A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

O objetivo geral deste procedimento é gerar neurônios cefálicos a partir de células-tronco embrionárias humanas ou H ESCs, passando por pontos de verificação semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. Isso é feito primeiro permitindo que os HSCs se diferenciem espontaneamente em suspensão no meio HESC e, em seguida, transferindo-os para o meio de indução neural para se diferenciarem de forma mais seletiva. Em seguida, os corpos embrionários ou agregados PSC podem se ligar às placas tratadas com cultura de tecidos, onde as células se expandem e se diferenciam em uma monocamada.

Com os centros formando células neuroepiteliais morfologicamente semelhantes a células quilômetros. Em seguida, as células neuroepiteliais são isoladas e colocadas em culturas em suspensão, onde formam neuroesferas. Finalmente, as neuroesferas são revestidas em lamínulas onde podem se diferenciar ainda mais.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os tipos específicos de neurônios formados por meio de imunocoloração ou eletrofisiologia. As implicações dessa técnica se estendem a uma ampla variedade de doenças geneticamente herdadas, porque neurônios específicos do paciente também podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, onde o mecanismo de ação e as terapias potenciais podem ser elucidados. Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de subtipos de neuro cefálicos de garra a partir de células-tronco pluripotentes.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como doenças humanas relacionadas a neurônios cefálicos de garras Para gerar agregados de células-tronco pluripotentes humanas, comece cultivando células-tronco pluripotentes humanas em fibroblastos embrionários de camundongos alimentadores em meio HESC suplementado com FGF básico por cinco a sete dias, as colônias serão grandes, mas ainda indiferenciadas. Quando as colônias atingirem o estágio correto em um tubo de 50 mililitros. Preparar uma solução de um miligrama por mililitro de disbaias em meio D-M-E-M-F 12 de acordo com o protocolo de texto.

Aspire o meio das células e depois lave-as uma vez com D-M-E-M-F 12. Depois de remover a lavagem, adicione um mililitro de baias a cada poço e incube a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Na marca de três minutos, verifique ao microscópio se há bordas enroladas que parecem um pouco mais escuras.

Se necessário, incube as células por mais tempo. Quando as células estiverem prontas, remova a solução dase e lave as células uma vez com DMEF 12 antes de substituir a lavagem por 1,5 mililitros de meio HESC para separar e quebrar as células. Posicione a ponta de uma pipeta de vidro de 10 mililitros nas células em direção à parede inferior direita de um poço e, com um pequeno movimento para cima e para baixo, mova-se pelo poço para o outro lado antes de retornar na direção oposta.

Quando todas as células estiverem em suspensão, coloque-as em tubos de 15 mililitros e centrifugue-as a 200 G por dois minutos antes de remover o meio do pellet. Usando o meio HESC, transfira as células para um frasco para cultura. Por exemplo, para células de seis poços de HSCs, use um frasco T 75 com 50 mililitros de HESC. Média.

Incube as células a 37 graus Celsius por 12 horas. Em seguida, para remover quaisquer detritos celulares, transfira as células e o meio para um tubo de 50 mililitros e lave as células uma vez antes de transferi-las com 50 mililitros de meio fresco para um novo frasco. Continue a alimentar as células dessa maneira até o quinto dia.

No quinto dia, gire as células e transfira-as para um novo frasco T 75. Com 50 mililitros de meio de indução neural ou NIM, incube-os por dois a três dias substituindo metade do NIM a cada dia após a placa de incubação, as células usando laminina ou FBS para ajudá-las a se ligar às placas à placa. Usando FBS, adicione 1,5 mililitros de meio com células a cada um.

Bem, agite suavemente a placa para espalhar os agregados e permitir que as células se fixem durante a noite. A 37 graus Celsius no dia seguinte, substitua todo o meio por dois mililitros de NIM por poço. Após um ou dois dias de incubação, cada agregado se espalhará para formar uma monocamada e, em alguns dias, os centros da maioria dessas células parecerão morfologicamente semelhantes às células do colúmero.

Por volta dos dias 14 a 17, as células do colúmero parecerão mais compactas. Às vezes, as células formam sulcos ou anéis com um lúmen visível no interior. Antes de isolar as células, examine-as quanto à presença de células epiteliais não pertencentes à UE e use uma ponta de pipeta para raspá-las.

Para isolar as células neuroepiteliais que se encontram no centro das colônias. Use uma micropipeta e uma pipeta filtrada estéril de um mililitro para aplicar pressão no centro da colônia para que ela se levante. Tome cuidado para não deixar a parte externa da colônia se desprender também.

Transferir duas placas de células isoladas para um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 200 G durante dois minutos. Após a remoção do meio, transferir as células para um frasco T 25 não tratado com cultura de tecidos contendo 10 mililitros de NIM. Com a adição de B 27 incubar durante a noite no dia seguinte, as células devem ter uma aparência de esfera.

Às vezes, as células periféricas também são isoladas e geralmente se ligam ao fundo do frasco. Se isso acontecer, transfira as células esféricas para um novo frasco, deixando as células anexadas para trás da cultura. As neuroesferas e suspensão por uma semana em NIMB 27 para promover a resistência e proliferação celular.

Adicione um MP cíclico e um fator de crescimento semelhante à insulina. No final da semana, as neuroesferas conterão progenitores cefálicos e estão prontas para serem colocadas em lamínulas para diferenciação terminal. Para preparar lamínulas revestidas com laminina de poliuretano em 24, as placas de poço começam revestindo lamínulas limpas com uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de poliuretano a 37 graus Celsius durante a noite para revestir as lamínulas com laminina a 50 microlitros de 20 microgramas por mililitro de laminina em diferenciação neural.

Média a cada lamínula tratada com poliuretano. Tomando cuidado para que apenas o líquido toque na própria lamínula. Incube-os a 37 graus Celsius por uma a duas horas.

Após a incubação da laminina, coletar e lavar as neuroesferas em D-M-E-M-F 12. Se as células forem muito grandes para se fixarem corretamente, adicione cerca de dois mililitros de Accutane e incube as células a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione um volume igual de inibidor de tripsina e, após a centrifusão, as células a 200 G por três minutos, substitua a solução por NDM e use um P 200 para quebrar as células para pequenos aglomerados.

Coloque-os em lamínulas pré-revestidas, aspire a maior parte do meio e transfira as células para uma placa de Petri de seis centímetros em algumas gotas do meio, para que a seleção delas se torne mais fácil sem remover a laminina das lamínulas pré-revestidas. Transfira cerca de quatro a cinco neuroesferas para cada uma. Deixe as neuroesferas se ligarem por pelo menos duas a quatro horas antes de adicionar 0,5 mililitros de meio de neurodiferenciação suplementado com B 27 cíclico.

Um MP e fatores neurotróficos substituem metade do meio a cada dois dias. As células podem ser mantidas por vários meses, conforme mostrado aqui. Este protocolo descreve como diferenciar PSCs humanas em neurônios glutamatérgicos cefálicos por meio de várias etapas críticas.

A formação de CEP agrega a indução de células neuroepiteliais, a geração de progenitores cefálicos de garra e a diferenciação terminal desses progenitores em neurônios cefálicos de garra. Este sistema é robusto e eficiente na geração de neurônios cefálicos, progenitores e glutamatérgicos, por exemplo. Sem a adição de fatores izantes, as HSCs se diferenciaram na linhagem neural e 24 dias após a diferenciação.

A maioria dos precursores neurais foi positiva para Fox G one, fator de transcrição A expresso pelo céfalo, mas negativo para HOKs B quatro, um marcador para células cerebrais posteriores e da medula espinhal, sugerindo que os progenitores cefálicos telon foram gerados com sucesso. Esses progenitores cefálicos telon possuem um fenótipo dorsal, conforme indicado pela expressão de PAC seis. Um marcador expresso por progenitores dorsais, mas não NK X 2.1 Um marcador para progenitores ventrais.

Após uma maior diferenciação, esses progenitores dorsais cefálicos se diferenciaram em neurônios glutamatérgicos, que foram positivos para o marcador glutamatérgico. Os neurônios TBR um que sustentaram positivo para TBR um também foram positivos para marcadores neuronais beta três tubulina ou mapa dois. Essas células também expressaram o transportador vesicular de glutamato um ou V glut um, um marcador para neurônios glutamatérgicos maduros, sugerindo a geração eficiente de neurônios glutamatérgicos cefálicos na cultura.

Após este procedimento, outros métodos, como eletrofisiologia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se esses neurônios podem fazer conexões sinápticas com outras células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento. Ele teve que diferenciar células-tronco pluripotentes humanas e em neurônios glutamatérgicos cefálicos por meio de várias etapas críticas.

A formação de células-tronco pluripotentes agrega a indução de células neuroepiteliais, a geração de progenitores cefálicos e a diferenciação terminal desses progenitores em neurônios cefálicos.