem estar prontos a placa. Laminina ou soro fetal bovino (FBS) pode ser utilizado para ajudar a fixar as células às placas. </li><li> O número de cultura de tecidos tratados placas de 6 cavidades que são necessários depende da densidade das células à medida que cada agregado deve ser capaz de crescer sobre a placa por mais alguns dias, sem tocar em qualquer um dos outros. Em média, as células de umT75 frasco vai render cerca de 4-6 placas de 6 poços no valor de células. </li><li><ol class="ualpha"><li> Se utilizar a laminina, diluir em NIM a 10-20 ug / ml para o revestimento da placa de 6 poços (~ 0,5 ml / poço). Após o revestimento por 2-3 hr, os agregados de células em placas de 6 poços (~ 20-30 agregados por poço). Depois, os agregados ter anexado, adicionar 1,5 ml de NIM. </li><li> Se usar FBS, preparar uma mistura de NIM e 90% de FBS a 10% (1,5 ml / poço). Adicionar 1,5 ml de meio com as células para cada poço, agitar suavemente a placa para trás e para frente para espalhar os agregados, e permitir que as células de anexar S / N na incubadora. Certifique-se de mudar o meio (2 ml / poço de NIM) na manhã seguinte para remover o FBS. </li></ol></li><li> Após um dia ou dois de ser banhado, cada agregado vai espalhar-se para formar uma monocamada. Dentro de alguns dias, os centros da maioria destas células se morfologicamente parecem semelhantes às células colunares (alongado). Durante este período, mudar o NIM todos os dias. Algumas linhas PSC (especially iPSC), pode formar células colunares menos eficientemente. Se isso acontecer, a adição de BMP e TGF (inibidores Dorsomorphin 29, SB431542 19 a 2 ^ M) durante a fase 2 pode ser útil. </li><li> Cerca de 14-17 dias, as células colunares aparecerá mais compacto. Às vezes, essas células formam cordões ou anéis com lúmen visíveis dentro. Além da morfologia colunar, as células nesta fase expressam marcadores gliais, tais como PAX6 e SOX1 12,26. </li><li> Antes do isolamento pode começar, é preciso primeiro examinar as células para determinar se existem quaisquer células não neuroepiteliais presentes. Um marcador de objectivo pode ser utilizada para indicar as colónias não-neuroepiteliais. Estes podem então ser eliminados por raspagem com eles com uma ponta de pipeta. </li></ol> 3. Geração de Progenitores telencefálica (D17-D24) <ol><li> Os centros das colónias contêm as células neuroepiteliais, e deve ser isolado do resto da colónia. Isto pode ser feito usandouma micropipeta e uma solução estéril de 1 ml da ponteira filtrada. Quando uma pequena quantidade de pressão é aplicada na porção central da colónia, que, geralmente, desprende-se facilmente. Seja cauteloso para não deixar a parte exterior da colônia destacar também. Se os centros estão sendo teimosa e não sair por si próprios, podem ser removidos por excisão-las utilizando uma agulha com um microscópio numa câmara estéril. Transferir as porções centrais das colónias para um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 2 min. </li><li> O meio deve ser aspirados para fora das células. Duas placas no valor de células podem então ser transferidas para uma cultura de tecido não-tratado T25 frasco contendo 10 ml de NIM com a adição de B27 (sem vitamina A, 1:50). Use 5-10 ml de meio por uma placa de células. </li><li> Quando as células são visualizadas no dia seguinte, eles devem ter uma esfera como a aparência. É necessário transferir essas células para um balão de novo (na presença de NIM e B27, 1:50), uma vez que é muitas vezes as células periféricasque sneak dentro e anexar ao fundo do frasco. </li><li> O neuroesferas deve então ser cultivadas em suspensão durante uma semana utilizando NIM suplementado com B27 (1:50). A fim de promover a resistência e proliferação celular, AMP cíclico (cAMP, 1 uM), bem como o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF1, 10 ng / ml) pode ser adicionado para o meio durante a cultura em suspensão. Neste ponto, as neuroesferas contêm progenitores telencefálicos FOXG1 (+) e está pronta para ser plaqueada em lamelas para a diferenciação terminal. </li></ol> 4. Maior diferenciação nos neurônios telencefálicos (D25 +) <ol><li><ol class="ualpha"><li> Preparar as lamelas poly-ornithine/laminin revestidos (em placas de 24 poços) para plaqueamento das células. As lamelas são em primeiro lugar limpas, e são depois revestidas com manobra ornitina-(a 0,1 mg / ml, 37 ° C, S / N, e armazenado no congelador). Poli-ornitina revestimento: <ol><li> Esterilizar as lamelas: Coloque as lamelas em umbéquer contendo ácido nítrico e agitar suavemente na hotte durante uma hora. Deitar fora o ácido nítrico, lavar várias vezes com água desionizada, e deixar as lamelas com água corrente DI durante pelo menos 15 min. Coloque as lamelas em 95% de etanol e agita-se durante ou 30 min (se utilizar de imediato) ou armazenamento em etanol à temperatura ambiente. </li><li> Em um capuz estéril, derramar o conteúdo do tubo de 50 ml contendo lamelas esterilizadas para a tampa de uma placa de 6 poços. Usando uma pinça esterilizada, pegar uma lamela de cada vez e colocado verticalmente, num único poço de uma placa de 24 poços. Repetir, de modo que cada poço tem uma lamela. </li><li> Depois que secar completamente, toque as placas até lamínulas caíram apartamento em cada poço. Em seguida adicionar 100 ul de poli-ornitina (0,1 mg / ml em dH2O estéril) de cada lamela e incuba-se as placas de O / N a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, remover placas da incubadora e permitir-se arrefecer para a TA. Aspirar poli-ornitina a partir de cada lamela (a partir da borda tele lamela) tomando cuidado para não tocar ou coçar as lamelas no processo. Permitir que as lamelas secar durante cerca de 30 min antes da lavagem. </li><li> Adicionar 1 ml de dH2O estéril a cada poço, deixar sentar durante 10 min, e aspirar a água de cada poço. Repita esta lavagem passo mais duas vezes. Após as placas de secar completamente, (licença de tampas na capa) colocar as tampas, cubra com papel alumínio e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li><ol><li> Para revestir as lamelas com laminina, adicionar 50 ul de uma mistura de meio de diferenciação neuronal e laminina (concentração final de 20 ug / ml) a cada lamela poli-ornitina tratados com o cuidado de ter apenas o líquido toque a lamela em si (e não derramar off). Incubar a 37 ° C durante 1-2 horas antes de preparar as células para a fixação. </li></ol></li></ol></li><li> Recolher e centrifugar a neuroesferas a 200 xg durante 2 min num tubo de 15 ml. Aspirar o sobrenadante. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha"><li> Lavar as células com DMEM-F12 e centrifugar as células novamente. Se as neuroesferas são demasiado grandes para prender adequadamente, eles podem ser dissociadas com Accutase nesta etapa. </li><li> Se utilizando Accutase: Após lavagem das células com DMEM-F12, as neuroesferas são dissociados para conjuntos pequenos adicionando Accutase (~ 2 ml) e incubando as células a 37 ° C durante 3 min. Em seguida, adicionar a mesma quantidade de inibidor de tripsina (~ 2 ml) e centrifugar as células a 200 xg durante 3 min. As células devem então ser re-suspenso em NDM e quebrada com uma pipeta de P200. Os pequenos agregados podem então ser plaqueadas em lamelas de cobertura pré-revestidos. </li></ol></li><li> Aspirar fora a maioria do meio e colocar as células em uma placa de Petri de 6 cm de algumas gotas do meio, de modo que se torna mais fácil selecionando-as. Adicionar cerca de 4-5 neuroesferas a cada lamela pré-revestido. Não há necessidade de aspirar para fora da laminina em primeiro lugar. </li><li> Deixe as neuroesferas anexar durante pelo menos 2-4 horas. Uma vez que têm umttached bem, mais meio (0,5 ml / lamínula) deve ser adicionado. Deve consistir de meio de diferenciação neural suplementado com B27 (1:50), cAMP (1 uM), e os factores neurotróficos (BDNF, GDNF e IGF, todos a 10 ng / ml). Neste ponto a metade do meio pode ser mudado a cada dois dias e estas células podem ser mantidas durante vários meses. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+specification+in+the+spinal+cord%3A+inductive+signals+and+transcriptional+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes.</a> Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).</li>
<li>Wilson, S. I., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+toward+a+unifying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural induction: toward a unifying mechanism.</a> Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).</li>
<li>Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Singh Roy, N., Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-specified+GFP-based+FACS+purification+of+human+spinal+motor+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).</li>
<li>Lee, H., Shamy, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons.</a> Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).</li>
<li>Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).</li>
<li>Li, X. J., Du, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Perrier, A. L., Tabar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Yan, Y., Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+neurons+and+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the embryonic forebrain.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).</li>
<li>Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+glutamatergic+neurogenesis%3A+conserved+programs+in+neocortex%2C+cerebellum%2C+and+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus.</a> Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).</li>
<li>Watanabe, K., Kamiya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Li, X. J., Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136, 4055-4063 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5, e11853(2010).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Huang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+a+human+neuroectoderm+cell+fate+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant.</a> Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+patterning+of+the+central+nervous+system%3A+how+many+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initial patterning of the central nervous system: how many organizers.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).</li>
<li>Ma, L., Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+GABA+neurons+correct+locomotion+deficits+in+quinolinic+acid-lesioned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).</li>
<li>Li, W., Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li>
<li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li>
<li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li>
<li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li>
<li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Existem vários passos cruciais durante o processo de diferenciação neuronal. É importante assegurar que as PSCs são pluripotentes humanas porque de outro modo as células podem já ser inclinado para tornar-se uma linhagem não-neuronal. Isto pode ser confirmado por coloração das PSCs humanos com anticorpos contra marcadores de pluripotência como Oct4, Sox2, Nanog e Tra-1-60 1-3. Se as PSCs humanos não dão muito bem após passaging deles, ROCK inibidor (Y27632) pode ser adicionado para ajudar. Para aqueles que tê...

As células-tronco pluripotentes humanas (PSCs), incluindo tanto células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), têm a capacidade de gerar qualquer tipo de célula no corpo, incluindo neurónios 1-3. Diferenciação dirigida de vários subtipos neuronais de PSCs humanos é a chave para a aplicação dessas células na medicina regenerativa. A geração de subtipos funcionais neuronais durante o desenvolvimento é um processo complexo, que envolve a indução da linhagem neuronal, a especificação de progenitores regionais ao longo do eixo rostro-caudal, e a diferenciação dos tipos de pós-mitóticos neuronais a partir dos progenitores regionais 4,5. A partir de 2001, vários sistemas foram criados para gerar linhagem neural de hESCs, que forneceram uma plataforma para a geração subseqüente de subtipos neuronais 6,7. Com base em princípios de desenvolvimento, vários tipos de neurônios, como espinhal neurônios motores 8-12, mesencéfalo dopneurônios aminérgicos 13-15, e as células da retina neural 16,17 foram especificadas de forma eficiente PSCs humanos. Isto foi feito pela aplicação de morfogénios críticos que são importantes para a especificação de um destes tipos de neurónios durante o desenvolvimento in vivo. Outros protocolos também foram desenvolvidos para promover a diferenciação de neurónios em hESCs utilizando quer outros factores 18-20, tais como as moléculas pequenas, ou por co-cultura com outros tipos de células para ajudar a promover a diferenciação 21. O neocórtex humano é altamente desenvolvida e contém muitos tipos de células, incluindo neurônios glutamatérgicos que desempenham um papel importante na aprendizagem, memória e função cognitiva 22,23. O primeiro passo na geração de neurónios glutamatérgicos na cultura é especificar células progenitoras telencefálicos. Grupo Yoshiki Sasai o primeiro relataram a diferenciação de precursores dirigido telencefálicos de rato CES (mESCs) utilizando um suspensio isento de soron cultura na presença de DKK1 (que inibe a via de sinalização Wnt), bem como LeftyA (que inibe a sinalização nodal) 24. Posteriormente, vários grupos, incluindo a nossa também relataram a especificação dos precursores telencefálicos de PSCs humanos em soro meio livre 25-27. A geração de precursores de PSCs telencefálicos humanos não requer a utilização de morfogénios exógenas e a eficiência na geração destes precursores é muito mais elevada do que aquela a partir de mESCs 26,27. Aqui, um sistema quimicamente definido para a indução neural que foi bem estabelecida por grupo de Zhang 7 foi descrita. Sem a adição de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente gera precursores telencefálicos de PSCs humanos 27. Esses progenitores pode, então, ser diferenciadas em células progenitoras dorsal ou ventral, regulando a sinalização de Wnt e sonic hedgehog (SHH). Dorsal Os progenitores podem ainda se diferenciar em neurônios e glutamatérgicafficiently 27. Além disso, este protocolo também funciona bem para a geração de neurónios glutamatérgicos do iPSCs humano 28, que permite a geração de neurónios específicos do paciente, que podem ser utilizados para explorar o mecanismo de acção, assim como terapias potenciais para uma grande variedade de doenças . Além disso, o nosso sistema também fornece uma plataforma para explorar o desenvolvimento e especificação de diversos tipos neuronais no telencéfalo.

<table><tbody><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco com mistura de nutrientes F12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; thanol (14,3 M)</td> <td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-L-ornitina (poliornitina)</td> <td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (humana)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (camundongo)</td> <td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tecnologias</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inibidor</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0,1% gelatina</td><td>Anticorpo Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1</td><td>Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Hoxb4 (1:50)</td><td>Estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 anticorpo (1:5000)</td><td>Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 anticorpo (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo vGLUT1 (1:100)</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Fator neurotrófico derivado da glia (GDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de insulina 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>AMP cíclico (cAMP)</td> <td>Sigma</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>Sonic hedgehog (SHH)</td> <td>R & D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Balões BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 (não tratados)</td><td>Balões BD</td><td>353009</td><td></td></tr><tr><td>T75 (não tratados)</td><td>BD</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 6 cm</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro de 9''</td><td>Filtros Fisher</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip (0,22 &mu; M)</td> <td>Filtros Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 1.000 ml (0,22 &mu; M)</td> Microscópio de contraste de fase <td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>(Observer A1)</td> <td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de dióxido de carbono (Hera Cell 150)</td> Capuz de biossegurança <td>da Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Sterilgard III Advance)</td> <td>Centrífuga The Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5702 R)</td> <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Aqui, um procedimento passo a passo para gerar eficientemente telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células pluripotentes estaminais humanas (PSCs) tem sido descrita. O processo de diferenciação é iniciada quebrando as PSCs humanos em pedaços que completam-se para formar agregados quando as células são colocadas numa cultura em suspensão. Os agregados são então cultivadas em meio de hESC dias 1-4 para permitir a diferenciação espontânea. Durante este tempo, as células têm a capacidade de se transformar em qualquer uma das três camadas germinais. Dos dias 5-8, as células são colocadas num meio de indução neural para empurrá-los para a linhagem neural. Por volta do dia 8, as células são deixadas a ligar em placas de 6 poços e diferenciar tempo durante o qual a forma de células neuroepiteliais. Estas células neuroepiteliais pode ser isolado no dia 17. As células podem então ser mantidos como neuroesferas até que estejam prontas para serem semeadas em lamelas. Utilizando um meio de base sem quaisquer factores caudalizing, as células neuroepiteliais são specified em precursores telencefálicos, que podem então ser adicionalmente diferenciadas em células progenitoras dorsais e neurónios glutamatérgicos telencefálicos eficientemente. No geral, nosso sistema fornece uma ferramenta para gerar humanos neurônios glutamatérgicos aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento desses neurônios e as doenças que os afetam.

Aqui, um protocolo para diferenciar PSCs humanos em telencefálicos neurónios glutamatérgicos através de diversos passos críticos: a formação de agregados de PSC, a indução de células neuroepiteliais, a geração de células progenitoras telencefálicos, e a diferenciação terminal de células progenitoras em neurónios estes telencefálicos (Figura 1) possui foram descritos. Este sistema é robusto e eficiente na geração de células progenitoras telencefálicos e neurónios glutamatérgicos. Como um exemplo ...

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar neurônios cefálicos a partir de células-tronco embrionárias humanas ou CTEHs, passando por pontos de verificação semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. Isso é realizado primeiramente permitindo que as CTEHs se diferenciem espontaneamente em suspensão em meio para CTEHs e, em seguida, transferindo-as para um meio de indução neural para promover uma diferenciação mais seletiva. Em seguida, os corpos embrionários ou agregados de CTEs são aderidos em placas tratadas para cultura de tecidos, onde as células se expandem e se diferenciam em uma monocamada.Com os centros formando células neuroepiteliais morfologicamente semelhantes às células quilômetro. Em seguida, as células neuroepiteliais são isoladas e colocadas em culturas de suspensão, onde formam neuroesferas. Por fim, as neuroesferas são semeadas sobre lamínulas, onde podem se diferenciar ainda mais.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram os tipos específicos de neurônios formados por meio de imunomarcagem ou eletrofisiologia. As implicações dessa técnica estendem-se a uma ampla variedade de doenças geneticamente herdadas, pois neurônios específicos de pac

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação de corpos embrióides (EBs) em agregados neuroepiteliais e sua subsequente divisão em células neuronais e gliais. Este método permite a geração eficiente de células neuronais e gliais in vitro, que servem como sistemas de teste para testes de toxicidade, bem como avaliação de diferentes vias envolvidas na neurotoxicidade.

Geração de neurônios e células gliais a partir de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este vídeo demonstra o processo de indução de células-tronco pluripotentes humanas a se diferenciarem em neurônios, transfectando-as com lentivírus modificados carregando um gene do fator de transcrição neurogênico sob o controle do elemento responsivo à tetraciclina, seguido de tratamento com um derivado de tetraciclina e meio de maturação.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando lentivírus projetados

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a gerar neurônios glutamatérgicos telencefálicos a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método reproduz checkpoints do desenvolvimento humano para estudar diferenciação neural e maturação neuronal.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

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