Name: PRP como uma nova abordagem para prevenir a infecção: Preparação e In vitro Propriedades antimicrobianas do PRP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a preparar plasma rico em plaquetas e avaliar suas propriedades antimicrobianas in vitro contra bactérias como MRSA. Este método padronizado reduz unidades formadoras de colônia e oferece nova abordagem para prevenir infecções associadas a implantes.

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Os autores agradecem Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, e Suzanne Smith para assistência experimental e Suzanne Smith para revisão. Os autores também agradecer a John Thomas, PhD pela prestação dos isolados bacterianos clínicos e John B. Barnett, PhD por seu apoio e do uso do laboratório de segurança biológica no Departamento de Microbiologia, Imunologia e Biologia Celular da Universidade de West Virginia. Os autores reconhecem o apoio financeiro da osteossíntese e Trauma Care Foundation e National Science Foundation (# 1003907). Experimentos de microscopia e análise de imagem também foram realizadas na Universidade de West Virginia Facilidade Imaging, que é apoiado em parte pela Babb Mary Randolph Cancer Center e concessão de NIH P20 RR016440. O uso de animais de sangue desenha foram aprovados pela Universidade de West Virginia Animal Care Institucional e Comitê de uso. Todos os experimentos foram executados em conformidade com todas as Guidelin relevantees, regulamentos e agências reguladoras.

1. Preparação e ativação do PRP 1,1 coleta de sangue <ol><li> Anestesiar coelho por inalação de isoflurano (2% em O 2 para a indução e 1% para manutenção). </li><li> Desenhar 2 ml 0,129 M citrato de tri-sódio (uma solução anticoagulent) para uma seringa de 20 ml. A solução de citrato de tri-sódio é preparada por dissolução de 1,897 g de citrato de tri-sódio em 50 ml de H2O destilada e de filtragem com um filtro de 0,22 ^ M estéril. </li><li> Esterilizar a orelha de coelho utilizando etanol a 70%. </li><li> A obtenção de sangue (por exemplo, 5 ml) a partir da veia da orelha de coelho através de uma agulha de borboleta (25 G) ligada à seringa. </li><li> Misturar o sangue com a solução de citrato de tri-sódio, por agitação suave. A proporção de volume de sangue e de tri-sódio de solução de citrato é de 9:1. </li></ol> 1,2 preparação PRP (Figura 1) <ol><li> Transferir o sangue anticoagulado a um tubo de centrífuga de 50 ml em plástico. Tomar uma aliquota de 10 ulde sangue para determinar a contagem de plaquetas de base usando hemocytometry. </li><li> Centrifuga-se o sangue a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (TA) numa centrífuga com rotor swing-out. Definir a velocidade de aceleração e de travagem para baixo (Figura 1). </li><li> Após a centrifugação, o sangue é separado em três camadas. A camada inferior é de glóbulos vermelhos, principalmente, a camada média (geralmente referido como o &quot;buffy coat&quot;) é composta por concentrado de plaquetas e leucócitos, e a camada superior é, principalmente, o plasma, o qual é o componente líquido do sangue e plaquetas ( Figura 1). Cuidadosamente transportar o tubo de centrífuga de um capuz de cultura de células, não perturbar as camadas. Transferir todo o plasma, buffy coat, e 2-3 mm de espessura da camada de células vermelhas do sangue para um tubo de plástico de 15 ml usando uma pipeta de plástico de 1 ml. </li><li> Centrifugar a amostra transferida uma segunda vez a 3000 xg durante 15 min à TA. A camada superior (sobrenadante) é considerado plasma pobre em plaquetas (PPP) ad é transferida para um novo tubo. </li><li> Obter PRP, ajustando a concentração de plaquetas na amostra de sangue restante utilizando PPP para se obter 2,0 x 10 6 plaquetas / ul (determinado por hemocytometry). </li></ol> 1,3 ativação PRP <ol><li> Preparar PRP solução de activação através da dissolução de 5,000 UI de trombina bovina, com 5 ml de cloreto de cálcio a 10% para a concentração de trabalho de 1000 IU / ml. </li><li> Adicionar a solução de activação para PRP e PPP, e misturar a solução por pipetagens repetidas para formar PRP e PPP-gels. A proporção em volume da solução de activação de PRP ou de PPP é 1:4. </li></ol> 2. In vitro Teste Antimicrobiano de PRP Usando Kills Ensaio de curva (Figura 2) <ol><li> Usando um loop de inoculação estéril, adicionar várias colónias de S. aureus a partir de uma cultura da placa durante a noite em 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) num tubo de plástico. Vortex brevemente e então incubar a amostra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, A densidade óptica dos meios de bactérias foi determinada utilizando um espectrofotómetro e ajustadas para uma densidade óptica igual a ~ 1 x 10 8 UFC / ml com base na curva padrão pré-determinado. </li><li> Prepare uma diluição de 100 vezes usando PBS para se obter 1 x 10 6 CFU / ml e colocar os inóculos em gelo. </li><li> Configurar e rotular estéreis descartáveis ​​de 5 ml, os tubos de fundo redondo de poliestireno, e preparar os seguintes grupos de amostras como indicado na Tabela 1, para um volume final de 2 ml em cada tubo. </li><li> Adicionar PRP, PPP, ou PBS em primeiro lugar aos tubos de poliestireno, seguida da solução de trombina para a activação (formação do gel). Em seguida, adicione MHB e, em seguida, o S. inóculos aureus (1 x 10 6 CFU / ml) para se obter a concentração final de 1 x 10 5 CFU / ml. </li><li> Incubar os tubos a 37 ° C com agitação orbital a 150 rpm. </li><li> Em pontos de tempo pré-determinados (por exemplo, 0, 1 e 2 h), misturar as soluções de cada um dos tubos através de pipetagem de repetição (istopasso é importante uma vez que as bactérias podem ser presos no interior do gel PRP). Tomar 10 ul de amostra, dilua serialmente com solução salina estéril a 0,9%, e pipetar uma alíquota de 100 ul de cada diluição sobre um meio de ágar de soja tríptico (TSA, com sangue de ovelha a 5%) para a contagem de CFU placa. </li><li> Cultura das placas de agar durante a noite a 37 ° C, em seguida, contar e registar as colónias da placa. Os dados do gráfico em escala logarítmica, com o tempo (hr) no eixo x e CFU / ml no eixo y. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Plasma rico em plaquetas tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, devido às suas propriedades promotoras de cura 15-17. No presente estudo, o PRP foi apresentado como uma nova abordagem para a prevenção de infecção. PRP foi encontrado com fortes propriedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, Grupo A Streptococcus e Neisseria gonorrhoeae. As principais vantagens do PRP, em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos, para a prevenção de infecção incluem: (1...

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) é um dos microorganismos mais comuns isoladas de implante de infecções associadas. Ele é capaz de produzir um biofilme que cobre as superfícies dos implantes, podendo levar a resistente a antibióticos 1,2 a infecção. Tratamento de implante infecção associada freqüentemente requer hospitalização a longo prazo para desbridamentos repetidos e terapia parenteral prolongada de antibióticos. Em casos resistentes aos antibióticos, a remoção do implante pode ser necessária. A resistência crescente das bactérias aos antibióticos também foi referido pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) como &quot;um dos problemas de saúde do mundo mais prementes.&quot; Com o tempo, sem o desenvolvimento de novos e eficazes tratamentos antimicrobianos, é possível que vários fármacos patógenos resistentes será tratável com antibióticos convencionais. Prevenção de implante associadainfecção, é importante e novos agentes profiláticos ou abordagens são necessários para a prevenção de tais infecções. Plasma rico em plaquetas (PRP) é uma concentração de sangue autólogo que contém mais de 30 fatores de crescimento que podem ajudar com osso e enxerto ósseo cura 3-5. A aplicação de PRP para aumentar a regeneração óssea e maturação dos tecidos moles tem sido cada vez relatada em clínicas devido à sua elevada concentração de vários factores de crescimento libertados pelas plaquetas. Várias características do PRP indicam que o PRP pode também ter propriedades antimicrobianas 6-9. PRP contém um grande número de plaquetas, uma elevada concentração de leucócitos (os quais podem possuir hospedeiro-defesa acções contra bactérias e fungos), e vários peptídeos antimicrobianos 7,8,10. Em um estudo recente de um grande grupo de pacientes cirúrgicos cardíacos, foi revelado que o uso intra-operatório de gel de PRP durante encerramento de feridas signifvamente diminuiu a incidência de infecção do esterno superficial e profunda 11. Por estas razões e observações, a hipótese de que o PRP, além de suas bem estudadas cura propriedades promotoras, tem propriedades antimicrobianas. As vantagens potenciais da utilização de PRP para prevenir a infecção pode incluir: (i) O PRP é menos provável que induza a resistência em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos. (Ii) PRP também tem propriedades que promovem a cura e que podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecção; curando-promovendo PRP de propriedades podem proporcionar uma vedação para impedir a fixação bacteriana, reduzindo assim as probabilidades de infecção por agentes patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implante 12 , 13. (Iii) o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis. Nosso objetivo de longo prazo é usar o PRP como uma nova abordagem para evitar implante associada infections. O objectivo deste estudo foi o de preparar PRP utilizando uma abordagem de centrifugação, duas vezes, para examinar PRP de propriedades in vitro anti-microbianos, e para descrever os protocolos para a avaliação de tais propriedades antimicrobianas.

<table><tbody><tr><td>Trombina bovina</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>Trombina (origem bovina)</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05 Cloreto de</td><td>cálcio a 10%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Caldo Hinton Becton</td><td>, Dickinson and Company</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Ágar de soja tríptico</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Kendro Produtos</td><td>de laboratório 750043077</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

prp como uma nova abordagem para prevenir a infecção: preparação e<em&gt; in vitro</em&gt; propriedades antimicrobianas do prp

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implante infecção associada está a tornar-se cada vez mais difícil para a indústria de cuidados de saúde em todo o mundo, devido ao aumento de resistência a antibióticos, a transmissão de bactérias resistentes aos antibióticos entre animais e seres humanos, e os elevados custos de tratamento de infecções. No presente estudo, nós divulgamos uma nova estratégia que pode ser eficaz na prevenção de infecções associadas implante com base nas propriedades antimicrobianas potenciais de plasma rico em plaquetas (PRP). Devido às suas propriedades bem estudadas para promover a cura, PRP (um produto biológico) tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, incluindo cirurgias ortopédicas, cirurgias periodontais e oral, cirurgias maxilo-faciais, cirurgias plásticas, medicina esportiva, etc PRP poderia ser uma alternativa avançada para tratamentos com antibióticos convencionais na prevenção de infecções associadas implante. A utilização de PRP pode ser vantajosa em comparação com os tratamentos convencionais antibiótico since PRP é menos provável que induza a resistência aos antibióticos e antimicrobianos de PRP e curando-propriedades promotoras podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecções. É bem conhecido que organismos patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implantes, e as propriedades de cura de PRP de promoção pode melhorar a ligação de células humanas, reduzindo assim as probabilidades de infecção. Além disso, o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis. Para o nosso estudo, nós selecionamos várias clínicas estirpes de bactérias que são comumente encontrados em infecções ortopédicas e analisou se o PRP tem propriedades in vitro antimicrobianos contra estas bactérias. Nós preparamos PRP utilizando uma abordagem de centrifugação duas vezes o que permite que a mesma concentração de plaquetas a ser obtidos para todas as amostras. Nós conseguimos consistentes resultados antimicrobianos e descobriram que o PRP tem fortes propriedades in vitro antimicrobianos contra bactérias como methicillin sensíveis e resistentes à meticilina Staphylococcus aureus, Streptococcus do grupo A, e Neisseria gonorrhoeae. Portanto, a utilização de PRP pode ter o potencial para prevenir a infecção e para reduzir a necessidade de um tratamento pós-operatório de implante dispendioso infecções associadas.

PRP é reprodutivelmente preparados usando uma abordagem de centrifugação duas vezes (Figura 1). PRP é encontrado para apresentar forte (até 100 vezes a redução em UFCs) propriedades in vitro antimicrobianas contra resistente à meticilina S. aureus (MRSA) (Figura 3), que é vulgarmente encontrado em hospitais em todo o mundo 14. Da mesma forma, o PRP tem fortes propriedades antimicrobianas contra meticilina sensível S. aureus (MSSA), Stre...

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Este estudo descreve uma abordagem utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar as infecções associadas implante, apresenta o protocolo para a preparação de PRP com a concentração de plaquetas constante, e relata as propriedades antimicrobianas recentemente identificados de PRP e protocolos relacionados para examinar tais propriedades antimicrobianas<em&gt; In vitro.</em

PRP como uma nova abordagem para prevenir a infecção: Preparação e<em&gt; In vitro</em&gt; Propriedades antimicrobianas do PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar in vitro as propriedades antimicrobianas do plasma rico em plaquetas ou PRP. Primeiro, isole o plasma rico em plaquetas de um coelho doador. Em seguida, prepare um inóculo bacteriano, ative o PRP usando trombina e misture-o com o inóculo bacteriano.Incube a mistura, colete a amostra e meça as unidades formadoras de colônia resultantes. As propriedades antimicrobianas do PRP são demonstradas pela redução das UFC em amostras tratadas com PRP em comparação com as amostras controle. Sem o tratamento com PRP, o plasma rico em plaquetas tem menor probabilidade de induzir resistência ao BOL em comparação com os tratamentos convencionais de BOL.Ele também possui propriedades que promovem a cicatrização de feridas, o que pode ter um efeito sinérgico na prevenção de infecções. No protocolo atual, foi realizada uma abordagem de dupla concentração e a concentração de plaquetas do PRP foi padronizada em duas vezes 10 elevado a seis plaquetas por aproximadamente 10 vezes acima da linha de base no sangue, utilizando-se PRP enriquecido com leucócitos. Uma vez que os leucócitos também estão envolvidos na resposta imune bacteriana direta e específica a antígenos, o que pode contribuir para as propriedades antimicrobianas do PRP, anestesie primeiro um coelho por inalação de isoflurano.Retire dois mililitros de citrato de trissódio 0,129 molar em uma seringa de 20 mililitros. Estérilize a orelha do coelho utilizando etanol a 70%.Usando uma agulha de borboleta de 25 gauge. Colete sangue da veia da orelha do coelho e misture o sangue com a solução de citrato de trissódio por agitação suave. Transfira o sangue anticoagulado para um tubo plástico de centrífuga de 50 mililitros.Colete um Eloqua de 10 microlitros de sangue para determinar a contagem basal de plaquetas usando citometria hemática em um rotor oscilante. Ajuste a aceleração e a velocidade de frenagem para baixa e centrifugue o sangue a 300 Gs por 10 minutos. À temperatura ambiente, transporte cuidadosamente o tubo de centrífuga para uma câmara de cultura celular sem perturbar as camadas.Transfira todo o coágulo de plasma e uma camada de glóbulos vermelhos com espessura de dois a três milímetros para um tubo plástico de 15 mililitros. Centrifugue a amostra transferida a 3000 Gs durante 15 minutos. À temperatura ambiente, transfira o sobrenadante de plasma pobre em plaquetas para um novo tubo.Obtenha plasma rico em plaquetas ajustando a concentração de plaquetas na amostra de sangue restante com PPP para obter duas vezes 10 elevado a seis plaquetas por microlitro, conforme determinado por hemocitometria a partir de uma placa de ágar sangue estriada durante a noite de S reus. Inocule cinco colônias em cinco mililitros de caldo Mueller Hinton e vortex. Afrouxe a tampa e incube por duas horas a 37 graus Celsius.Leia a densidade óptica utilizando um espectrofotômetro. Ajuste o inóculo para uma densidade óptica com base na curva padrão predeterminada. Faça uma diluição de 100 vezes em PBS para obter um vezes 10 à sexta UFC por mililitro e coloque o inóculo no gelo.Prepare e rotule tubos descartáveis estéreis de poliestireno com fundo redondo de cinco mililitros. Para os grupos de amostras conforme indicado, adicione primeiro P-R-P-P-P-P ou PBS. Em seguida, adicione a solução de trombina para ativação.Em seguida, adicione caldo Mueller-Hinton, depois os inóculos de ESUs para obter uma concentração final de um vezes 10 à quinta UFCs por mililitro. Incube os tubos a 37 graus Celsius com agitação orbital a 150 RPM em pontos de tempo predeterminados. Misture as soluções em cada tubo para garantir que as bactérias não fiquem aprisionadas dentro do gel de PRP.Retire 10 microlitros de cada amostra. Dilua seriamente com solução salina estéril a 0,9% e pipete 100 microlitros de cada diluição em uma placa de ágar soja triptica. Para a contagem de UFC, incube as placas de ágar durante a noite a 37 graus Celsius.Em seguida, conte e registre as colônias da placa. Plote os dados em uma escala logarítmica com o tempo no eixo x e UFC por mililitro. No eixo Y, o plasma rico em plaquetas é preparado de forma reprodutível utilizando uma abordagem de dupla centrifugação.O PRP possui fortes propriedades antimicrobianas contra diversas bactérias, incluindo *Staphylococcus aureus* resistente e sensível à meticilina, estreptococos do grupo e *Neisseria gonorrhoeae* nos momentos de uma e duas horas. Bactérias MRSA são comumente encontradas em hospitais ao redor do mundo. Este ensaio de eliminação demonstra.O PRP apresenta fortes propriedades antimicrobianas in vitro contra MRSA nos pontos temporais de uma e duas horas. A análise quantitativa indica uma redução de até 100 vezes nas UFC obtida com o uso de PRP em comparação com os controles de PPP e PBS no tempo de uma hora. Esfregaços sanguíneos pontuais de PRP preparados a partir da abordagem com dupla centrifugação possuem cerca de 10 vezes o número de plaquetas em comparação com sangue total, desvantagem que facilita resultados consistentes e reprodutíveis.O número e a qualidade das plaquetas são os fatores-chave que influenciam o sucesso deste experimento. Após este procedimento, outras cepas bacterianas podem ser avaliadas e o PRP pode ser examinado in vivo também, a fim de explorar suas propriedades antimicrobianas em modelos de infecção animal após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de PRP explorarem o uso potencial do PRP na prevenção de infecções e na promoção da cicatrização de feridas em contextos animais e clínicos.

prp-as-new-approach-to-prevent-infection-preparation-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

Este artigo visa descrever as injeções de interfollicular autólogo rico em plaquetas plasma (0,20 mL x cm2) no couro cabeludo de 23 pacientes afetados por alopecia androgenética, a uma profundidade de 5 mm, usando uma arma de injetor médicas equipada com uma agulha de 30 calibre, em três sessões.

Injeções de PRP mecânico e controlada em pacientes afetados por alopecia androgenética

O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.

Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

Este protocolo tem como objetivo descrever como estudar a extensão da internalização do Staphylococcus aureus e sua capacidade de sobreviver dentro da célula hospedeira humana, bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos.

Ensaio de proteção de enzimas melhorada para estudar a internalização staphylococcus aureus e eficácia intracelular de compostos antimicrobianos

Apresentamos quatro métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas usando técnicas in vitro . Estes métodos podem ser adaptados para estudar as interações de diferentes nanopartículas e superfícies nanoestruturadas com uma ampla gama de espécies microbianas.

Avaliação da atividade antimicrobiana de nanopartículas e superfícies nanoestruturadas in vitro

O protocolo resume as melhores práticas para minimizar a carga biológica microbiana em um ambiente de sala limpa e inclui estratégias como monitoramento ambiental, monitoramento de processo e teste de esterilidade do produto. É relevante para instalações de fabricação e teste que são necessárias para atender aos padrões atuais de boas práticas de tecidos e aos padrões atuais de boas práticas de fabricação.

Estratégias de Controle e Monitoramento Microbiano para Ambientes de Salas Limpas e Terapias Celulares

Falta um método para avaliar áreas comumente usadas em ambientes de laboratório para contaminação por príons e descontaminação eficaz. O protocolo descrito aqui fornece os principais fundamentos para a implementação de um teste de segurança de príons em laboratório que pode ser facilmente modificado para atender às necessidades individuais de laboratórios específicos.

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Aprenda a preparar plasma rico em plaquetas e avaliar suas propriedades antimicrobianas in vitro contra bactérias como MRSA. Este método padronizado reduz unidades formadoras de colônia e oferece nova abordagem para prevenir infecções associadas a implantes.

PRP como uma nova abordagem para prevenir a infecção: Preparação e

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