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O objetivo geral do experimento a seguir é isolar monócitos do sangue periférico humano e diferenciá-los em diferentes tipos de polarização de macrófagos. Isso é conseguido isolando primeiro as células mononucleares do sangue periférico humano por centrifugação por gradiente de densidade. Como segunda etapa, o isolamento negativo do grânulo é realizado para obter monócitos CD 14 positivos puros.

Em seguida, os monócitos são cultivados sob condições específicas para induzir macrófagos especificamente polarizados. Em última análise, a expressão diferencial de marcadores de polarização de macrófagos em resposta às suas condições de cultura pode ser determinada por PCR quantitativo. Este método pode ajudar a dissecar a diferenciação de macrófagos em direção a diferentes tipos de polarização.

Uma característica extremamente importante em doenças inflamatórias como a aterosclerose. Depois de extrair 30 mililitros de sangue total da veia do antebraço de um voluntário, divida o sangue igualmente em dois tubos cônicos de 50 mililitros sem poliestireno. Em seguida, dilua o sangue em cada tubo com 10 mililitros de PBS.

Em seguida, adicione 25 mililitros de histo pack aos 25 mililitros de sangue total e PBS em cada tubo, tomando cuidado para que o histo pack e o sangue não se misturem. Em seguida, centrifugue os tubos por 30 minutos a 400 Gs e temperatura ambiente sem interrupção. Após a centrifugação, aspirar primeiro a camada de plasma e, em seguida, transferir a camada de interface opaca para um novo tubo de 50 mililitros.

Lave as células da interface em 20 mililitros de PBS mais CDTA por cinco minutos a 250 Gs e quatro graus Celsius. Em seguida, depois de descartar o resus sobrenadante, suspenda o pellet em 10 mililitros de PBS mais CDTA e misture bem as células por vórtice por 10 segundos. Agora dilua 200 microlitros da suspensão celular em 300 microlitros de PBS mais EDTA e 500 microlitros de triam blue.

Para atingir cerca de 200 a 500 células por 10 quadrados e um hemocitômetro, inicie o isolamento negativo girando as células três vezes por 10 minutos a 120 Gs Após a segunda lavagem, suspendemos o pellet em nove mililitros de água estéril por três segundos. Em seguida, adicione um mililitro de 10 XPBS depois de lavar e contar as células mais uma vez, dilua-as em um tampão fácil de endurecer em cinco vezes 10 das sete células por mililitro. Agora incube as células por 10 minutos a quatro graus Celsius em 50 microlitros por mililitro de coquetel de enriquecimento de monócitos.

Durante o último minuto do vórtice de incubação, o enriquecimento de monócitos cept gira por 30 segundos. Em seguida, adicione 50 microlitros por mililitro das esferas às células e incube a conta em suspensão celular por mais cinco minutos. Após a segunda incubação, aumente o volume da solução celular para 2,5 mililitros.

Com mais tampão eep, a solução agora parecerá uma cor acastanhada. Em seguida, coloque o tubo em um ímã eep por dois minutos e meio em temperatura ambiente. Depois que as células ligadas ao grânulo tiverem a chance de aderir, despeje o tampão contendo os monócitos não ligantes em um tubo estéril fresco.

A solução agora terá uma cor esbranquiçada depois de lavar as células não ligadas uma vez com PBS mais EDTA, transferir as células para uma placa de vários poços e, em seguida, adicionar um mililitro de meio de cultura por um vezes 10 às seis células da placa de cultura. Finalmente, cultive as células nas condições experimentais de interesse por seis dias para induzir a diferenciação de macrófagos. Substitua metade da mídia após três dias por uma nova mídia após seis dias.

Colha as células para a análise experimental desejada. Usando o protocolo descrito acima, cerca de 25 vezes 10 dos seis monócitos são rotineiramente obtidos a partir de 100 mililitros de pureza de monócitos no sangue, conforme determinado pela coloração por citometria de fluxo para CD 14, é rotineiramente maior que 95% quando adicionado pela primeira vez à cultura. Os monócitos são inicialmente redondos e flutuam em poucas horas.

No entanto, eles aderem, dando-lhes uma aparência de ovo frito ou fuso após seis dias. Em cultura com MCSF sozinho ou com adição de LDL oxidado nas últimas 24 horas ou cerca de 80% das células não expostas ao LDL oxidado são viáveis, conforme determinado pelo iodeto de propídio. O tratamento de coloração com LDL oxidado, por outro lado, resulta em cerca de 70% de viabilidade celular após seis dias de cultivo.

Com o fluxo de MCSF, a análise citométrica demonstra que, enquanto as células continuam expressando o marcador leucocitário CD 45 ro, elas regulam negativamente o marcador de monócitos CD 14. Dependendo das condições específicas que podem induzir a polarização de macrófagos durante a cultura de células, marcadores adicionais são necessários para garantir uma polarização bem-sucedida. Condições específicas podem induzir a polarização dos macrófagos.

Por exemplo, macrófagos polarizados M1 expressam marcadores típicos como IL seis e TNF alfa, enquanto M dois macrófagos polarizados expressam CD 36 e CD 2 0 6, os macrófagos podem ser estudados em experimentos funcionais. Por exemplo, a captação de LDL oxidado pode ser estudada usando LDL marcado com fluorescência. Neste experimento, as células foram expostas a 10 microgramas por mililitro de LDL oxidado marcado com DII por quatro horas, e os núcleos foram corados novamente com dpi.

O histograma demonstra a medição por citometria de fluxo da captação de LDL oxidada DII por macrófagos induzidos por MCSF com o histograma cinza sólido representando as células de controle não tratadas e o histograma aberto preto. Representando os macrófagos tratados com LDL oxidado após seu desenvolvimento. Essa técnica permite que os pesquisadores estudem a diferenciação e a heterogeneidade dos macrófagos humanos.

Assim, permite que eles estudem doenças inflamatórias, como a aterosclerose, para identificar novos mecanismos de doenças e novos alvos terapêuticos.