Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe
26 de março de 2013
Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.
O objetivo geral do experimento a seguir é detectar o vírus da influenza A utilizando um chip microfluídico. Primeiro, faça passar a amostra com tampão de lise pelo canal de SPE para lisar o vírus e extrair o RNA, carregue o reagente de RT-PCR com o RNA extraído e execute o canal de transcrição reversa para converter o RNA viral em cDNA. Em seguida, faça passar a mistura pelo canal de PCR para amplificar o DNA; os resultados obtidos mostram o tamanho e a concentração do amplicon com base no sinal de fluorescência proveniente da eletroforese capilar.
A principal vantagem desta tecnologia é que ela aceita a amostra bruta do paciente e integra a extração, purificação, transcrição reversa e amplificação de ácidos nucleicos em um único chip. Para criar dois placas, distribua cerca de nove gramas de pellets de XN X uniformemente no centro de uma placa metálica, coloque em uma prensa aquecida a 198 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, aplique pressão lentamente até 2.500 PSI por mais cinco minutos. Agora, posicione uma placa no molde de epóxi pré-aquecido a 157 graus Celsius por 10 minutos e aplique pressão lentamente até 1000 PSI por mais 10 minutos.
Em seguida, utilizando luvas térmicas, remova a placa e o molde da prensa quente e, então, retire a placa do molde antes que esfrie. Faça três furos no chip gravado, um em cada entrada, porta de descarte e saída do canal microfluídico. Em seguida, lave os chips com IPA, seguido por RNAs away e água deionizada.
Seque as placas com ar para ligá-las; primeiro aqueça a 131 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, pressione a 350 PSI por mais 10 minutos. Usando o epóxi JB Weld, fixe separadamente os nanoconectores nas portas de entrada, de rejeito e de saída, e deixe curar por 15 a 24 horas. De acordo com as instruções do fabricante, enxágue o canal de SPE com 50 microlitros de RNAs away, seguido por 100 microlitros de água livre de nucleases.
Agora, carregue o canal de SPE com quatro microlitros de solução de enxertia recém-preparada para reticulizar a incubação de metacrilato por 10 minutos em uma estufa de UV; remova a solução de enxertia residual com vácuo. Desagregue o pellet de microesferas secas batendo suavemente no tubo com a tampa fechada. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução recém-preparada para coluna de SPE e vortexie para homogeneizar.
Carregue quatro microlitros da solução de SPE no mesmo canal e realize a reticulação por irradiação UV durante 2,5 minutos em cada lado, resultando em uma coluna de SPE polimerizada opaca e branca. Lave o canal com 500 microlitros de metanol a 100% para remover reagentes em excesso e solventes pirogênicos intrapoliméricos. Fixe dois aquecedores de filme fino na parte inferior do chip utilizando fita termicamente condutiva.
Observe que os lados dos aquecedores precisam ser alinhados com a borda dos canais largos durante o período Dene e, separadamente, posicione cinco termopares no chip através dos canais laterais abertos sem saída de cada fita de chip. Para fixar a posição dos termopares, adicione quatro microlitros de 25 XRNA secure a 96 microlitros de etanol 70% em um tubo e a etanol 100% em um segundo tubo. Além disso, prepare 300 microlitros de tampão de canal e 316 microlitros de tampão de lise.
Aqueça as soluções a 60 graus Celsius por 15 minutos. Para ativar o RNA secure e, em seguida, equilibrar o canal microfluídico. Passe o tampão do canal através do canal SPE a uma taxa de fluxo de 0,8 mililitros por hora.
Agora, aqueça rapidamente a amostra de teste de fava no meio de transporte viral a 37 graus Celsius. Remova a amostra assim que estiver descongelada. Centrifugue a amostra a 13.000 RPM durante 10 minutos.
Transfira 100 microlitros do sobrenadante para 300 microlitros do tampão de lise e adicione seis microlitros de um micrograma por microlitro de RNA transportador; vortex para homogeneizar. Em seguida, centrifugue por cinco segundos e carregue todo o lisado em uma seringa de encaixe seguro de 1 mL. Passe o lisado através do canal de extração em fase sólida (SPE) a uma vazão de 0,8 mililitros por hora.
Em seguida, lave o canal SPE com 100 microlitros de etanol 70%, seguido por 100 microlitros de etanol 100% a uma vazão de um mililitro por hora. Posicione uma seringa vazia na marca de 0,5 mililitro e empurre ar através do canal para secá-lo a uma vazão de um mililitro por hora. Agora, passe 67,5 microlitros de água livre de nucleases pelo canal para eluir os ácidos nucleicos retidos a 0,5 mililitros por hora e colete 13,5 microlitros do nanoporto no porto de descarte.
Carregue 36,5 microlitros do mestre de R-T-P-C-R. Misture no nanoporto no porto de descarte e misture com o RNA molde para uma reação de R-T-P-C-R de 50 microlitros. Em seguida, carregue a mistura de R-T-P-C-R no canal de RT por vácuo suave.
Selar o nanoporto com um conector fechado. Aplicar 35 volts ao aquecedor um. Manter os reagentes no canal de temperatura ambiente por 30 minutos após o aquecedor um atingir equilíbrio a 50 graus Celsius.
Mantenha os reagentes no canal RT por 15 minutos após o aquecedor um atingir equilíbrio a 95 graus Celsius. Em seguida, aplique 27 volts ao aquecedor um e 50 volts ao aquecedor dois para equilibrar o aquecedor um a 60 graus Celsius e o aquecedor dois a 95 graus Celsius. Empurre os reagentes para dentro do canal PCR a 0,5 microlitros por minuto.
Aproximadamente 20 minutos depois, quando os reagentes chegarem ao final do canal serpenteado, colete os produtos da PCR na saída utilizando um pipetador e ponteira de tamanho apropriado para o teste de DNA de alta sensibilidade da Agilent. Retire o kit de DNA de alta sensibilidade da Agilent do refrigerador 30 minutos antes do teste. Ligue o bioanalisador e abra o software 2100 Expert.
Carregue um microlitro dos produtos de PCR para o teste e siga o protocolo da Agilent. Analise e registre os dados neste fluxo de trabalho. A amostra nasal faríngea do paciente é misturada com tampão de lise e aplicada no chip.
O chip é executado e os produtos de PCR do vírus da influenza são detectados em vermelho usando um chip comercial de eletroforese capilar. Devido às diferentes quantidades de vírus da influenza em cada espécime do paciente, a concentração final do produto de PCR variará. Um bom resultado deve apresentar baixo ruído, picos em forma de escada bem definidos nos fragmentos de 35 e 10 pares de base, e um pico único de produto no tamanho projetado de 107 pares de base para a amostra positiva.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar e operar o chip microfluídico para detectar o vírus da influenza A.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um chip termoplástico microfluídico integrado projetado para diagnósticos moleculares, especificamente para a detecção do vírus da gripe A. O chip facilita a extração de ácidos nucleicos, transcrição reversa e amplificação por PCR em um processo simplificado.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Diagnóstico molecular
- Virologia
Contexto
- Dispositivos microfluídicos têm o potencial de revolucionar processos diagnósticos.
- A extração e amplificação eficientes de ácidos nucleicos são cruciais para a detecção precisa de vírus.
- A integração de múltiplas etapas em um único chip aumenta a usabilidade e reduz os riscos de contaminação.
- Essa tecnologia permite o uso de amostras brutas de pacientes, simplificando o fluxo de trabalho.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um chip microfluídico que integre extração, purificação, transcrição reversa e amplificação de ácidos nucleicos.
- Demonstrar a eficácia do chip na detecção do vírus da influenza A.
- Fornecer uma metodologia detalhada para a fabricação e operação do chip.
Métodos Utilizados
- Lise da amostra com um tampão para extrair o RNA do vírus.
- Carregamento dos reagentes de PCR de transcrição reversa (R-T-P-C-R) com o RNA extraído.
- Execução do canal de transcrição reversa para converter o RNA viral em cDNA.
- Amplificação do DNA no canal de PCR e análise dos resultados por eletroforese capilar.
Resultados Principais
- O chip detecta com sucesso o vírus da influenza A em amostras brutas de pacientes.
- Os resultados indicam o tamanho e a concentração do amplicon com base nos sinais de fluorescência.
- A abordagem integrada reduz a necessidade de múltiplos procedimentos separados.
- A análise de fluorescência confirma a eficácia do processo de amplificação.
Conclusões
- O chip microfluídico representa um avanço significativo nos diagnósticos moleculares.
- Ele simplifica o processo de detecção do vírus da influenza A.
- Essa tecnologia poderá ser adaptada para outros patógenos virais no futuro.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os diagnósticos microfluídicos integrados simplificam a detecção de doenças infecciosas ao consolidar a extração, amplificação e análise de ácidos nucleicos em uma única plataforma. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva e a eficiência operacional na interface crítica entre a aquisição da amostra e a leitura molecular. A tecnologia permite uma implantação rápida e escalável para vigilância de patógenos em toda a carteira e validação de alvos em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de amostras clínicas quanto à presença de patógenos e assinaturas de ácidos nucleicos.
- Contribui para a redução de riscos biológicos ao integrar lise, purificação e amplificação em um sistema fechado.
- Facilita testes rápidos de hipóteses para alvos de doenças infecciosas utilizando material derivado de pacientes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara amostras de ácidos nucleicos validadas para ensaios moleculares e fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Padroniza o processamento de amostras para melhorar a reprodutibilidade e a consistência dos resultados quantitativos.
- Permite o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento ao reduzir a intervenção manual e o risco de contaminação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados diagnósticos com estratégias translacionais de biomarcadores para programas de doenças infecciosas.
- Garante continuidade desde a aquisição de amostras clínicas até a validação em modelos pré-clínicos.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo dados moleculares quantitativos e robustos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma microfluídica conecta a descoberta inicial e a pesquisa translacional ao permitir a análise direta e quantitativa de amostras de pacientes para ácidos nucleicos virais.
- Biologia de Descoberta: Integra a detecção de patógenos orientada por hipóteses com desvio mecanicista de riscos em um único fluxo de trabalho.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas e reprodutíveis de ácidos nucleicos adequadas para padronização de ensaios.
- Análises: Oferece leituras baseadas em eletroforese capilar para dimensionamento preciso de amplicons e medição de concentração.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento das saídas diagnósticas com os requisitos clínicos de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a novos patógenos mediante modificação do desenho dos reagentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade nos fluxos de trabalho de detecção de patógenos.
- Valor Operacional: Otimiza os processos de amostra à resposta, minimizando o tempo de manipulação e o risco de erros.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguir ou interromper programas de doenças infecciosas e apoia a implantação em larga escala.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a diagnósticos e terapias para múltiplos patógenos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fabricação de microfluídica e otimização de ensaios moleculares.
- Exige acesso a sistemas de controle térmico, bombas de seringa e instrumentação de eletroforese capilar.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para a preparação de chips e protocolos analíticos.
- A adaptação a novos patógenos depende do redesenho e validação de reagentes.
- O rendimento e a escalabilidade são influenciados pela fabricação dos chips e pela integração de periféricos.
