Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

O objetivo geral deste procedimento é realizar imunohistoquímica em cortes de biópsia de pele humana para estudar alterações morfológicas das fibras nervosas intraepidérmicas associadas à neuropatia dolorosa por meio de imagem tridimensional. Isso é realizado primeiramente executando um protocolo de imunohistoquímica em cortes flutuantes de três dias em seções individuais de biópsia de pele humana. O segundo passo é imaginar cortes de pele com 50 mícrons de espessura utilizando um microscópio confocal.

Em seguida, os arquivos de imagens da visualização de fluxo são processados com o software MRS para criar um arquivo de filme tridimensional das imagens imunofluorescentes originais. O passo final é utilizar o software vdw ou similar para comprimir o arquivo de filme. Em última análise, os resultados de imagem tridimensional permitem a possibilidade de estudar alterações morfológicas associadas à neuropatia dolorosa.

Atualmente, a densidade intraoperatória de fibras nervosas epidérmicas é utilizada como método quantitativo para diagnosticar neuropatia. A marcação dupla dessas fibras nervosas intradérmicas com o biomarcador nociceptivo tem potencial para elucidar a dor associada a essa complicação. O protocolo atual de imagem bidimensional apresenta múltiplas limitações, incluindo a sobreposição de fibras nervosas.

Por outro lado, a imagem tridimensional oferece oportunidade para uma análise adicional das alterações morfológicas associadas à neuropatia, como inchaço e branqueamento axonal, bem como para as medições do volume axonal. É importante observar que devem ser tomadas medidas para obter imagens de qualidade capazes de gerar animações tridimensionais significativas, já que este método pode fornecer informações sobre a neuropatia dolorosa. Além disso, pode ser aplicado a outras amostras, como culturas espessas de órgãos ou culturas celulares tridimensionais, para examinar e medir alterações complexas na morfologia tridimensional.

Após fixar e seccionar biópsias de pele humana conforme descrito na parte escrita deste protocolo, rotule uma placa de 96 poços a ser usada para coloração conforme mostrado nesta imagem. Em seguida, adicione 150 microlitros de sinal ITFX à imagem em cada poço da linha um da placa de 96 poços rotulada e pipete 150 microlitros de um XPBS em todos os poços das linhas dois e três. Use um loop de inoculação para transferir uma seção de 50 milímetros retirada da biópsia da perna distal de um paciente para um dos poços contendo a imagem.

Em seguida, transfere uma seção de 50 milímetros retirada da região proximal da coxa do mesmo paciente para o próximo poço contendo image. Repete-se este procedimento com as seções da perna distal e da coxa proximal de mais três pacientes. Incuba-se as seções em, image, em um agitador horizontal durante 30 minutos, enquanto as seções de biópsia estão incubando em image, prepara-se uma solução bloqueadora a 5% e vorta-se a solução até que o BSA se dissolva completamente. Após decorridos os 30 minutos,

Transfira as seções para o PBS na linha dois e agite por 10 minutos, seguido por uma lavagem no PBS na linha três por 10 minutos. Novamente com agitação, pipete 150 microlitros de BSA 5%, uma solução bloqueadora, em cada poço da linha quatro e transfira as seções para esses poços. Incube as seções na solução bloqueadora de BSA 5% por uma a duas horas à temperatura ambiente em um agitador horizontal. Durante esta incubação, prepare uma solução de lavagem 1%, vortexando até que a BSA se dissolva completamente, e então dilua os anticorpos primários até a concentração necessária nesta solução.

Em seguida, adicione 150 microlitros de anticorpos primários diluídos nas cavidades da linha cinco da placa de 96 poços. Após o período de incubação, transfira as seções da solução bloqueadora para as cavidades apropriadas contendo os anticorpos primários. Em seguida, feche a placa com parafina e papel alumínio para evitar secagem e exposição à luz, e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador horizontal. No dia seguinte, adicione 150 microlitros de solução de lavagem contendo 1% de BSA em cada cavidade das linhas seis, sete e oito, e passe as seções por essas lavagens durante uma hora com agitação à temperatura ambiente, garantindo que a placa seja protegida da luz durante cada etapa de lavagem. Enquanto as seções estiverem incubando na última lavagem com solução de lavagem contendo 1% de BSA, dilua os anticorpos secundários na mesma solução de acordo com as instruções da parte escrita dos protocolos.

Após o tempo de incubação, adicione 150 microlitros de anticorpos secundários diluídos nos poços designados da linha nove da placa de 96 poços, transfira as seções para esses poços e cubra a placa com parafina e papel alumínio, incubando-a durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador horizontal. No dia seguinte, adicione 150 microlitros de solução de lavagem contendo 1% de BSA em cada poço das linhas 10, 11 e 12, e lave as seções nesta solução por uma hora cada, como anteriormente.

Enquanto os cortes de biópsia estão incubando na última lavagem com solução de lavagem de 1% de BSA, prepare lâminas de microscópio pipetando 50 microlitros de solução de lavagem de 1% de BSA em uma lâmina de cada vez. Remova o corte da última lavagem e coloque-o na gota de 50 microlitros de solução de lavagem de 1% de BSA sobre a lâmina de microscópio designada. Após otimizar a posição do corte, remova o excesso de solução de lavagem de 1% de BSA com uma pipeta de vidro com bexiga, tomando cuidado para não tocar a amostra.

Coloque uma gota de reagente de montagem antidesvanecimento prolongado dourado com DPI próximo à biópsia na lâmina de microscopia. Em seguida, pegue uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros e coloque-a suavemente sobre a biópsia e a gota do reagente de montagem. Remova quaisquer bolhas de ar usando a ponta de uma pipeta e remova o excesso de reagente prolongado dourado.

Reagente Antifa. Repita para cada seção e deixe as lâminas de microscopia secarem durante a noite à temperatura ambiente, no escuro, no dia seguinte. Visualize os sinais fluorescentes usando um microscópio confocal, um microscópio confocal de varredura a laser Olympus Flow View 500 com objetiva de imersão a óleo de 40x e ampliação de duas vezes, utilizando o software Flow View versão 5.0.

Utilize Alexa floor 4 88 e Alexa floor 6 47 para excitar o laser verde de hélio-neônio de 543 nanômetros e o laser vermelho de hélio-neônio de 633 nanômetros, respectivamente. Ajuste as aberturas confocais para cada detector em 400 microns para realçar os sinais. As varreduras sequenciais devem ser realizadas com uma resolução de 10 24 por 10 24.

Para maximizar a separação do sinal, capture séries tridimensionais em Z usando intervalos de passo Z de 1,2 µm com base na unidade de varredura ideal, calculada pelo software de visualização de fluxo com média de dois quadros de Kalman; primeiro, abra os arquivos de visualização de fluxo no software MRSX 64 ou similar. Para visualizar os conjuntos de imagens 3D, ajuste a exibição conforme necessário para realçar o contraste do sinal específico do nervo. Crie uma superfície para visualizar o limite dérmico-epidérmico.

Use a ferramenta de contorno no modo de desenho para traçar o limite. Atribua uma superfície semi-transparente ao limite para visualizar os sinais fluorescentes subjacentes e capture imagens fixas dos sinais fluorescentes tridimensionais. Para criar imagens instantâneas do filme 3D, use o recurso de animação para criar uma animação de conjunto de filme 3D, gerando filmes compostos por 200 quadros, animados a 15 quadros por segundo.

Salve cada filme como um arquivo A VI bruto e comprima o filme A VI final com o software VirtualDub ou similar. Este vídeo mostra imagens tridimensionais de fibras nervosas intraepidérmicas nociceptivas. Esta primeira imagem mostra fibras nervosas intraepidérmicas positivas para PGP marcadas em verde, representando o total de fibras nervosas intraepidérmicas, e também fibras nervosas intraepidérmicas positivas para a marcadas em vermelho, representando as fibras nervosas intraepidérmicas nociceptivas.

E, finalmente, a imagem revelada demonstra fibras nervosas intraepidérmicas nociceptivas positivas para PGP em uma amostra de pele do caso um, a barra de escala representa 20 micrômetros. O vídeo a seguir mostra imagens tridimensionais de dilatações axonais nas fibras nervosas intraepidérmicas de neuropatias dolorosas. Dilatações axonais indicadas por pontas de seta podem ser observadas ao longo das fibras nervosas intraepidérmicas marcadas pelo PGP com um sinal verde dentro do plexo subdérmico.

Em uma amostra de pele do caso dois, a barra de escala representa 10 mícrons. Esta imagem 3D mostra ramificação axonal em fibras nervosas intraepidérmicas de neuropatia dolorosa. A ramificação axonal indicada por cabeças de seta pode ser observada ao longo das fibras nervosas intraepidérmicas marcadas pelo PGP com um sinal verde em uma amostra de pele do caso três.

A barra de escala representa 20 mícrons. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro dias, com três horas e meia por dia para imunohistoquímica e 35 minutos por amostra para imagem confocal e animação tridimensional. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de transferir e montar corretamente os tecidos, tomando precauções para evitar rasgar ou danificar as amostras dos espécimes. Após este procedimento, outros métodos, como a análise tridimensional de tric, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.

Por exemplo, a ramificação das fibras nervosas abdominais desempenha um papel importante no desenvolvimento da neuropatia dolorosa?