Name: Um In vitro Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a isolar monócitos de sangue periférico humano e diferenciá-los em macrófagos polarizados usando centrifugação em gradiente de densidade e isolamento por beads negativos. Este modelo in vitro permite estudar a expressão de marcadores de polarização por PCR quantitativo.

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Agradecemos Nadine Wambsganss para uma excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) e em parte por uma doação do Fundo de Inovação FRONTIER (Universidade de Heidelberg) para CAG

1. Protocolo <ol><li> Prepara Amortecedores como se segue: <ol><li> Prepare tampão para isolamento PBMC: &quot;tampão de lavagem&quot; = 0,02% EDTA em PBS (0,5 M utilização EDTA). </li><li> Preparar tampão de isolamento de monócitos: &quot;MACS tampão de lavagem&quot; = 0,5% de BSA (250 mg) + EDTA a 2 mM (200 ul) + PBS (50 mL). Degas o buffer. </li><li> Preparar tampão de coloração de FACS e armazenamento das células: &quot;tampão FACS&quot; = 10% de FCS em PBS e &quot;tampão de fixação&quot; = 1% de PFA em PBS. </li></ol></li><li> Desenhar a 30 ml de sangue total a partir de uma veia do antebraço. Use EDTA como anticoagulante. </li><li> Isolar PBMC (histopaque) como se segue: <ol><li> Preparar dois tubos estéreis de 50 ml (sem poli-estireno). </li><li> Dilui-se o sangue a partir do passo 2 com PBS de 1:1. </li><li> Adicionar 25 ml histopaque + 25 ml de sangue total / PBS por tubo. Certifique-se de que histopaque e sangue não se misturam. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente, sem travão. </li><li> Aspirar plasma e descarte. </li><li> Aspirar interface de opaco e pipeta limpa 50 ml banheirae. </li><li> Adicionar 20 ml de EDTA 0,02% em PBS. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10 ml de EDTA 0,02% em PBS. </li></ol></li><li> Contar as células como se segue: <ol><li> Misturar bem com vórtex durante 10 seg. </li><li> Tomar 200 mL suspensão celular + 300 ml 0,02% EDTA em PBS + 500 mL de Trypan azul (200-500 células/10 praças, caso contrário alterar o fator de diluição). </li></ol></li><li> Realizar isolamento negativo de monócitos como se segue: <ol><li> Centrifugar as células obtidas no passo 3.10, durante 10 min, 120 x g. Elimine o sobrenadante. </li><li> Lavar 2x pellet celular por adição de 10 ml de PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g. </li><li> Adicionar 9 ml de água estéril por 3 segundos, adicionar 1 ml PBS 10X. </li><li> Lavar mais uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar 10 min, 120 x g. </li><li> Conte durante a centrifugação. </li><li> Diluir em tampão de EasySep a 5 x 10 7 / ml. </li><li> Adicionar 50 ul / ml galo enriquecimento de monócitoscauda. </li><li> Incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Contas de vórtice para 30 seg. </li><li> Adicionar 50 ul de pérolas / mL. </li><li> Incubar durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Encha com tampão EasySep para completar o volume de 2,5 ml. A solução agora aparece acastanhada. </li><li> Coloque em ímã. </li><li> Espere 2,5 min à TA. Durante este tempo, as células não monociticas ligados à esfera magnética irá mover-se para a parede do tubo e ficar lá. </li><li> Despeje buffer com monócitos não vinculativas em tubo estéril fresco. Esta solução parece esbranquiçada. </li><li> Lavar uma vez com PBS + 0,02% de EDTA e centrifugar durante 10 min, 120 x g. </li></ol></li><li> As células da placa em um prato de plástico ou multiparedes placa a uma densidade de 0,5 x 10 6 / cm 2. Adicionar 1 ml de meio de cultura / 1 x 10 6 células. </li><li> Células de cultura sob condições de juros para 6-14 dias. </li><li> Mudança de mídia depois de 3 dias pela substituição de 50% dos meios de comunicação com a mídia frescos (ver Tabela 1 para detalhes). </li><li>Depois de seis dias de colheita de células para isolamento do mRNA, citometria de fluxo, Western blotting, etc. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm de divulgar qualquer conflito de interesses.

Macrófagos derivados de monócitos representam o tipo do sistema imune inato de células chave. Eles desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, incluindo aterosclerose ou cancro 2. Assim, estudando a biologia dos macrófagos é essencial para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia de muitas doenças e para permitir o desenvolvimento de novas terapias. Muitos estudos aplicar modelos de rato com superexpressão ou falta certos genes de interesse. No cas...

Macrófagos derivados de monócitos representam um importante componente celular do sistema imune inato e contribuem para muitos processos inflamatórios agudos ou crónicos 1. Os macrófagos desempenham um papel importante em muitas doenças inflamatórias, como a aterosclerose ou cancro 2. Macrófagos apresentam um elevado grau de plasticidade e são capazes de assumir diferentes fenótipos micromilieu dependendo do local 3. Assim, estudar a diferenciação de macrófagos e heterogeneidade é essencial para aumentar o nosso conhecimento da fisiopatologia de muitas doenças e para permitir a identificação de novos alvos terapêuticos e desenvolvimento de novas terapias. Em muitos casos, os modelos de murino são utilizados para investigar a fisiopatologia de doenças específicas. No entanto, estudando a biologia dos macrófagos utilizando modelos de ratos é acompanhada por várias deficiências: (1) A proporção de número de subconjuntos de leucócitos (ou seja, monócitos e granulócitos), em peripHeral sangue de ratos ou de seres humanos varia de forma significativa, sugerindo diferentes papéis dos monócitos na fisiopatologia murino e humano. (2) Existem diferenças substanciais na expressão gênica entre murino e humano monócitos do sangue periférico, sugerindo diferenças substanciais na sua função durante a saúde ea doença 4. (3) um número de marcadores que são utilizados para identificar os monócitos e macrófagos de murino (F4/80, lyc, etc.) Não existe nas células mielóides humanas, fazendo a transferência dos resultados em modelos do rato para a situação humana bastante difícil. Assim, a fim de aumentar o nosso conhecimento de diferenciação de macrófagos e heterogeneidade nas doenças humanas, é preciso fazer uso de modelos de trabalho com os macrófagos humanos. Portanto, aqui descrevem um modelo de geração de macrófagos humanos primários, que é fácil de utilizar e permite o estudo dos macrófagos derivados de monócitos humanos in vitro sob várias condições que resultam em diferentes po macrófagotipos larização. Em vários estudos, utilizou-se o modelo in vitro de macrófagos derivados de monócitos humanos primários para analisar a biologia dos macrófagos e a sua relevância potencial para aterosclerose humana 5-7. Embora não substitui completamente as experiências com animais ou tecidos humanos, obtidos post-mortem, o modelo aqui descrito permite a identificação e a validação dos mecanismos da doença e alvos terapêuticos que podem ser altamente relevante para várias doenças humanas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml (estéril)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), líquido (sem cálcio ou magnésio)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanos</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>tubos FACS</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>humano M-CSF 10 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células 6-well</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in vitro</em&gt; modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e polarização

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Macrófagos derivados de monócitos representam um importante tipo de células do sistema imune inato. Modelos de rato estudar a biologia dos macrófagos sofrem das diferenças fenotípicas e funcionais entre os monócitos-macrófagos murinos e humanos. Portanto, estamos aqui descrever um modelo in vitro para gerar e estudar macrófagos humanos primários. Resumidamente, após a centrifugação do gradiente de densidade de sangue periférico retirados de uma veia do antebraço, os monócitos são isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico usando o isolamento esfera magnética negativa. Estes monócitos são então cultivadas durante seis dias sob condições específicas para diferentes tipos de induzir a diferenciação de macrófagos ou de polarização. O modelo é fácil de usar e evita os problemas causados ​​por diferenças entre espécies específicas de rato e de homem. Além disso, é mais próxima do que em condições in vivo, a utilização de linhas de células imortalizadas. Em conclusão, o modelo aqui descrito é adequado para estudar macrophage biologia, identificar mecanismos da doença e novos alvos terapêuticos. Embora não substitui completamente as experiências com animais ou tecidos humanos, obtidos post-mortem, o modelo aqui descrito permite a identificação e a validação dos mecanismos da doença e alvos terapêuticos que podem ser altamente relevante para várias doenças humanas.

Usando o protocolo acima descrito, que rotineiramente obter 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml de sangue (média ± erro padrão a partir de 26 experiências independentes, a Figura 1A). Pureza de monócitos, conforme determinado por coloração por citometria de fluxo para CD14 é habitualmente superior a 95% (97,1 ± 0,4%, média ± erro padrão de 3 experiências independentes, Figura 1B). A viabilidade das células de monócitos isolados de fresco, como determinado por...

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de usar<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para gerar essas células. Utilizando centrifugação de gradiente, o isolamento do grânulo negativo e condições de cultura de células específicas, os macrófagos derivados de monócitos pode ser gerado para estudos fenotípicas e funcionais.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar monócitos do sangue periférico humano e diferenciá-los em diferentes tipos de polarização de macrófagos. Isso é conseguido isolando primeiro as células mononucleares do sangue periférico humano por centrifugação por gradiente de densidade. Como segunda etapa, o isolamento negativo do grânulo é realizado para obter monócitos CD 14 positivos puros.Em seguida, os monócitos são cultivados sob condições específicas para induzir macrófagos especificamente polarizados. Em última análise, a expressão diferencial de marcadores de polarização de macrófagos em resposta às suas condições de cultura pode ser determinada por PCR quantitativo. Este método pode ajudar a dissecar a diferenciação de macrófagos em direção a diferentes tipos de polarização.Uma característica extremamente importante em doenças inflamatórias como a aterosclerose. Depois de extrair 30 mililitros de sangue total da veia do antebraço de um voluntário, divida o sangue igualmente em dois tubos cônicos de 50 mililitros sem poliestireno. Em seguida, dilua o sangue em cada tubo com 10 mililitros de PBS.Em seguida, adicione 25 mililitros de histo pack aos 25 mililitros de sangue total e PBS em cada tubo, tomando cuidado para que o histo pack e o sangue não se misturem. Em seguida, centrifugue os tubos por 30 minutos a 400 Gs e temperatura ambiente sem interrupção. Após a centrifugação, aspirar primeiro a camada de plasma e, em seguida, transferir a camada de interface opaca para um novo tubo de 50 mililitros.Lave as células da interface em 20 mililitros de PBS mais CDTA por cinco minutos a 250 Gs e quatro graus Celsius. Em seguida, depois de descartar o resus sobrenadante, suspenda o pellet em 10 mililitros de PBS mais CDTA e misture bem as células por vórtice por 10 segundos. Agora dilua 200 microlitros da suspensão celular em 300 microlitros de PBS mais EDTA e 500 microlitros de triam blue.Para atingir cerca de 200 a 500 células por 10 quadrados e um hemocitômetro, inicie o isolamento negativo girando as células três vezes por 10 minutos a 120 Gs Após a segunda lavagem, suspendemos o pellet em nove mililitros de água estéril por três segundos. Em seguida, adicione um mililitro de 10 XPBS depois de lavar e contar as células mais uma vez, dilua-as em um tampão fácil de endurecer em cinco vezes 10 das sete células por mililitro. Agora incube as células por 10 minutos a quatro graus Celsius em 50 microlitros por mililitro de coquetel de enriquecimento de monócitos.Durante o último minuto do vórtice de incubação, o enriquecimento de monócitos cept gira por 30 segundos. Em seguida, adicione 50 microlitros por mililitro das esferas às células e incube a conta em suspensão celular por mais cinco minutos. Após a segunda incubação, aumente o volume da solução celular para 2,5 mililitros.Com mais tampão eep, a solução agora parecerá uma cor acastanhada. Em seguida, coloque o tubo em um ímã eep por dois minutos e meio em temperatura ambiente. Depois que as células ligadas ao grânulo tiverem a chance de aderir, despeje o tampão contendo os monócitos não ligantes em um tubo estéril fresco.A solução agora terá uma cor esbranquiçada depois de lavar as células não ligadas uma vez com PBS mais EDTA, transferir as células para uma placa de vários poços e, em seguida, adicionar um mililitro de meio de cultura por um vezes 10 às seis células da placa de cultura. Finalmente, cultive as células nas condições experimentais de interesse por seis dias para induzir a diferenciação de macrófagos. Substitua metade da mídia após três dias por uma nova mídia após seis dias.Colha as células para a análise experimental desejada. Usando o protocolo descrito acima, cerca de 25 vezes 10 dos seis monócitos são rotineiramente obtidos a partir de 100 mililitros de pureza de monócitos no sangue, conforme determinado pela coloração por citometria de fluxo para CD 14, é rotineiramente maior que 95% quando adicionado pela primeira vez à cultura. Os monócitos são inicialmente redondos e flutuam em poucas horas.No entanto, eles aderem, dando-lhes uma aparência de ovo frito ou fuso após seis dias. Em cultura com MCSF sozinho ou com adição de LDL oxidado nas últimas 24 horas ou cerca de 80% das células não expostas ao LDL oxidado são viáveis, conforme determinado pelo iodeto de propídio. O tratamento de coloração com LDL oxidado, por outro lado, resulta em cerca de 70% de viabilidade celular após seis dias de cultivo.Com o fluxo de MCSF, a análise citométrica demonstra que, enquanto as células continuam expressando o marcador leucocitário CD 45 ro, elas regulam negativamente o marcador de monócitos CD 14. Dependendo das condições específicas que podem induzir a polarização de macrófagos durante a cultura de células, marcadores adicionais são necessários para garantir uma polarização bem-sucedida. Condições específicas podem induzir a polarização dos macrófagos.Por exemplo, macrófagos polarizados M1 expressam marcadores típicos como IL seis e TNF alfa, enquanto M dois macrófagos polarizados expressam CD 36 e CD 2 0 6, os macrófagos podem ser estudados em experimentos funcionais. Por exemplo, a captação de LDL oxidado pode ser estudada usando LDL marcado com fluorescência. Neste experimento, as células foram expostas a 10 microgramas por mililitro de LDL oxidado marcado com DII por quatro horas, e os núcleos foram corados novamente com dpi.O histograma demonstra a medição por citometria de fluxo da captação de LDL oxidada DII por macrófagos induzidos por MCSF com o histograma cinza sólido representando as células de controle não tratadas e o histograma aberto preto. Representando os macrófagos tratados com LDL oxidado após seu desenvolvimento. Essa técnica permite que os pesquisadores estudem a diferenciação e a heterogeneidade dos macrófagos humanos.Assim, permite que eles estudem doenças inflamatórias, como a aterosclerose, para identificar novos mecanismos de doenças e novos alvos terapêuticos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para induzir a diferenciação e polarização de monócitos derivados do sangue periférico em macrófagos M1 ou M2. A incubação com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, lipopolissacarídeo e interferon-gama produz macrófagos M1 pró-inflamatórios, enquanto a incubação com fator estimulador de colônias de macrófagos e interleucina-4 induz a produção de macrófagos M2 anti-inflamatórios.

Diferenciação e Polarização de Células Derivadas de Monócitos em Células Semelhantes a Macrófagos

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Este protocolo descreve a geração robusta de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e métodos para sua caracterização subseqüente. A expressão do marcador de superfície celular, a expressão genética e os ensaios funcionais são usados para avaliar o fenótipo e a função desses macrófagos derivados do iPSC.

Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo fornece um método para estudar a infecção por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos m1 ou M2 polarizados humanos baseados na diferenciação de monócitos periféricos-sanguíneos para células semelhantes a macrófagos que são infectados com a cepa virulenta H37Rv, e analisado com citometria de fluxo usando um painel de 10 cores, incluindo a expressão de marcadores M1/M2 selecionados.

Polarização de Células e Análises Derivadas de Monócitos Humanos M1 e M2 com Citometria de Fluxo sobre Infecção por Mycobacterium tuberculosis

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar o potencial imunomodulador das superfícies de implantes in vitro, visando melhorar a confiabilidade e reprodutibilidade dos protocolos atuais e promover novas pesquisas. Perfis de citocinas secretoras, expressão de mRNA e marcadores de superfície celular foram monitorados usando macrófagos derivados de monócitos sanguíneos para investigar a polarização de macrófagos cultivados em titânio.

Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes 

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aprenda a isolar monócitos de sangue periférico humano e diferenciá-los em macrófagos polarizados usando centrifugação em gradiente de densidade e isolamento por beads negativos. Este modelo in vitro permite estudar a expressão de marcadores de polarização por PCR quantitativo.

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