Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Gerar macrófagos derivados da medula óssea para análise de polarização. Os ossos do fêmur e da tíbia são isolados de camundongos e as células da medula óssea são coletadas. As células são então cultivadas em meio contendo fatores de crescimento para induzir a formação de macrófagos.

Após sete dias de cultivo, os macrófagos derivados da medula óssea são tratados com vários estímulos e macrófagos polarizados. As respostas de ativação são analisadas por citometria de fluxo, PCR em tempo real e resultados de análise de blos ocidentais são obtidos que mostram uma alta pureza de macrófagos derivados da medula óssea com respostas de ativação polarizadas para M1 ou M dois. Os estímulos mentem.

A implicação desta técnica é a terapia ou o diagnóstico de doenças associadas à diversidade, incluindo resistência à insulina e os CROs porque os macrófagos infiltrantes T são os principais atores neste contexto, a demonstração visual deste método é crítica, pois a aceleração das células da medula óssea é um tanto difícil e o rendimento é crítico para obter preparação celular de estudo suficiente para induzir a formação de macrófagos Trabalhando em um capuz estéril. Comece este protocolo com ossos do fêmur e da tíbia isolados de camundongos de seis a oito semanas de idade em uma placa de cultura de tecidos. Enxágue os ossos em PBS e use uma tesoura para abrir as duas extremidades dos ossos, tomando cuidado para não remover muito enquanto segura o osso com uma pinça.

Insira uma agulha de calibre 21 em 23 com uma seringa de 10 mililitros contendo PBS frio com FBS ativado por aquecimento a 2% em uma extremidade do osso. Pressione o êmbolo para liberar a medula para uma nova placa de cultura de tecidos. Em seguida, passe a medula pela mesma agulha quatro a seis vezes para dissociar as células.

Em seguida, despeje as células em um filtro de células de 70 mícrons para remover aglomerados de células, ossos, cabelos e outras células ou tecidos. Coletar o fluxo em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois que a solução passar pelo filtro, adicione três volumes de cloreto de amônio a 0,8% ao fluxo e incube no gelo por 10 minutos.

Para remover os glóbulos vermelhos após a incubação, gire as células a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, suspenda novamente o pellet celular em 20 a 50 mililitros de PBS frio com 2%FBS. Conte as células usando um hemocitômetro.

Gire as células a 500 vezes G por cinco minutos de quatro graus Celsius. Depois de despejar o supinato. Prossiga para induzir a formação de BMDM conforme descrito na próxima seção do protocolo Para induzir a formação de BMDM Resus, suspenda as células isoladas da medula óssea em meio de crescimento BMDM a uma concentração de duas vezes.

Centralize as seis células por mililitro de semente uma a duas vezes 10 para as seis células em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis ou 12 poços e incube as células a 37 graus Celsius. A semeadura nessa concentração facilitará o descolamento para citometria de fluxo após três dias. Mude para o meio de crescimento fresco do BMDM no sétimo dia.

A formação de BMDM maduro é avaliada usando análise de citometria de fluxo e anticorpos conjugados com fluorol para detectar células que expressam CD 11 B e F quatro 80. Após verificar a formação de DMMO madura, mude para meio de eco modificado por Cove com 10% de FBS e LPS ou LPS e interferon gama para ativação de M1 ou IL quatro ou IL 13 para ativação de M dois. Incube as células a 37 graus Celsius após 24 horas.

Colete os MDMs estimulados retirando-os do prato. Para fazer isso, remova o meio das células e lave com PBS sem cálcio ou magnésio. Em seguida, adicione 0,05% de tripsina quente contendo 0,48 milimolar, EDTA incube a 37 graus Celsius por não mais de 10 minutos para evitar a perda de proteínas de superfície devido à digestão excessiva.

Em seguida, lave as células duas vezes com PBS contendo 10% de FBS e transfira-as para tubos de amostra de 1,2 mililitro. Use anticorpos para detectar a expressão de antígenos de superfície celular, incluindo CD 11, BF quatro, 80, CD 11, C, CD 2, 0, 6, CD 69, CD 80 ou CD 86, em vários momentos. Usando procedimentos padrão de coloração por citometria de fluxo usando PCR quantitativo.

Determinar os níveis de expressão de IL um beta TNF alfa e IL seis para avaliar a ativação de M1 ou IL 10, IL 13, arginase um e PPAR gama para avaliar a ativação de M dois. Finalmente, realize western blotting para avaliar a ativação das vias de sinalização celular envolvidas na ativação de M1 ou M, dois macrófagos para avaliar a pureza do BMDM maduro. Após a citometria de fluxo de indução, a análise foi realizada usando anticorpos contra CD 11 BF quatro 80, CD 11 C e CD 2 0 6 B. Os MDMs foram primeiro bloqueados em FSC e SSC para remover DRI e conjugados.

Os MDMs b maduros foram definidos como CD 11 B positivo F quatro 80 subpopulações positivas, que são vistas no canto superior direito deste gráfico e comprometeram 95 a 99% da população fechada para avaliar a polarização de macrófagos. Uma análise mais aprofundada foi realizada. Primeiro gating foi realizado para identificar macrófagos infiltrados no tecido, que são CD 11 B positivo F quatro 80 células positivas.

Entre esses M1, os macrófagos que são CD 11 C positivo e CD 2 0 6 negativo aparecem no quadrante dois, enquanto M dois macrófagos, que são CD 11 C negativo e CD 2 0 6 positivo, aparecem no quadrante quatro. Para avaliar a ativação de macrófagos, as células foram incubadas com LPS para induzir a ativação de M1 ou IL quatro para ativação de M dois. Após a ativação, o tamanho dos macrófagos aumentou, conforme evidenciado pelo deslocamento da FSCA de M1 ou M dois macrófagos 24 horas após a estimulação em comparação com M zero não tratado.

Marcadores de superfície relacionados à ativação de macrófagos também foram analisados após a estimulação. Os marcadores de resposta precoce CD 69 foram avaliados cinco ou 24 horas após a estimulação, os marcadores CD 80 e CD 86 foram analisados 48 horas após a estimulação. Como mostrado aqui, o aumento da abundância de CD 69, CD 80 e CD 86 de superfície foi observado em macrófagos estimulados para avaliar a ativação clássica e alternativa de macrófagos.

Aqueles estimulados com LPS ou IL quatro por 24 horas foram coletados e o RNA total foi extraído para análise por PCR quantitativo em tempo real, conforme mostrado aqui. A expressão elevada de arginase e PPAR gama foi detectada em M dois macrófagos em comparação com a expressão de citocinas pró-inflamatórias de macrófagos não tratados. Interleucina um beta TNF alfa aumentado em macrófagos M1 para avaliar a ativação da via NF kappa B por anticorpos LPS contra P 65 e P 65 relacionado a fosfo foram usados na análise de western blot, conforme mostrado aqui.

Uma banda mais forte contra o P 65 fosforilado é observada com o tratamento com LPS. Juntos, esses dados indicam macrófagos derivados da medula óssea com respostas de ativação polarizadas a dois estímulos M1 ou M. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar macrófagos derivados da medula óssea, seguidos de análise de ativação polarizada.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de avaliar a pureza do macrófago diferenciado antes de testar sua resposta. Após este procedimento, um método como a transfecção transitória de genes ou SHRA pode ser realizado para responder a perguntas adicionais como: como os genes estão envolvidos na regulação da ativação macrófaga?