Cistografia fotoacústica
11 de junho de 2013
Cystography fotoacústica (PAC) tem um grande potencial para mapear bexigas, um órgão interno sensível radiação em pacientes pediátricos, sem usar nenhum tipo de radiação ionizante ou de agente de contraste tóxico. Aqui vamos demonstrar o uso do PAC para o mapeamento de bexigas com uma injeção de traçadores óptica opacos em ratos In vivo.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a cistografia fotoacústica in vivo sem ionização, utilizando a absorção óptica no infravermelho próximo como traçadores ópticos não tóxicos e turvos. Isso é realizado primeiramente anestesiando o animal experimental. O segundo passo é preparar o animal para a imagem, removendo os pelos na região abdominal, posicionando o rato sobre um suporte para animais especialmente projetado, inserindo um cateter e aplicando gel de ultrassom na região de imagem.
As próximas imagens da região abdominal são obtidas utilizando um sistema de cistografia fotoacústica antes e após a injeção do agente de absorção óptica na bexiga. Em última análise, este processo permite a obtenção de imagens da bexiga de rato utilizando um sistema de cistografia fotoacústica não invasivo e livre de radiação ionizante, sem exposição à radiação e sem acúmulo prolongado de agentes pesados. A tomografia acústica tornou-se uma modalidade líder em imagem biomédica devido ao forte contraste de absorção óptica e à alta resolução espacial de ultrassom em tecidos biológicos. A principal vantagem da tomografia fotoacústica é que ela é totalmente isenta de radiação ionizante, o agente injetado não se acumula na bexiga e o método é rápido e custo-efetivo.
Para este procedimento, utilize um laser de neodímio dopado com itrio alúminio granada com chaveamento Q, cuja frequência foi dobrada para gerar luz em 532 nanômetros. A saída do laser é direcionada através de um oscilador óptico paramétrico ou OPO com faixa sintonizável de comprimento de onda de 680 a 2.500 nanômetros. Comece ajustando a duração do pulso do OPO para cinco nanossegundos por disparo do laser e configure a taxa de repetição em 10 hertz.
Em seguida, ajuste o comprimento de onda óptico para 667 nanômetros para uso com o agente de contraste azul de metileno. Esse comprimento de onda pode precisar ser modificado se for utilizado outro agente de contraste. Direcione a luz proveniente do OPO através de um prisma de ângulo reto até uma lente cônica esférica caseira.
A lente cônica é feita a partir de uma lente BK7 com diâmetro de 2,5 centímetros e ângulo cônico de 152 graus. Em seguida, redirecione o feixe de luz divergente com formato de rosca através de um condensador óptico com espessura de 2,5 centímetros, feito de acrílico transparente. Os diâmetros das superfícies superior e inferior são de 6,1 e 4,8 centímetros, respectivamente.
Certifique-se de que o padrão do feixe tenha a forma perfeita de um anel. Se o padrão do feixe em forma de rosca não for gerado corretamente, os sinais fotoacústicos provenientes da superfície da pele serão dominantes. Assim, será difícil obter imagens de tecidos profundos.
Em seguida, prepare um pequeno recipiente com água para melhorar o acoplamento acústico entre o animal e o laser. A abertura inferior é revestida com uma película fina e transparente de polietileno, que é opticamente e acusticamente transparente. Utilizando um pedaço de fita isolante preta, alinhe coaxialmente o feixe de luz em forma de linha com a zona focal de ultrassom.
Se esses não estiverem bem alinhados, o sistema sofrerá com baixa relação sinal-ruído. Em seguida, monte o transdutor de ultrassom focado esfericamente para detectar as ondas fotoacústicas. Para isso, utiliza-se um transdutor de imersão Olympus NDT V 3 0 8.
Ele coleta dados a cinco megahertz e possui resoluções transversal e axial de 590 e 144 micrômetros, respectivamente. Em seguida, conecte o transdutor a um pulso ultrassônico de banda larga ou receptor, que amplificará as ondas fotoacústicas, e conecte isso a um osciloscópio. Uma vez que o sistema tenha sido configurado, obtenha imagens unidimensionais com resolução temporal chamadas imagens ALINE medindo os tempos de chegada das ondas fotoacústicas pelo osciloscópio.
Em seguida, controle mecanicamente uma plataforma linear raster utilizando o LabVIEW para adquirir cortes B bidimensionais e imagens fotoacústicas tridimensionais. A aquisição de imagens tridimensionais leva aproximadamente 25 minutos por amostra, para um campo de tamanho 2,5 centímetros por 2,4 centímetros por 1,5 centímetro. Configure o programa LabVIEW para controlar a plataforma.
Adquira 125 amostras na direção X com um tamanho de passo de 0,2 milímetros, 60 amostras ao longo da direção Y com um tamanho de passo de 0,4 milímetros e 500 pontos de dados com uma taxa de amostragem de 50 megahertz ao longo da direção Z. Por fim, configure um sistema de software MathWorks MATLAB para adquirir, converter e processar os dados brutos em uma sequência de imagens bcan em corte transversal que representam os dados volumétricos. As imagens registradas são então exibidas como imagens de projeção de amplitude máxima em 2D.
Para preparar os ratos para imagem, anestesie uma rata Sprague Dawley com peso entre 200 e 250 gramas por injeção intraperitoneal de uma mistura de quetamina e xilazina. Em seguida, remova os pelos em um quadrado de cinco centímetros ao redor da região abdominal usando loção removedora de pelos. A seguir, posicione o rato sobre um suporte personalizado para animais.
Em seguida, prepare uma cânula de 22 gauge para inserção, revestindo-a com um lubrificante, e insira a extremidade distal da cânula horizontalmente na uretra até que o corpo da cânula alcance a abertura e a urina comece a escoar pela cânula. Por fim, posicione a rata de modo que fique sobre o suporte para o animal e abaixo do recipiente de água no sistema de cistografia fotoacústica. Para iniciar a aquisição de imagens, anestesie completamente a rata utilizando isoflurano vaporizado durante os experimentos de imagem fotoacústica in vivo.
Em seguida, aplique gel ultrassônico entre a superfície da pele do animal e a membrana plástica para melhorar o acoplamento acústico. Depois, execute o programa preparado no MathWorks Mat Lab para obter uma imagem fotoacústica tridimensional de controle antes da injeção dos agentes de contraste. Após a obtenção da imagem de controle, utilize uma seringa de um mililitro para introduzir uma solução aquosa de azul de metileno na bexiga por meio do cateter, após a injeção do azul de metileno.
Adquira uma série de imagens fotoacústicas in vivo a cada 12 horas até 48 horas após a injeção. Em seguida, sacrifique a rata mediante injeção de overdose de pentobarbital a 150 miligramas por quilograma. Então, remova a bexiga e o rim e coloque-os sobre uma placa de vidro.
A bexiga e o rim de um animal não injetado devem ser usados como controle para a imagem ex vivo. Posicione a placa de vidro abaixo do recipiente de água no sistema de cistografia fotoacústica e aplique gel ultrassônico entre os órgãos excisados e a membrana plástica para melhorar o acoplamento acústico durante a aquisição de imagem. A imagem mostrada aqui é uma varredura abdominal bidimensional XY de uma rata, obtida com luz laser de 667 nanômetros antes da injeção de azul de metileno.
Aqui, os vasos sanguíneos podem ser facilmente visualizados, pois o sangue absorve a luz para gerar um sinal fotoacústico, mas não há bexiga visível devido à ausência de agente de contraste. Quando a imagem é obtida 12 horas após a injeção do agente de contraste azul de metileno, a bexiga torna-se facilmente visível com amplitude muito forte em toda a sua extensão. Ao ser medida novamente após 24 e 48 horas, o agente de contraste já saiu do organismo e não é mais visível; ao mudar o comprimento de onda óptico para 850 nanômetros com o oscilador óptico paramétrico, o agente de contraste azul de metileno não absorve mais a energia e torna-se invisível.
Isso faz com que a bexiga desapareça efetivamente e atua como outro controle negativo para o sistema. Imagens resolvidas em profundidade obtidas a partir do plano Z ao longo das linhas tracejadas mostradas aqui fornecem dados adicionais de profundidade ao longo de áreas de interesse, conforme mostrado aqui, ou podem ser realizadas para a imagem inteira a fim de descrever a área em três dimensões. Neste vídeo, demonstramos a viabilidade fisiológica de um processo não invasivo e não ionizante para imagem da bexiga in vivo chamado fotoacústica.
Utilizando nosso sistema de imagem fotoacústica, obtivemos com sucesso imagens da bexiga esquerda preenchida com uma injeção de traçador com efeito óptico no chumbo no futuro. Esta técnica também pode ser aplicada no monitoramento de problemas urológicos, como refluxo bisco em pacientes pediátricos, com baixa dose de radiação. A portabilidade e a natureza econômica deste procedimento são ideais para este tipo de aplicação.
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Visão Geral
Este estudo demonstra o uso da cistografia fotoacústica (PAC) para mapear bexigas urinárias em ratos, utilizando radiação não ionizante e traçadores ópticos não tóxicos. O método tem como objetivo fornecer uma alternativa segura de imagem para pacientes pediátricos, evitando radiação ionizante e agentes de contraste tóxicos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imagem biomédica
- Tecnologia fotoacústica
- Procedimentos não invasivos
Contexto
- A cistografia fotoacústica é uma técnica de imagem nova.
- É particularmente benéfica para populações sensíveis à radiação, como crianças.
- O método utiliza traçadores opacos à luz para o mapeamento da bexiga.
- Evita o uso de radiação ionizante e agentes tóxicos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a cistografia fotoacústica não ionizante in vivo.
- Avaliar a eficácia da absorção óptica como traçadores.
- Fornecer um método de imagem seguro para bexigas urinárias em ratos.
Métodos Utilizados
- Anestesia do animal experimental.
- Preparação do local de imagem mediante remoção dos pelos abdominais.
- Posicionamento da rata e inserção de um cateter.
- Aplicação de gel ultrassônico e aquisição de imagens com um sistema PAC.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida da bexiga de rato utilizando PAC.
- Sem exposição à radiação ou acúmulo de agentes a longo prazo.
- Alta resolução espacial e forte contraste de absorção óptica alcançados.
- Processo de imagem rápido e economicamente eficaz demonstrado.
Conclusões
- A cistografia fotoacústica é uma modalidade de imagem promissora.
- Ela fornece uma alternativa não invasiva e segura para o mapeamento da bexiga.
- A técnica pode ser benéfica para pacientes pediátricos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A cistografia fotoacústica (PAC) oferece uma alternativa de imagem não invasiva e sem ionização para a visualização da bexiga urinária, atendendo a uma necessidade clínica não atendida na urologia pediátrica, onde a exposição à radiação proveniente da cistografia convencional representa um risco carcinogênico significativo. Ao utilizar traçadores ópticos biocompatíveis, como azul de metileno, nanoestruturas de ouro ou nanotubos de carbono, a PAC permite a aquisição de imagens em tecidos profundos além de 1 cm, com energias a laser bem abaixo dos limites de segurança, apoiando a desvinculação mecanicista de riscos em etapas pré-clínicas de validação de alvos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos de doenças ao proporcionar monitoramento longitudinal repetível da fisiologia e patologia da bexiga, sem exposição à radiação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à função e patologia da bexiga sem interferências de radiação ionizante.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio do monitoramento longitudinal e não destrutivo da excreção de traçadores e da dinâmica da bexiga in vivo.
- Valor Preditivo: Facilita a desmistificação mecanicista ao validar a eliminação do agente de contraste por meio da micção natural, reduzindo preocupações sobre acúmulo tóxico a longo prazo em modelos pré-clínicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream ao estabelecer leituras fotoacústicas quantitativas e reprodutíveis associadas à concentração do traçador e ao estado de preenchimento da bexiga.
- Reprodutibilidade: Permite a padronização de protocolos de imagem por meio de controle do comprimento de onda do laser (por exemplo, 667 nm para azul de metileno), energia do pulso (<1 mJ/cm²) e configurações do transdutor (frequência central de 5 MHz).
- Saída Quantitativa: Gera amplitude fotoacústica e dados espectrais mensuráveis que permitem comparação entre condições, pontos temporais e tipos de traçadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela refluxo vesicoureteral e outros distúrbios urológicos pediátricos ao permitir a imagem não invasiva da bexiga durante períodos de 48 horas após a administração do traçador.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao demonstrar a cinética de excreção do traçador, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco com base em perfis de biocompatibilidade e de eliminação.
- Alinhamento de Biomarcadores: Oferece uma plataforma para avaliar a biodistribuição e retenção do traçador como potenciais biomarcadores translacionais da função renal ou da bexiga.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O PAC insere-se no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para alvos urológicos nos quais a fisiologia da bexiga é um indicador-chave, permitindo avaliação longitudinal não invasiva sem carga cumulativa de radiação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a visualização de alterações estruturais e funcionais na bexiga em resposta a intervenções farmacológicas ou genéticas.
- Triagem: Oferece imagens prontas para ensaios, reprodutíveis, com alta resolução espacial (590 µm transversal, 144 µm axial) e forte contraste de absorção óptica para avaliação confiável de compostos ou traçadores.
- Análises: Gera dados com resolução temporal, resolução de profundidade e dados volumétricos (por meio de varreduras B e reconstrução 3D), permitindo comparação quantitativa do preenchimento da bexiga, retenção e dinâmica de eliminação de traçadores.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao comprovar que traçadores ópticos são naturalmente excretados pela urina, apoiando o perfil de segurança para estudos habilitantes de IND.
- Reutilização Corporativa: Representa uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável em múltiplos estudos e sistemas modelo devido à sua natureza não ionizante, baixo custo operacional e compatibilidade com diversos traçadores que absorvem na região do infravermelho próximo (NIR).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em estudos direcionados à bexiga por meio de imagem repetível e livre de radiação.
- Valor Operacional: Garante padronização e escalabilidade por meio de parâmetros de laser definidos, especificações do transdutor e protocolos de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao permitir a detecção precoce de retenção extratarget do traçador ou toxicidade na bexiga, sem exposição à radiação ionizante.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados de depuração e biodistribuição que orientam decisões de avanço nos processos de desenvolvimento de medicamentos urológicos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em imagem fotoacústica, segurança com laser e procedimentos cirúrgicos em pequenos animais, incluindo cateterização e anestesia.
- Requer fonte de laser sintonizável (OPO), transdutor de ultrassom esfericamente focado (5 MHz), sistema de aquisição de dados (osciloscópio, LabVIEW) e pipeline de processamento baseado em MATLAB.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de imagem (comprimento de onda, energia do pulso, tamanho do passo) e protocolos de preparação de traçadores nas equipes de descoberta e pré-clínicas.
- Envolve considerações de adaptação ao trocar traçadores (por exemplo, azul de metileno por nanoestruturas de ouro), exigindo reotimização do comprimento de onda e validação do acoplamento acústico.
- Limitado pela profundidade de penetração (>1 cm demonstrado) e pela dependência das propriedades de absorção óptica do traçador nos comprimentos de onda selecionados.
